JPWO2016098620A1 - 臓器構造体 - Google Patents

Abstract

腎臓と、尿管と、膀胱とを備える移植用臓器、及び、腎臓と、第１の尿管と、第１の膀胱と、第２の尿管と、第２の膀胱とが、この順に接続された臓器構造体は、尿を生成するだけでなく、生成した尿を排泄することが可能であるため有用である。

Description

本発明は、移植用臓器及び臓器構造体に関する。本願は、２０１４年１２月１９日に、日本に出願された特願２０１４−２５７９５７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

高齢化や適応疾患の拡大等により、人工透析患者は急速に増加している。透析医療によりこれらの患者を救命することは可能であるが、人工透析では全ての腎機能を代償できないため、患者の心血管疾患が増加し、致死率が上昇してしまう傾向にある。また、透析患者の時間的負担や精神的負担は非常に大きく、社会復帰が困難な場合も多い。

また、腎臓移植を必要とする末期腎不全の患者は世界に約２百万人存在しており、ドナー臓器の不足から、その数は更に増加する傾向にある。したがって、末期腎不全は医療上の重大な問題である。

このような背景のもと、近年の再生医学の発展により、幹細胞から尿生成能やエリスロポエチン産生能を有する腎臓を形成することができるようになりつつある（例えば非特許文献１、２を参照）。

Yokoo T., et al., Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues, PNAS, 102(9), 3296-3300, 2005. Yokoo T., et al., Generation of a transplantable erythropoietin-producer derived from human mesenchymal stem cells, Transplantation, 85(11), 1654-1658, 2008.

しかしながら、発明者らは、再生腎臓により尿を生成することができても、生成した尿を排泄することができずに水腎症を起こしてしまい、腎機能を長期間持続することができないことを見出した。

そこで、本発明は、尿を生成するだけでなく、生成した尿を排泄することが可能な移植用臓器を提供することを目的とする。本発明はまた、尿を生成するだけでなく、生成した尿を排泄することが可能な臓器構造体を提供することを目的とする。

本発明は以下の通りである。
（１）腎臓と、尿管と、膀胱とを備える移植用臓器。
（２）移植対象とは異なる種の動物由来である、（１）に記載の移植用臓器。
（３）前記動物が遺伝子改変非ヒト動物である、（２）に記載の移植用臓器。
（４）前記動物がブタである、（２）又は（３）に記載の移植用臓器。
（５）実質的にヒト細胞からなる、（１）〜（４）のいずれかに記載の移植用臓器。
（６）ヒトへの移植用である、（１）〜（５）のいずれかに記載の移植用臓器。
（７）ネコへの移植用である、（１）〜（５）のいずれかに記載の移植用臓器。
（８）腎臓と、第１の尿管と、第１の膀胱と、第２の尿管と、第２の膀胱とが、この順に接続された臓器構造体。
（９）前記腎臓、前記第１の尿管及び前記第１の膀胱が由来する動物が、前記第２の尿管及び前記第２の膀胱が由来する動物とは異なる種である、（８）に記載の臓器構造体。
（１０）前記腎臓、前記第１の尿管及び前記第１の膀胱が由来する動物が、遺伝子改変非ヒト動物である、（８）又は（９）に記載の臓器構造体。
（１１）前記腎臓、前記第１の尿管及び前記第１の膀胱が由来する動物が、ブタである、（８）〜（１０）のいずれかに記載の臓器構造体。
（１２）前記腎臓、前記第１の尿管及び前記第１の膀胱が、実質的にヒト細胞からなる、（８）〜（１１）のいずれかに記載の臓器構造体。
（１３）前記第２の尿管及び第２の膀胱が由来する動物が、ヒトである、（８）〜（１２）のいずれかに記載の臓器構造体。
（１４）前記第２の尿管及び第２の膀胱が由来する動物が、ネコである、（８）〜（１２）のいずれかに記載の臓器構造体。

本発明によれば、尿を生成するだけでなく、生成した尿を排泄することが可能な移植用臓器を提供することができる。また、尿を生成するだけでなく、生成した尿を排泄することが可能な臓器構造体を提供することができる。

臓器構造体の１実施形態を説明する図である。 胎生３０日目のクローンブタの胎仔の写真である。 摘出したブタ後腎の写真である。 後腎の大網への移植の様子を示す写真である。 Ａ〜Ｌは、ブタに移植した後腎の写真である。 実験例２におけるＭＮＢグループ（後腎−尿排泄腔（腎臓と、尿管と、膀胱とを備える移植用臓器）を移植するグループ）１〜４の実験概要を説明する図である。 実験例２におけるＭＮグループ（後腎のみ移植するグループ）１〜４の実験概要を説明する図である。 実験例２におけるＭＮグループ及びＭＮＢグループの移植後腎のマッソントリクローム染色による組織学的解析結果を示す写真である。 実験例２における移植後腎病理所見の解析結果を示すグラフである。 実験例２における移植後腎病理所見の解析結果を示すグラフである。 実験例２における移植後腎病理所見の解析結果を示すグラフである。 実験例２における移植後腎病理所見の解析結果を示すグラフである。 実験例２における移植後腎の獲得腎機能の解析結果を示す写真である。 実験例２における移植後腎の獲得腎機能の解析結果を示すグラフである。 実験例２における移植後腎の獲得腎機能の解析結果を示すグラフである。 実験例２における移植後腎の獲得腎機能の解析結果を示すグラフである。 Ａ〜Ｉは、実験例２におけるＭＮＢグループの後腎の、尿管から膀胱移行部の連続切片のマッソントリクローム染色による組織学的解析結果を示す写真である。 Ａは、実験例３における造影ＣＴの結果を示す写真である。Ｂは、実験例３における洞部位の肉眼所見を示す写真である。 Ａ〜Ｄは、実験例３における尿管膀胱吻合部の組織学的解析結果を示す写真である。 実験例３におけるホストラットの血清、移植後腎から排泄されたＣＬ膀胱中の尿（ＣＬ）及びホストの膀胱内の尿（ＢＬ）における尿素窒素濃度を測定した結果である。 実験例３におけるホストラットの血清、移植後腎から排泄されたＣＬ膀胱中の尿（ＣＬ）及びホストの膀胱内の尿（ＢＬ）におけるクレアチニン濃度を測定した結果である。 Ａ及びＢは、実験例４の結果を示す写真である。Ｃ〜Ｆは、実験例５の結果を示す写真である。

例えば、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、発育中のラット胎仔の腎臓発生部位に注入することにより、胎仔内で腎臓系譜に分化誘導し、腎臓原器を作製することができる。この腎臓原器を血管迷入期直前に摘出し、例えば大網内に移植することにより、最終分化型の腎臓を作製することができる。なお、大網とは、胃の下側から下方へエプロンのように垂れ下がった腹膜である。腎臓原器の移植先は大網に限られず、例えば、膨大動脈であってもよく、その他の腹腔内のいずれかの部位であってもよい。

しかしながら、発明者らは、再生腎臓や異種後腎を生体に移植し成長させた場合において、尿を生成することができても、生成した尿を排泄することができずに水腎症を起こしてしまい、腎機能を長期間持続することができないことを見出した。

また、発明者らは、水腎症を防止するためには、尿管の蠕動運動を用いた持続的な尿のドレナージが必要であることを見出し、本発明を完成させた。

［移植用臓器］
１実施形態において、本発明は、腎臓と、尿管と、膀胱とを備える移植用臓器を提供する。なお、本明細書において、用語「腎臓」は、後腎等の腎臓原器を含むものとする。また、用語「膀胱」は、尿排泄腔等の膀胱原器を含むものとする。

後述するように、腎臓のみを移植しても水腎症化及び間質の線維化が進行してしまう。これに対し、腎臓と、尿管と、膀胱とを備える臓器を移植すれば、水腎症化及び間質の線維化を抑制することができる。

これは、上記移植用臓器の尿管が蠕動運動することによって、腎臓が生成した尿を膀胱に移動させることができるためであると考えられる。従来は、再生腎臓のみを移植することが検討されてきたが、再生腎臓と共に尿管及び膀胱を移植することにより、尿を生成し、更に生成した尿を排泄させることができる。

上記の移植用臓器は、移植対象とは異なる種の動物由来であってもよい。例えば、ブタ由来の移植用臓器をヒトやネコ等に移植することもできる。これは、移植可能な腎臓が不足している現状における選択肢の１つである。

なお、ネコは、ペットとして最も一般的な動物の１種であるが、慢性腎疾患の罹患率が非常に高い動物である。例えば、ネコの死因の約３０％が慢性腎不全であり、ネコの５０％以上が腎機能の低下が原因で死亡したり安楽死させられているという報告もある。このようなことから、腎疾患に罹患したネコの延命技術の１つとして、潜在的に腎臓移植の需要がある。

本実施形態において、移植用臓器は、移植対象とは異なる種の遺伝子改変非ヒト動物由来であってもよい。例えば、移植用臓器は、ヒトやネコに移植した場合の拒絶反応が低減された遺伝子改変ブタ由来であってもよい。ブタは臓器の大きさがヒト等への移植に適しており、遺伝子改変技術も確立されている。

本実施形態において、ヒトに移植する移植用臓器は、実質的にヒト細胞からなるものであることが好ましく、患者本人の細胞からなるものであることが最も好ましい。

ここで、「実質的に」とは、動物の体内を利用して移植用臓器が製造された場合等に、ヒト以外の細胞が混入することを排除しないという意味である。いいかえると、移植用臓器は、９０％以上がヒト細胞からなることが好ましく、９５％以上がヒト細胞からなることがより好ましく、９９％以上がヒト細胞からなることが特に好ましい。

ここで、移植用臓器の作製について説明する。例えば、哺乳動物由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）や、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞由来の腎臓幹細胞を妊娠哺乳動物宿主中の胎児又は妊娠哺乳動物の宿主から分離した胎児に移植して分化させることにより、移植用臓器を作製することができる。

この方法により、例えば、ヒト、愛玩動物、例えばサル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ（特に競馬ウマ）、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等への移植用臓器を作製することができる。

上記宿主としては、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ等の有蹄動物；マウス；トランスジェニック、ノックアウト、ノックイン等の遺伝子改変が施された上記の動物等が挙げられる。

間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞は、移植対象のレシピエント由来の間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞であることが好ましい。例えば、レシピエントがヒトである場合には、ヒト骨髄、脂肪組織、流血中又は臍帯血から分取された間葉系幹細胞等が挙げられる。レシピエント本人の骨髄、流血中又は臍帯血から分取される間葉系幹細胞であってもよい。分取法は、一般的な外科的医学手法によればよい。分取された細胞は、最適条件を選択し、好適には培養を２〜５細胞継代行う。また、間葉系幹細胞の形質転換を抑制しながら培養を継続する目的でＣａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製のヒト間葉系幹細胞専用培地キット等を用いて培養してもよい。

間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞には、所望により、アデノウイルス又はレトロウイルス等を用いて所望の遺伝子を導入してもよい。例えば、腎臓形成を補助する目的でグリア細胞由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ−ＧＤＮＦ）を発現するように遺伝子導入させてもよい。これは、腎臓が形成される直前の間葉組織はＧＤＮＦを発現するようになり、その受容体であるｃ−ｒｅｔを発現する尿管芽を引き込むことで腎臓発生の最初の重要なステップを完了させるからである。発明者らは、この形質転換により、注入幹細胞由来腎臓の形成率を５．０±４．２％から２９．８±９．２％に上昇させることを確認している。

以下、ラットの移植用臓器を作製する場合を例に説明する。上記の間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を妊娠哺乳動物宿主中の胎児に移植する。生体内の胎児に直接間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を移植することにより、子宮内で腎臓を形成させることができる。移植の手法としては、一般的な外科的医学手法が挙げられ、例えばエコー下にてマイクロピペット等を使い行うことができる。移植する細胞量は、例えば０．５〜１．０×１０^３個である。ブタなどの大型の妊娠哺乳動物の生体内の胚に、経子宮アプローチによって、直接間葉幹細胞を移植し、そのまま生体内で成長を続けさせ、移植用腎臓へと成長させることもできる。また、以下に示す「全胚培養」又は「器官培養」の工程を追加してもよい。

調製された間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞は、妊娠哺乳動物宿主（子宮）から分離した胎児に移植し、その後、全胚培養を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで移植用腎臓形成の初期段階を完了するまで胎児の体内で成熟させ、その後器官培養で更に培養してもよい。また、移植用腎臓をヒトを含む哺乳類の大網等に移植してもよい。

調製された間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞の胎児への移植の時期は、適宜調整することができる。ラットを使った実験では、胎生９〜１２日、例えば１０〜１２日、例えば１０〜１１．５日が好適であった。大型の哺乳動物のブタ等でも、同様のステージ胚が好適に利用できる。また、条件を選定することによって、上記の前後のステージの胚も使用可能である。重要なことは、少なくとも移植時期には、宿主の免疫系が未だ免疫寛容の段階であることである。

ホスト免疫系は全胚培養のこの段階では十分には成長していない。したがって、異種細胞に対して寛容性を有する。免疫無防備の異種ホストの内在的な成長系を用いて自己間葉系幹細胞から自己器官を生成する。

間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞の胎児への移植の部位を腎臓発生相当部位とすることにより、移植用臓器を好適に作製することができる。そのため、移植は、腎臓発生相当部位であることが確定できる時期に行うことが必要となるが、腎臓の芽細胞が発達開始する前の萌芽状態であることが好ましい。例えば、間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を後腎形成間葉に移植することにより、メサンジウム細胞、尿細管上皮細胞、糸球体上皮細胞に分化させることができ、間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を中間中胚葉に移植することにより、尿管芽由来の集合管及び尿管に分化させることができる。

ここで、全胚培養について説明する。全胚培養は、間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を妊娠哺乳動物宿主（子宮）から分離した胎児に移植する場合に行う。子宮を母体から分離し、そこから胎児を子宮壁、脱落膜、ライヘルト膜を含む外膜層から切り離したものを取り出して得た胎児に間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を移植し、これを培養瓶内等で培養することにより、全胚培養を行うことができる。

より具体的には、例えば、実体顕微鏡等を用いて、子宮を麻酔下母体より摘出する。胎生９〜１２日、例えば１０〜１２日、例えば１０〜１１．５日、例えば１１．５日のラット胚を、子宮壁、脱落膜、ライヘルト膜を含む外膜層から切り離す。更に、間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を注入できるように卵黄嚢及び羊膜を開くが、絨毛膜尿膜胎盤はそのままの形で残す。間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞の注入の成功が確認できた胚を、遠心分離したラット血清に培養培地（ブドウ糖、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン、及びアンフォテリシンＢ）３ｍＬを添加した培養瓶内等で培養する。

培養瓶は、例えば、インキュベーター（型番「ＲＫＩ１０−０３１０」、Ｉｋｅｍｏｔｏ社）等を用いて回転させる。培養時間は、例えば、１２時間〜６０時間、例えば２４時間〜４８時間、例えば４８時間であってもよい。一定培養時間後に、形態的・機能的に評価し、移植用腎臓の器官原器を確認する。器官原器を胎児より分離し、以下の器官培養を行ってもよい。

続いて、器官培養について説明する。上記器官原器をフィルター上に置き、その下の培養皿にＤＭＥＭ等の培地を加える。そして、該培養皿を５％ＣＯ_２インキュベーター中で培養する。培養時間は、例えば１２時間〜１６８時間、例えば１８時間〜７２時間、例えば２４時間〜４８時間、例えば２４時間であってもよい。例えば、約２４時間の時点で大網に移植してもよい。培養温度は、例えば２０〜４５℃、例えば２５〜４０℃、例えば３７℃であってもよい。

続いて、リレー培養について説明する。リレー培養とは、上記全胚培養を２時間〜６０時間行い、その後上記器官培養を１２時間〜１６８時間行うことをいう。更に、器官培養後に動物の大網等に移植してもよい。

器官の大きさは、宿主動物が本来有する器官に相同する。したがって、例えばヒトにおいて十分な機能を発揮させうる腎臓を形成するためには、宿主がヒトの臓器と近似の大きさを有する哺乳動物であることが好ましい。ただし、全く相同の大きさを持つ必要はなく、腎臓であれば全体の１０分の１の機能があれば十分透析を行うことができ、十分生命を維持できる。この理由から、最適な宿主はブタであり、ミニチュアブタの臓器の大きさで十分と判断される。なお、ブタの場合は上記の全胚培養が困難であるため、子宮内操作により胎仔の腎臓発生部位に間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を注入して移植用臓器を作製する。

以上のようにして作製した移植用臓器は、機能確認がされた後、宿主から切り離され、レシピエントに供与される。移植後の移植用臓器は、生体内成長を継続し、腎臓機能を発揮するクローン腎臓の形成が完成する。

ヒトを含む哺乳類の大網や膨大動脈等への移植用腎臓の移植は、通常の外科的処方等により行うことができる。例えば、鋭利な鑷子で移植する組織をつまみ、鑷子の先で大網の脂肪組織の表面にわずかに切り口を作りその中に組織を埋め込む方法等が挙げられる。また、内視鏡を利用して大網や膨大動脈等に移植することもできる。

形成された腎臓内には間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞由来の細胞と宿主動物由来の細胞が混在する。混在した宿主由来細胞は腎臓をレシピエントに移植した際に、免疫拒絶反応を引き起こす可能性がある。そこで、腎臓形成後、宿主由来細胞を徹底的に取り除く必要がある。

形成された腎臓に、宿主由来の抗原性物質が混入しないようにするためには、例えば、調節的にプログラム細胞死を誘導可能な宿主動物を作製し、この動物を宿主として腎臓を作製する方法等が挙げられる。この宿主動物胚の当該部位に間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を移植し、腎臓を作製した後、宿主細胞特異的に細胞死を誘導することにより、レシピエントに移植する前段階で宿主由来細胞を完全に取り除くことができる。

理論的には、例えば、患者本人の細胞から作製したｉＰＳ細胞等を分化させて間葉系幹細胞や腎臓幹細胞を調製し、上記の方法に適用することにより、患者本人の細胞に由来する再生腎臓を作製することができる。

［臓器構造体］
１実施形態において、本発明は、腎臓と、第１の尿管と、第１の膀胱と、第２の尿管と、第２の膀胱とが、この順に接続された臓器構造体を提供する。

図１は、本実施形態の臓器構造体を説明する図である。図１に示すように、腎臓１１０と、第１の尿管１２０と、第１の膀胱１３０とを備える移植用臓器を宿主に移植すると、インビボで成長し、尿を産生するようになる。ここで、図１及び後述する実験例で示すように、移植用臓器の膀胱１３０（第１の膀胱）と、ホスト（宿主）の膀胱１５０（第２の膀胱）につながったホストの尿管１４０（第２の尿管）とを接続すると、移植された腎臓１１０が生成した尿を、ホストの膀胱１５０まで移動させることができる。すなわち、本臓器構造体により、移植した再生腎臓が生成した尿を排泄させることができる。これは、第１の尿管１２０及び第２の尿管１４０の蠕動運動によるものと考えられる。

移植用臓器は、例えばホストの大網や膨大動脈に移植してもよく、例えばホストの脾臓（脾動脈の周辺）に移植してもよい。

本実施形態の臓器構造体において、腎臓、第１の尿管及び第１の膀胱は、上述した移植用臓器に対応する。腎臓、第１の尿管及び第１の膀胱（移植用臓器）が由来する動物は、第２の尿管及び第２の膀胱が由来する動物（ホスト、移植対象）とは異なる種であってもよい。例えば、ブタ由来の移植用臓器をヒトやネコ等に移植して臓器構造体を形成することもできる。これは、移植可能な腎臓が不足している現状における選択肢の１つである。

本実施形態の臓器構造体において、腎臓、第１の尿管及び第１の膀胱は、移植対象とは異なる種の遺伝子改変非ヒト動物由来であってもよい。例えば、腎臓、第１の尿管及び第１の膀胱は、ヒトやネコに移植した場合の拒絶反応が低減された遺伝子改変ブタ由来であってもよい。

本実施形態の臓器構造体において、腎臓、第１の尿管及び第１の膀胱は、実質的にヒト細胞からなるものであることが好ましく、患者本人の細胞からなるものであることが最も好ましい。ここで、「実質的に」とは、上述したものと同様の意味である。

腎臓、第１の尿管及び第１の膀胱は、例えば、遺伝子改変ブタの胎仔にヒトの幹細胞を注入することにより作製されたものであってもよい。また、第２の尿管及び第２の膀胱が由来する動物は、例えばヒトであってもよく、例えばネコであってもよい。

［治療方法］
１実施形態において、本発明は、腎臓、尿管及び膀胱を備える移植用臓器を患者又は患畜の体内に移植する工程（ａ）と、移植から所定期間後に上記移植用臓器の膀胱と、患者又は患畜の尿管とを接続する工程（ｂ）と、を備える、腎臓の移植方法を提供する。患者又は患畜としては、例えば、ヒト、ネコが挙げられる。

本実施形態の方法は、腎疾患の治療方法であるともいえる。移植用臓器としては上述したものを用いることができる。

上記工程（ａ）で移植した移植用臓器を所定期間放置することにより、移植用臓器が成長し、尿産生を開始する。所定期間は、移植用臓器が十分に成長し、かつ、水腎症を起こす前までの期間であればよい。所定期間は、患者又は患畜の症状等によって適宜調整すればよいが、例えば１〜１０週間であってよい。

続いて、移植から所定期間後に工程（ｂ）を実施する。工程（ｂ）において、移植用臓器の膀胱と、患者又は患畜の尿管とを接続する。ここで、患者又は患畜の尿管は、患者又は患畜の膀胱につながっている。

移植用臓器の膀胱と、患者又は患畜の膀胱とを患者又は患畜の尿管で接続することにより、移植用臓器が産生した尿を、患者又は患畜の膀胱へと排泄させることができる。より詳細には、移植用臓器の腎臓が産生した尿が、移植用臓器の尿管を通じて移植用臓器の膀胱まで排泄され、次いで、移植用臓器の膀胱から、患者又は患畜の尿管を通じて患者又は患畜の膀胱まで排泄される。

本実施形態の方法により、移植用臓器の腎臓が産生した尿を、患者又は患畜の膀胱へと排泄させることができる。

次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

［実験例１］
（ブタへの腎臓移植及び移植腎臓の解析）
体細胞クローン技術を用いてクローンブタを作製した。続いて、胎生３０日目のクローンブタの胎仔を摘出し、顕微鏡下でブタ後腎（以下「ＭＮ（ｍｅｔａｎｅｐｈｒｏｉ）」という場合がある。）を摘出した。図２Ａは、胎生３０日目のクローンブタの胎仔の写真である。図２Ｂは、摘出したブタ後腎の写真である。続いて、シンジェニックなブタの大網に、摘出した後腎を移植した。図２Ｃは移植の様子を示す写真である。後腎の大網への移植から３週間後、５週間後及び８週間後に、ブタをイソフルラン麻酔下でと殺し、移植した後腎を摘出して解析した。

図３Ａ〜Ｌは、移植した後腎の写真である。図３Ａ、Ｂに示すように、移植した後腎は良好に発育し、移植後３週間で長径５〜７ｍｍ程度に成長した。また、図３Ｃ、Ｄに示すように、マッソントリクローム染色による組織学的な解析から、糸球体や尿細管構造を形成していることが確認された。

また、図３Ｅ、Ｆに示すように、移植後５週間で後腎の長径が１０ｍｍを超え、尿管の発育及び尿管内における尿の貯留も確認された。また、ホストブタから移植後腎への血管の侵入も確認された。また、図３Ｇ、Ｈに示すように、組織学的には３週目と同様に、糸球体や尿細管などの腎組織構造が維持されていたが、間質の出血、うっ血が認められた。

また、図３Ｉに示すように、移植後８週間で更に後腎の発育が進み、長径は約４ｃｍにまで成長したが、肉眼的にも腎実質は薄く、水腎症化していた。また、図３Ｊに示すように、後腎尿管の拡張が認められた。また、図３Ｋに示すように、組織学的にも後腎皮質が薄くなっており、間質の線維化の進行が認められた。しかしながら、図３Ｌに示すように、移植後腎の尿管上皮は比較的保たれていた。

以上の結果から、クローンブタの後腎は巨大化させることができるが、後腎の発育継続のためには、後腎が産生する尿の排泄路の構築が必須であると考えられた。

［実験例２］
（ラットへの腎臓移植及び移植腎臓の解析）
図４Ａ及び図４Ｂは、実験概要を説明する図である。腎臓を移植するホストラットとしては、１０週齢のルイスラット（三協ラボサービス社又は日本クレア社）を用いた。

図４Ａに写真を示す、胎生１５日目のラット胎仔から摘出された膀胱付き後腎、すなわち、腎臓、尿管及び膀胱を備えた臓器（以下、「ＣＬ（Ｃｌｏａｃａ）」という場合がある。）を、図４Ａに示すようにグループ分けしたＭＮＢグループ１〜４のラットの傍大動脈領域に移植した。

また、図４Ｂに写真を示す、胎生１５日目の胎仔から摘出された膀胱及び後腎を、尿管を切断したうえで、図４Ｂに示すようにグループ分けしたＭＮグループ１〜４のラットの傍大動脈領域に移植した。

続いて、移植から１０日後（グループ１）、１４日後（グループ２）、２１日後（グループ３）、２８日後（グループ４）に、ＭＮＢグループ及びＭＮグループのラットをと殺し、移植した臓器を摘出して解析した。

図５、図６Ａ〜Ｄ及び図７Ａ〜Ｄは、解析結果を示す図である。図５は、ＭＮグループ及びＭＮＢグループの移植後腎のマッソントリクローム染色による組織学的解析結果を示す写真である。図中の黒線は４００μｍである。ＭＮグループでは、発育が進行するにつれて尿細管の拡張が認められた。また、移植後４週間における糸球体数が少なかった。

図６Ａ〜Ｄ及び図７Ａ〜Ｄは、移植片重量、尿細管の拡張の割合、線維化領域の割合、糸球体数、尿容量、クレアチニン量、尿素窒素量の測定結果を示すグラフ又は写真である。測定結果は、平均値±標準偏差で示した。統計学的解析は、ソフトウエア（商品名「ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５」、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて行った。２標本の平均値の差の優位性は、独立ｔ検定により決定した。３群以上を含む多重比較はＡＮＯＶＡにより解析した。

図６Ａに示すように、ＭＮＢグループ及びＭＮグループの移植片重量は、移植後２週間から３週間にかけて増加し、移植後３週間から４週間にかけてはやや頭打ちとなった。また、ＭＮＢグループ及びＭＮグループの間で発育重量に有意な差は認められなかった。

しかしながら、図６Ｂに示すように、ＭＮグループでは移植後３週間から尿細管の拡張を認めるようになり（Ｐ＜０．０５）、移植後４週目ではさら増悪が認められた（Ｐ＜０．０００５）。これに対し、ＭＮＢグループでは尿細管の拡張の進行が認められず、移植後４週間では、ＭＮグループはＭＮＢグループに比べて有意に尿細管が拡張しており（Ｐ＜０．０００１）、図６Ｃに示すように、間質の線維化も進行していた（Ｐ＜０．０００５）。なお、尿細管の拡張の割合及び間質の線維化の割合は、ソフトウエア（商品名「ＭｅｔａＶｕｅ」、モデキュラーデバイス社）を用いて定量した。

また、図６Ｄに示すように、移植後４週間での後腎の単位面積当たりの糸球体数は、ＭＮＢグループで有意に増加していた（Ｐ＜０．０５）。

また、図７Ａ、図７Ｂに示すように、ＭＮＢグループでは、移植後３週間から尿が後腎膀胱内に蓄積されるようになり、移植後４週間での膀胱内の蓄積尿量はＭＮグループに比べ有意に増加していた（Ｐ＜０．０５）。更に、図７Ｃに示すように、尿中のクレアチニン排泄量は、ＭＮＢグループで有意に増加しており（Ｐ＜０．０５）、図７Ｄに示すように、尿中の尿素窒素排泄量は、ＭＮＢグループで有意に増加していた（Ｐ＜０．０５）。

以上の結果から、膀胱付き後腎移植は、移植後腎の発育とともに起こる水腎症化及び間質の線維化をより抑制するという点で、後腎のみの移植より優れていることが示された。

図８Ａ〜Ｉは、ＭＮＢグループの後腎の、尿管から膀胱移行部の連続切片のマッソントリクローム染色による組織学的解析結果を示す写真である。図中、ＢＬはＣＬ膀胱を示し、ＵはＣＬ尿管を示し、Ｍは後腎を示す。この結果から、ＭＮＢグループの移植後腎の尿管から膀胱移行部は十分に発育していることが明らかとなった。

ＭＮＢグループとＭＮグループの移植後腎の発育の差は、尿管及び膀胱の機能によると考えられた。

［実験例３］
（ラットの尿排泄路の構築）
胎生１５日目のラット胎仔から、膀胱付き後腎、すなわち、腎臓、尿管及び膀胱を備えた臓器（ＣＬ）を摘出し、ラットの傍大動脈領域に移植した。続いて、移植４週間後にホストラットの左腎を摘出し、移植した後腎の膀胱（ＣＬ膀胱）とホストラットの左尿管を顕微鏡下に吻合する手術を行った。

手術後３〜４週間後に開腹し、ＣＬ膀胱と吻合したホスト尿管を切開したところ、発育した後腎から産生された尿がホスト尿管を通じて持続的に排泄されていることが確認された。

同様の処理を行った別のラットを用いた造影ＣＴ（コンピュータ断層撮影）により、尿の排泄を解析した。図９Ａは造影ＣＴの結果を示す写真である。図中、Ｍは移植後腎を示し、ＢＬはＣＬ膀胱を示す。造影ＣＴにより経静脈的尿路造影を行った結果、造影剤（オムニパーク、第一三共社）投与後１０分で移植後腎の膀胱（ＣＬ膀胱）内に造影剤の蓄積が確認された。また、時間経過とともに造影剤がホストの尿管からホストの膀胱へ排泄されることが確認された。

図９Ｂは、洞部位の肉眼所見を示す写真である。Ｍは移植後腎を示し、ＢＬはＣＬ膀胱を示し、Ｕはホスト尿管を示す。

図１０Ａ〜Ｄは、尿管膀胱吻合部の組織学的解析結果を示す写真である。図１０Ａ、Ｂに示すように、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を用いた尿管膀胱吻合部の組織学的検討では、尿管膀胱吻合部は充分開口していた。図中、Ｕはホスト尿管を示し、ＡＮは尿管膀胱吻合部を示し、ＢＬはＣＬ膀胱を示し、Ｔは縫合糸を示す。

また、図１０Ｃに示すように、ヤギ抗ＵＰＫＩＩＩポリクローナル抗体（ｓｃ−１５１８２、サンタクルーズバイオテクノロジー社）で尿路移行上皮細胞の免疫染色を行った結果、移行上皮同士で吻合できていることが確認された。以上の結果から、ホスト尿管と後腎膀胱（ＣＬ膀胱）が確実に吻合されていることが確認された。

また、図１０Ｄに示すように、と殺時には、後腎移植から７〜８週間が経過していたが、移植後腎では、糸球体、尿細管等の腎臓構造が保たれていた。図中、ＧＩは糸球体を示し、Ｔｕは尿細管を示す。

図１１Ａは、ホストラットの血清、移植後腎から排泄されたＣＬ膀胱中の尿（ＣＬ）及びホストの膀胱内の尿（ＢＬ）における尿素窒素濃度を測定した結果である。

また、図１１Ｂは、ホストラットの血清、移植後腎から排泄されたＣＬ膀胱中の尿（ＣＬ）及びホストの膀胱内の尿（ＢＬ）におけるクレアチニン濃度を測定した結果である。

その結果、ＣＬ膀胱中の尿は、ホストラットの血清中の尿素窒素濃度、クレアチニン濃度よりも濃縮されており、移植後腎は、ホストラットの血液をろ過して尿を産生するという腎臓の機能を有していることが明らかとなった。

以上の結果から、腎臓、尿管及び膀胱を備える移植用臓器の膀胱と、ホストの尿管とを接続する系（以下、「Ｓｔｅｐ−ｗｉｓｅ ｐｅｒｉｓｔａｌｉｃ ｕｒｅｔｅｒ（ＳＰＷＵ） ｓｙｓｔｅｍ」という場合がある。）を用いることにより、移植後腎が産生する尿を、ホスト尿管を通じて持続的にホスト膀胱内に排泄することができ、今まで困難であった再生腎臓の尿排泄路の構築が可能であることが示された。

［実験例４］
（ブタへの膀胱付き腎臓移植及び移植腎臓の解析）
胎生３０日目のブタ胎仔から、膀胱付き後腎、すなわち、腎臓、尿管及び膀胱を備えた臓器（ＣＬ）を摘出し、シンジェニックなブタの大網に移植した。図１２Ａに示すように、移植された膀胱付き後腎はラットの実験同様に順調に発育し、移植後３週間で尿を産生した。また、図１２Ｂに示すように、移植後５週間で更に巨大化した。ＣＬ膀胱内に蓄積した尿は、尿素窒素及びクレアチニンが濃縮されていることが確認された。

［実験例５］
（ブタの尿排泄路の構築）
クローンブタを用いてＳＰＷＵ ｓｙｓｔｅｍによる尿排泄路の構築を行った。胎生３０日目のブタ胎仔から、膀胱付き後腎、すなわち、腎臓、尿管及び膀胱を備えた臓器（ＣＬ）を摘出し、シンジェニックなブタの傍大動脈及び脾動脈周辺に移植した。

図１２Ｃに示すように、移植後４週間で、後腎は３ｃｍ弱に発育し、ＣＬ膀胱内に尿が蓄積していることが確認された。

続いて、図１２Ｄに示すように、ホストブタの左腎臓を摘出し、ＣＬ膀胱をホスト尿管と吻合した。吻合後、２週間でと殺し、尿管吻合の有無による後腎発育の差を検討した。

図１２Ｅは、ホスト尿管と吻合したＣＬの後腎の組織学的解析の結果を示す写真である。また、図１２Ｆは、尿管吻合を行わなかったＣＬの後腎の組織学的解析の結果を示す写真である。ホスト尿管と吻合したＣＬの後腎の方が、間質の出血や尿細管の拡張が少なく、尿細管構造が保たれていることが確認された。

以上の結果から、クローンブタを用いたＳＰＷＵ ｓｙｓｔｅｍによる尿排泄路の構築が、再生腎臓の巨大化及び尿排泄路の確保の点において有用であることが示された。

本発明によれば、尿を生成するだけでなく、生成した尿を排泄することが可能な移植用臓器を提供することができる。また、尿を生成するだけでなく、生成した尿を排泄することが可能な臓器構造体を提供することができる。

１１０…腎臓、１２０…第１の尿管、１３０…第１の膀胱、１４０…第２の尿管、１５０…第２の膀胱。

Claims (14)

1. 腎臓と、尿管と、膀胱とを備える移植用臓器。
2. 移植対象とは異なる種の動物由来である、請求項１に記載の移植用臓器。
3. 前記動物が遺伝子改変非ヒト動物である、請求項２に記載の移植用臓器。
4. 前記動物がブタである、請求項２又は３に記載の移植用臓器。
5. 実質的にヒト細胞からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の移植用臓器。
6. ヒトへの移植用である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の移植用臓器。
7. ネコへの移植用である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の移植用臓器。
8. 腎臓と、第１の尿管と、第１の膀胱と、第２の尿管と、第２の膀胱とが、この順に接続された臓器構造体。
9. 前記腎臓、前記第１の尿管及び前記第１の膀胱が由来する動物が、前記第２の尿管及び前記第２の膀胱が由来する動物とは異なる種である、請求項８に記載の臓器構造体。
10. 前記腎臓、前記第１の尿管及び前記第１の膀胱が由来する動物が、遺伝子改変非ヒト動物である、請求項８又は９に記載の臓器構造体。
11. 前記腎臓、前記第１の尿管及び前記第１の膀胱が由来する動物が、ブタである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の臓器構造体。
12. 前記腎臓、前記第１の尿管及び前記第１の膀胱が、実質的にヒト細胞からなる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の臓器構造体。
13. 前記第２の尿管及び第２の膀胱が由来する動物が、ヒトである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の臓器構造体。
14. 前記第２の尿管及び第２の膀胱が由来する動物が、ネコである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の臓器構造体。