JP2021045168A - 腎臓の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】腎臓前駆細胞から腎臓を作製する技術を提供する。【解決手段】非ヒト動物（但し、マウスを除く。）の後腎の後腎間葉を組織特異的に除去する工程（ｉ）と、前記後腎にヒト腎臓前駆細胞を移植する工程（ｉｉ）と、前記後腎の発生を進行させる工程であって、移植した前記ヒト腎臓前駆細胞が分化成熟し、腎臓の一部を形成する工程（ｉｉｉ）と、を備える、腎臓の製造方法。【選択図】図２

Description

本発明は、腎臓の製造方法に関する。より詳細には、腎臓の製造方法、腎臓、非ヒト動物、移植用臓器、腎臓製造用キット及び腎臓再生用医薬に関する。本願は、２０１６年６月２９日に、日本に出願された特願２０１６−１２９３９１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

高齢化や適応疾患の拡大等により、人工透析患者は急速に増加している。透析医療によりこれらの患者を救命することは可能であるが、人工透析では全ての腎機能を代償できないため、患者の心血管疾患が増加し、致死率が上昇してしまう傾向にある。また、透析患者の時間的負担や精神的負担は非常に大きく、社会復帰が困難な場合も多い。

また、腎臓移植を必要とする末期腎不全の患者は世界に約２百万人存在しており、ドナー臓器の不足から、その数は更に増加する傾向にある。したがって、末期腎不全は医療上の重大な問題である。

現在、ｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞等の多能性幹細胞から様々な組織特異的な前駆細胞又は組織幹細胞の誘導が可能となっている（例えば非特許文献１を参照）。しかしながら、例えば腎臓は、自己修復能が低い臓器であり、腎機能は多種類の細胞から構成される複雑な構造に依存している。このため、現在、腎臓前駆細胞から複雑な３次元構造を有する腎臓の再生には至っていない。

Takasato M, et al., Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney, Nat. Cell Biol., 16 (1), 118-126, 2014.

本発明は、腎臓前駆細胞から腎臓を作製する技術を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
（１）非ヒト動物の後腎の後腎間葉を組織特異的に除去する工程と、前記後腎にヒト腎臓前駆細胞を移植する工程と、前記後腎の発生を進行させる工程であって、移植した前記ヒト腎臓前駆細胞が分化成熟し、腎臓の一部を形成する工程と、を備える、腎臓の製造方法。
（２）前記後腎の尿管芽を組織特異的に除去する工程と、前記後腎にヒト腎臓前駆細胞を移植する工程と、を更に備える、（１）に記載の腎臓の製造方法。
（３）前記非ヒト動物がブタである、（１）又は（２）に記載の腎臓の製造方法。
（４）前記非ヒト動物がマウスである、（１）又は（２）に記載の腎臓の製造方法。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法により製造された、腎臓。
（６）非ヒト動物由来の細胞と、ヒト細胞とを含み、前記ヒト細胞の割合が７０質量％以上である、腎臓。
（７）（５）又は（６）に記載の腎臓を有する非ヒト動物。
（８）（５）又は（６）に記載の腎臓と、尿管と、膀胱とを備える移植用臓器。
（９）前記尿管及び前記膀胱が前記非ヒト動物由来である、（８）に記載の移植用臓器。
（１０）後腎の後腎間葉を組織特異的に除去することができる、遺伝子改変非ヒト動物。
（１１）更に、前記後腎の尿管芽を組織特異的に除去することができる、（１０）に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（１２）遺伝子改変ブタである、（１０）又は（１１）に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（１３）非ヒト動物の後腎と、前記後腎の後腎間葉を組織特異的に除去する薬剤と、ヒト腎臓前駆細胞とを備える、腎臓製造用キット。
（１４）前記後腎の尿管芽を組織特異的に除去する薬剤を更に備える、（１３）に記載の腎臓製造用キット。
（１５）非ヒト動物の後腎と、前記後腎の後腎間葉を組織特異的に除去する薬剤と、ヒト腎臓前駆細胞とを備える、腎臓再生用医薬。
（１６）前記後腎の尿管芽を組織特異的に除去する薬剤を更に備える、（１５）に記載の腎臓再生用医薬。

本発明によれば、腎臓前駆細胞から腎臓を作製する技術を提供することができる。

胎生１１日前後のマウスの胎仔を示す模式図である。 （ａ）〜（ｃ）は、腎臓が発生する様子を説明する模式図である。 実験例３における腎臓組織標本の免疫染色の結果を示す写真である。 実験例４における腎臓組織標本の免疫染色の結果を示す写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例５においてマウスの体内で再生した腎臓を撮影した写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例５においてマウスの体内で再生した腎臓の組織切片標本の顕微鏡写真である。 （ａ）〜（ｃ）は、実験例６における後腎の組織標本の免疫染色の結果を示す写真である。

［腎臓の製造方法］
図１は、胎生１１日前後のマウスの胎仔を示す模式図である。腎臓は前腎、中腎、後腎の３段階を経て形成される。このうち、前腎及び中腎は後に退行変性する。哺乳類成体において機能する腎臓は後腎である。

図１に示すように、腎臓は、尿管芽とその周囲の後腎間葉との相互作用によって形成される。尿管芽は集合管から尿管までを構成し、後腎間葉に含まれるネフロン前駆細胞は糸球体及び尿細管の起源となる。本明細書では、尿管芽及び後腎間葉を含む腎発生領域を腎発生ニッチという。

１実施形態において、本発明は、非ヒト動物の後腎の後腎間葉を組織特異的に除去する工程（ｉ）と、前記後腎にヒト腎臓前駆細胞を移植する工程（ｉｉ）と、前記後腎の発生を進行させる工程であって、移植した前記ヒト腎臓前駆細胞が分化成熟し、腎臓の一部を形成する工程（ｉｉｉ）と、を備える、腎臓の製造方法を提供する。

従来、腎発生ニッチへの細胞移植は非常に定着効率が悪かった。これに対し、実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、移植した腎臓前駆細胞を高い効率で生着させることができる。更に、移植した腎臓前駆細胞が、ホストの発生プログラムを引き継ぎ、複雑な分化誘導を自律的に進めて腎臓の一部を形成することができる。

本実施形態の腎臓の製造方法について、図２を参照しながらより詳細に説明する。図２（ａ）〜（ｃ）は、腎臓が発生する様子を説明する模式図である。これらのうち、図２（ａ）が本実施形態の腎臓の製造方法に対応する。

図２（ａ）では、非ヒト動物の胚の初期腎臓の後腎間葉を除去薬剤の添加により除去する。これにより、ホスト由来の腎幹細胞が存在しない状態、すなわち、ニッチが空いた状態となる。続いて、この腎発生ニッチに新たなヒト腎臓前駆細胞（腎幹細胞）を移植する。すると、移植したヒト腎臓前駆細胞が定着し、ホストの発生プログラムを引き継いで腎臓の発生を進行させる。その結果、移植したヒト腎臓前駆細胞により腎臓が再生される。

一方、図２（ｂ）では、非ヒト動物の胚の初期腎臓の後腎間葉を除去薬剤の添加により除去する。これにより、ホスト由来の腎幹細胞が存在しない状態、すなわち、ニッチが空いた状態となる。図２（ｂ）においては、新たなヒト腎臓前駆細胞の移植は行わない。この状態で腎臓の発生を進行させても、腎臓は退縮してしまう。

また、図２（ｃ）では、非ヒト動物の胚の初期腎臓の後腎間葉に、ホスト由来の腎幹細胞を残存させたまま、新たなヒト腎臓前駆細胞を移植している。しかしながら、腎発生ニッチを占有しているホスト由来の既存の細胞による競合が強く、移植したヒト腎臓前駆細胞は定着しない。その結果、ホスト由来の細胞から構成される腎臓が形成される。

以下、本実施形態の腎臓の製造方法の各工程について詳細に説明する。

（工程（ｉ））
本工程では、非ヒト動物の胚の後腎間葉を組織特異的に除去する。非ヒト動物としては、特に制限はなく、例えば、ブタであってもよい。ブタは臓器の大きさがヒト等への移植に適しており、遺伝子改変技術も確立されている。あるいは、非ヒト動物はマウスであってもよい。マウスは、遺伝子改変技術や様々な実験系が確立されているため利用しやすい。

後腎間葉の組織特異的な除去は、後腎間葉を組織特異的に除去することができる限り特に制限されず、例えば、遺伝子組換え技術を使用して行うことができる。

後腎間葉を組織特異的に除去するより具体的な方法を、マウスの系を例に説明する。後腎間葉を組織特異的に除去する方法として、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性依存的にジフテリア毒素受容体（ｄｉｐｈｔｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＤＴＲ）を発現するｉＤＴＲマウスと、Ｓｉｘ２のプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を導入したＳｉｘ２−Ｃｒｅマウスとを交配し、得られた子孫の後腎組織にジフテリア毒素を接触させることが挙げられる。

ｉＤＴＲマウスは、ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子の上流に２つのｌｏｘＰ配列で挟まれた転写停止配列を有している。このため、そのままではジフテリア毒素受容体を発現しない。しかしながら、Ｃｒｅリコンビナーゼにより、２つのｌｏｘＰ配列で挟まれた転写停止配列が除去されると、ジフテリア毒素受容体を発現するようになる。

マウスはジフテリア毒素受容体を有しないため、本来、ジフテリア毒素をマウスの細胞に接触させても細胞が死滅することはない。しかしながら、ジフテリア毒素受容体を発現させたマウスの細胞にジフテリア毒素を接触させると死滅することが知られている。上記の例ではこの現象を利用している。

まず、ｉＤＴＲマウスと後腎間葉特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するＳｉｘ２−Ｃｒｅマウスとを交配すると、得られた子孫の中に後腎組織で組織特異的にジフテリア毒素受容体を発現するマウスが出現する。なお、Ｓｉｘ２は、後腎間葉で特異的に発現する転写因子である。

続いて、上記のマウスの後腎にジフテリア毒素を接触させると、後腎間葉特異的に細胞を死滅させ、後腎間葉を組織特異的に除去することができる。すなわち、腎発生ニッチを空けることができる。

ジフテリア毒素の接触は、親マウス又はマウスの胎仔にジフテリア毒素を注射すること等により行ってもよい。あるいは、マウスの胎仔から後腎を摘出し、摘出した後腎を器官培養し、その培地中にジフテリア毒素を添加すること等により行ってもよい。あるいは、摘出した後腎を患者の傍大動脈領域や体網に移植し、患者の体内において、ジフテリア毒素を局所投与すること等により行ってもよい。

上述した方法は、後腎間葉を組織特異的に除去する方法の１つであり、マウスに限らずあらゆる非ヒト動物に適用することができる。

（工程（ｉｉ））
続いて、本工程において、後腎にヒト腎臓前駆細胞を移植する。工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）は並行して実施してもよい。すなわち、ニッチを空ける時期と、ヒト腎臓前駆細胞を移植する時期は重なっていてもよい。例えば、除去薬剤の添加とヒト腎臓前駆細胞の移植を同時に実施してもよい。

ヒト腎臓前駆細胞としては、例えば、ヒト由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）や、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導した腎臓前駆細胞（腎臓幹細胞）等が挙げられる。ヒト腎臓前駆細胞は、患者由来の細胞であってもよく、患者における拒絶反応が抑制された他家の細胞であってもよい。

ヒト腎臓前駆細胞は、製造後の腎臓を移植する対象である患者由来の細胞であることが好ましい。例えば、ヒト骨髄、脂肪組織、流血中又は臍帯血から分取された間葉系幹細胞等から分化誘導した腎臓前駆細胞が挙げられる。患者本人の骨髄、流血中又は臍帯血から分取される間葉系幹細胞から分化誘導した腎臓前駆細胞であってもよい。分取法は、一般的な外科的医学手法によればよい。分取された細胞は、最適条件を選択し、好適には培養を２〜５細胞継代行う。また、間葉系幹細胞の形質転換を抑制しながら培養を継続する目的でＣａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製のヒト間葉系幹細胞専用培地キット等を用いて培養してもよい。

ヒト腎臓前駆細胞には、所望により、アデノウイルス又はレトロウイルス等を用いて所望の遺伝子を導入してもよい。例えば、腎臓形成を補助する目的でグリア細胞由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ−ＧＤＮＦ）を発現するように遺伝子導入させてもよい。これは、腎臓が形成される直前の間葉組織はＧＤＮＦを発現するようになり、その受容体であるｃ−ｒｅｔを発現する尿管芽を引き込むことで腎臓発生の最初の重要なステップを完了させるからである。

移植の方法としては、例えば、注射針等を用いて、後腎にヒト腎臓前駆細胞を注入すればよい。移植するヒト腎臓前駆細胞の数は例えば１×１０^３〜１×１０^６個程度が好ましい。ヒト腎臓前駆細胞の移植は、インビトロで実行することもできるため、手技の熟練を要さず、非常に容易である。

ヒト腎臓前駆細胞を移植した結果、製造される腎臓は腎発生ニッチに移植したヒト細胞から構成されたものとなる。この腎臓は、患者に移植して機能させることができる。腎臓前駆細胞が、患者本人の細胞又は患者との拒絶反応が抑制された細胞であると、より好ましい。

（工程（ｉｉｉ））
続いて、本工程において、ヒト腎臓前駆細胞を移植した後腎の発生を進行させる。その結果、移植したヒト腎臓前駆細胞が分化成熟し、腎臓の一部を形成する。後腎の発生の進行は、胚から後腎を摘出せずにヒト腎臓前駆細胞を移植した場合には、胚を再び親動物の子宮に戻して成長させることや、全胚培養すること等により実施することができる。あるいは、後腎を摘出してヒト腎臓前駆細胞を移植した場合には、後腎の器官培養を継続することにより実施することができる。あるいは、後腎を患者の傍大動脈領域や体網に移植し、患者の体内でヒト腎臓前駆細胞を移植した場合には、そのまま後腎を成長させることにより実施することができる。

その結果、実施例において後述するように、移植したヒト腎臓前駆細胞がホストの発生プログラムを引き継ぎ、残存する尿管芽と相互作用しながら複雑な分化誘導を自律的に進めて糸球体や尿細管を形成する。また、ホスト側の後腎間葉を構成する腎臓前駆細胞を完全に除去するため、再生される糸球体及び尿細管は、実質的に移植したヒト腎臓前駆細胞に由来する細胞のみで構成される。

ここで、「実質的に」とは、非ヒト動物の腎発生ニッチを利用して腎臓を製造した場合に、移植したヒト腎臓前駆細胞以外の細胞が混入することを排除しないという意味である。いいかえると、再生される糸球体及び尿細管は、７０質量％以上が移植したヒト腎臓前駆細胞からなることが好ましく、８０質量％以上が移植したヒト腎臓前駆細胞からなることがより好ましく、９０質量％以上が移植したヒト腎臓前駆細胞からなることが更に好ましく、９５質量％以上が移植したヒト腎臓前駆細胞からなることが更により好ましく、９９質量％以上が移植したヒト腎臓前駆細胞からなることが特に好ましい。

本実施形態の腎臓の製造方法は、前記後腎の尿管芽を組織特異的に除去する工程（ｉｖ）と、前記後腎にヒト腎臓前駆細胞を移植する工程（ｖ）と、を更に備えていてもよい。また、工程（ｉｖ）及び（ｖ）は、上述した工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の前に実施してもよいし、上述した工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の後に実施してもよい。また、工程（ｉｖ）及び（ｖ）の後に工程（ｉｉｉ）を更に実施してもよい。

これにより、後腎間葉だけでなく尿管芽も、移植したヒト腎臓前駆細胞に由来する細胞に置き換えることができる。その結果、実質的に移植したヒト腎臓前駆細胞に由来する細胞のみで構成された腎臓を製造することができる。以下、各工程について説明する。

（工程（ｉｖ））
本工程において、非ヒト動物の後腎の尿管芽を組織特異的に除去する。尿管芽の組織特異的な除去は、尿管芽を組織特異的に除去することができる限り特に制限されず、例えば、遺伝子組換え技術を使用して行うことができる。

例えば、上述したｉＤＴＲマウスとＳｉｘ２−Ｃｒｅマウスとを交配して得られたマウスにおいて、尿管芽特異的プロモーターの下流にＣｒｅ−ＥＲタンパク質をコードする遺伝子を更に導入したマウスを用いることができる。ここで、尿管芽特異的プロモーターとしては、サイトケラチン８のプロモーター、ＨｏｘＢ７のプロモーター等が挙げられる。

このようなマウスとしては、例えば、Ｓｉｘ２−Ｃｒｅ^{ｔｇ／ｗｔ}サイトケラチン８−Ｃｒｅ−ＥＲ^{ｔｇ／ｗｔ}の遺伝子型を有するｉＤＴＲマウス、Ｓｉｘ２−Ｃｒｅ^{ｔｇ／ｗｔ}ＨｏｘＢ７−Ｃｒｅ−ＥＲ^{ｔｇ／ｗｔ}の遺伝子型を有するｉＤＴＲマウス等が挙げられる。ここで、「ｔｇ」はトランスジェニックであることを表し、「ｗｔ」は野生型であることを表す。

Ｃｒｅ−ＥＲタンパク質とは、Ｃｒｅリコンビナーゼと変異エストロゲン受容体の融合タンパク質である。上記のマウスは尿管芽のマーカーであるサイトケラチン８又はＨｏｘＢ７のプロモーター依存的にＣｒｅ−ＥＲを発現する。

Ｃｒｅ−ＥＲタンパク質は通常細胞質に存在するが、エストロゲン誘導体であるタモキシフェンと結合することにより核内に移行し、ｌｏｘＰ配列に対して組換えを起こす。これを利用してＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムの働く時期をタモキシフェン依存的に調節することが可能である。したがって、Ｃｒｅ−ＥＲ及びＣｒｅが同時に発現していても、タモキシフェンを投与するか否かにより、Ｃｒｅ−ＥＲの活性発現を制御することができる。ここで、Ｃｒｅ−ＥＲの代わりに、Ｃｒｅ−ＥＲの改変体である、Ｃｒｅ−ＥＲＴ、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２等を用いてもよい。

上記のマウスは、後腎間葉特異的にジフテリア毒素受容体を発現する。そこで、まず、上述した工程（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）を実行するとよい。具体的には、上記のマウスの胚の後腎にジフテリア毒素を接触させることにより、後腎間葉を除去する。続いて、上述した方法により、後腎にヒト腎臓前駆細胞を移植して、後腎の発生を進行させる。その結果、移植したヒト腎臓前駆細胞により後腎間葉が再生される。

続いて、この後腎にタモキシフェンを接触させると、尿管芽特異的にジフテリア毒素受容体が発現する。そこで、この後腎にジフテリア毒素を接触させることにより、尿管芽を組織特異的に除去することができる。すなわち、腎発生ニッチを空けることができる。

上記のマウスの例では、後腎間葉特異的プロモーターの下流にＣｒｅタンパク質をコードする遺伝子が導入され、尿管芽特異的プロモーターの下流にＣｒｅ−ＥＲタンパク質をコードする遺伝子が導入されていた。しかしながら、後腎間葉特異的プロモーターの下流にＣｒｅ−ＥＲタンパク質をコードする遺伝子が導入され、尿管芽特異的プロモーターの下流にＣｒｅタンパク質をコードする遺伝子が導入されていてもよい。また、Ｃｒｅ−ＥＲの代わりに、Ｃｒｅ−ＥＲの改変体である、Ｃｒｅ−ＥＲＴ、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２等を用いてもよい。

例えば、ｉＤＴＲマウスと、後腎間葉特異的プロモーターの下流にＣｒｅ−ＥＲタンパク質をコードする遺伝子を導入したマウスとを交配して得られたマウスに、更に尿管芽特異的なプロモーターの下流にＣｒｅタンパク質をコードする遺伝子を導入したマウスを用いてもよい。

より具体的には、例えば、Ｓｉｘ２−Ｃｒｅ−ＥＲ^{ｔｇ／ｗｔ}ＨｏｘＢ７−Ｃｒｅ^{ｔｇ／ｗｔ}の遺伝子型を有するｉＤＴＲマウス等が挙げられる。ここで、「ｔｇ」、「ｗｔ」は上述したものと同じ意味を表す。

このマウスは後腎間葉特異的にＣｒｅ−ＥＲを発現する。また、尿管芽特異的にジフテリア毒素受容体を発現する。そこで、このマウスを使用する場合には、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を実施する前に、工程（ｉｖ）及び（ｖ）を実施することになる。具体的には、このマウスの胚の後腎にジフテリア毒素を接触させることにより、尿管芽を除去することができる。

上述した方法は、尿管芽を組織特異的に除去する方法の１つであり、マウスに限らずあらゆる非ヒト動物に適用することができる。

（工程（ｖ））
続いて、本工程において、上記の後腎にヒト腎臓前駆細胞を移植して、尿管芽の発生を進行させる。その結果、移植したヒト腎臓前駆細胞により尿管芽が再生される。工程（ｉｖ）及び工程（ｖ）は並行して実施してもよい。すなわち、ニッチを空ける時期と、ヒト腎臓前駆細胞を移植する時期は重なっていてもよい。例えば、除去薬剤の添加とヒト腎臓前駆細胞の移植を同時に実施してもよい。

続いて、上述した工程（ｉｉｉ）を実施し、ヒト腎臓前駆細胞を移植した胚（後腎）の発生を進行させる。その結果、移植したヒト腎臓前駆細胞が分化成熟し、腎臓の一部を形成する。

ヒト腎臓前駆細胞としては、上述したものと同様のものを用いることができる。ここで、ヒト腎臓前駆細胞が、上述した後腎間葉の再生におけるヒト腎臓前駆細胞と由来が同じである場合には、製造される腎臓は、糸球体、尿細管だけでなく、集合管、尿管も、由来が同じ細胞から構成されたものとなる。

このため、ヒト腎臓前駆細胞が、患者由来の細胞又は患者との拒絶反応が抑制された細胞であると、患者に移植した場合に、より拒絶反応の少ない腎臓を製造することができる。

例えば、Ｓｉｘ２−Ｃｒｅ−ＥＲ^{ｔｇ／ｗｔ}ＨｏｘＢ７−Ｃｒｅ^{ｔｇ／ｗｔ}の遺伝子型を有するｉＤＴＲマウスを用いて、工程（ｉｖ）及び（ｖ）を先に実施した場合には、引き続き、上述した工程（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）を実施してもよい。すなわち、移植したヒト腎臓前駆細胞により尿管芽が再生したマウスの後腎にタモキシフェンを接触させると、今度は後腎間葉特異的にジフテリア毒素受容体が発現する。そこで、この後腎にジフテリア毒素を接触させることにより、今度は後腎間葉を組織特異的に除去することができる。すなわち、腎発生ニッチを空けることができる。

本実施形態の腎臓の製造方法において、後腎間葉の除去と尿管芽の除去は、いずれを先に行ってもよい。尿管芽の除去を先に行う場合には、上述したＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを適宜改変してもよい。

［腎臓］
１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された、腎臓を提供する。本実施形態の腎臓は、ホストである非ヒト動物の腎発生ニッチ及び発生プログラムを利用して、所望のヒト腎臓前駆細胞から製造されている。したがって、患者に移植して機能させることができる。

上述したように、本実施形態の腎臓は、後腎間葉若しくは尿管芽又はこれらの双方が、移植したヒト腎臓前駆細胞に置換され形成されている。このため、特に、後腎間葉及び尿管芽の双方が、移植したヒト腎臓前駆細胞に置換された腎臓である場合には、当該腎臓は、実質的に移植したヒト腎臓前駆細胞に由来する細胞のみで構成されている。このため、腎臓を構成する細胞を特定することにより、上述した製造方法により製造された腎臓であるか、移植したヒト腎臓前駆細胞を調製するもととなった患者の本来の腎臓であるかを特定することは困難である。

上記の腎臓は、非ヒト動物由来の細胞と、ヒト細胞とを含み、前記ヒト細胞の割合が７０質量％以上、より好ましくは８０質量％以上、更に好ましくは９０質量％以上、更により好ましくは９５質量％以上、特に好ましくは９９質量％以上であるものであってもよい。ここで、非ヒト動物としては、上述したように、例えば、ブタ、マウス等が挙げられる。このような腎臓は、上述した腎臓の製造方法により製造することができる。

本実施形態の腎臓は、例えば、上述した製造方法により、後腎間葉が移植したヒト腎臓前駆細胞に置換されて形成されたものであってもよい。この場合、尿管芽に由来する集合管や尿管は、ホストである非ヒト動物に由来するものとなる。

あるいは、本実施形態の腎臓は、上述した製造方法により、尿管芽が移植したヒト腎臓前駆細胞に置換されて形成されたものであってもよい。この場合、後腎間葉に由来する糸球体や尿細管は、ホストである非ヒト動物に由来するものとなる。

あるいは、本実施形態の腎臓は、上述した製造方法により、後腎間葉及び尿管芽の双方が移植したヒト腎臓前駆細胞に置換されて形成されたものであってもよい。この場合、糸球体、尿細管、集合管、尿管の実質的に全てが移植したヒト腎臓前駆細胞に由来するものとなる。しかしながら、形成された腎臓に、ホストである非ヒト動物に由来する細胞が残存する場合がある。

［移植用臓器］
１実施形態において、本発明は、上述したいずれかの腎臓と、尿管と、膀胱とを備える移植用臓器を提供する。

発明者らは、以前に、再生腎臓の移植により尿を生成することができても、生成した尿を排泄することができずに水腎症を起こしてしまい、腎機能を長期間持続することができないことを見出した。発明者らはまた、腎臓だけでなく、腎臓と、尿管と、膀胱とを備える構造体を移植することにより、尿を生成するだけでなく、生成した尿を排泄することが可能となることを以前に見出した。

したがって、本実施形態の移植用臓器は、腎臓と、尿管と、膀胱とを備えるため、患者に移植した場合においても、尿を生成するだけでなく、生成した尿を排泄することができ、腎機能を長時間持続することができる。

本実施形態の移植用臓器は、患者の傍大動脈領域や体網に移植してもよく、例えば患者の脾臓（脾動脈の周辺）に移植してもよい。また、上記の移植用臓器を構成する膀胱は、患者の尿管に接続されてもよい。これにより、腎臓と、第１の尿管と、第１の膀胱と、第２の尿管と、第２の膀胱とがこの順に接続された臓器構造体が形成される。ここで、第２の尿管と第２の膀胱は、患者が本来有している尿管及び膀胱である。

このような臓器構造体を形成することにより、上述した移植用臓器を構成する再生腎臓が生成した尿を排泄することが更に容易になる。

本実施形態の移植用臓器において、前記尿管（第１の尿管）及び前記膀胱（第１の膀胱）は、上述した腎臓の製造方法における非ヒト動物由来であってもよい。尿管や膀胱は一般的に免疫原性が低いため、尿管や膀胱が非ヒト動物由来であっても問題になりにくい。ここで、非ヒト動物は、上述した腎臓の製造方法において、足場となる腎発生ニッチを提供したホスト動物である。すなわち、本実施形態の移植用臓器は、上述した製造方法により形成された腎臓と、これに続く尿管と、これに続く膀胱とから構成されていてもよい。

本実施形態の移植用臓器は、腎臓、尿管及び膀胱が接続した状態で、非ヒト動物から摘出して保存・流通させることができる。ここで、移植用臓器を凍結して保存・流通させてもよい。あるいは、本実施形態の移植用臓器は、本実施形態の移植用臓器を有する非ヒト動物の形態で流通させることもできる。

［遺伝子改変非ヒト動物］
１実施形態において、本発明は、後腎の後腎間葉を組織特異的に除去することができる、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。遺伝子改変非ヒト動物は、例えば、遺伝子改変マウスであってもよいし、遺伝子改変ブタであってもよい。また、遺伝子改変の手法は特に限定されず、ＥＳ細胞を用いた方法であってもよく、ゲノム編集を用いた方法であってもよい。

本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物を用いて上述した腎臓の製造方法を実施することにより、ヒトに移植して機能させることが可能な腎臓を製造することができる。したがって、本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物は、上述した腎臓の製造用であるということができる。あるいは、本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物は、上述した移植用臓器の製造用であるということができる。

本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物のより具体的な例としては、例えば、上述した、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性依存的にジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）を発現するコンストラクトと、後腎間葉特異的なプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を接続したコンストラクトとを有する遺伝子改変非ヒト動物が挙げられる。このシステムは、本来ジフテリア毒素に感受性がない非ヒト動物に適用することができる。このような非ヒト動物としては、例えばマウスが挙げられる。

ここで、後腎間葉特異的なプロモーターとしては、例えば転写因子であるＳｉｘ２のプロモーター等が挙げられる。この遺伝子改変非ヒト動物は、後腎間葉特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現する。その結果、後腎間葉特異的にジフテリア毒素受容体を発現する。そこで、ジフテリア毒素を接触させると後腎間葉を特異的に死滅させて除去することができる。

ここで、Ｃｒｅリコンビナーゼとして、タモキシフェンの存在下でＣｒｅリコンビナーゼを核内に移行させることができるＣｒｅ−ＥＲ等を用いてもよい。この場合、タモキシフェンを投与した場合においてのみＣｒｅリコンビナーゼが核内に移行してジフテリア毒素受容体を発現させることができる。

あるいは、本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物は、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性依存的にジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ Ａ ｓｕｂｕｎｉｔ，ＤＴ−Ａ）を発現するコンストラクトと、後腎間葉特異的なプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を接続したコンストラクトとを有する遺伝子改変非ヒト動物が挙げられる。このシステムは、本来ジフテリア毒素に感受性がある非ヒト動物に適用することができる。このような非ヒト動物としては、例えばブタが挙げられる。

ここで、後腎間葉特異的なプロモーターとしては、例えば転写因子であるＳｉｘ２のプロモーター等が挙げられる。この遺伝子改変非ヒト動物は、後腎間葉特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現する。その結果、後腎間葉特異的にジフテリア毒素を発現し、死滅させて除去することができる。

ここで、Ｃｒｅリコンビナーゼとして、タモキシフェンの存在下でＣｒｅリコンビナーゼを核内に移行させることができるＣｒｅ−ＥＲ等を用いてもよい。この場合、タモキシフェンを投与した場合においてのみＣｒｅリコンビナーゼが核内に移行してジフテリア毒素を発現させることができる。また、Ｃｒｅ−ＥＲの代わりに、Ｃｒｅ−ＥＲの改変体である、Ｃｒｅ−ＥＲＴ、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２等を用いてもよい。

本実施形態の非ヒト動物は、更に、後腎の尿管芽を組織特異的に除去することができるように遺伝子改変されていてもよい。具体的には、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性依存的にジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）を発現するコンストラクト、及び後腎間葉特異的なプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を接続したコンストラクトに加えて、更に、尿管芽特異的なプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を接続したコンストラクトを有する遺伝子改変非ヒト動物が挙げられる。このシステムは、本来ジフテリア毒素に感受性がない非ヒト動物に適用することができる。このような非ヒト動物としては、例えばマウスが挙げられる。

ここで、尿管芽特異的なプロモーターとしては、例えば、サイトケラチン８のプロモーター、ＨｏｘＢ７のプロモーター等が挙げられる。この遺伝子改変非ヒト動物は、尿管芽特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現する。その結果、尿管芽特異的にジフテリア毒素受容体を発現する。そこで、ジフテリア毒素を接触させると尿管芽を特異的に死滅させて除去することができる。ここで、Ｃｒｅリコンビナーゼとして、Ｃｒｅ−ＥＲ、Ｃｒｅ−ＥＲＴ、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２等を用いてもよい。

本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物において、細胞を死滅させるシステムは、対象とする非ヒト動物の種に適用することができ、組織特異的、時期特異的に作動させることができるものであれば特に制限なく用いることができる。

したがって、ジフテリア毒素又はジフテリア毒素受容体以外のシステムにより細胞を死滅させる構成であってもよい。例えば、組織特異的なプロモーターの下流で、ガンシクロビルの投与によってアポトーシスを誘導するヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）を発現させるシステムが挙げられる。ＨＳＶ−ＴＫを発現させた細胞はガンシクロビル投与下で細胞死が誘導される。

あるいは、ＡＰ２０１８７の投与により、Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｃａｓｐａｓｅ８、Ｃａｓｐａｓｅ９等を二量体化させてアポトーシスを誘導するシステムを用いてもよい。

本実施形態の遺伝子改変非ヒト動物は、後腎の後腎間葉又は尿管芽を組織特異的に除去することができる限り上述したものに限定されず、様々な遺伝子組換えシステムや、遺伝子組換えシステムの組み合わせを有していてもよい。

［腎臓製造用キット］
１実施形態において、本発明は、非ヒト動物の後腎と、前記胚の後腎間葉を組織特異的に除去する薬剤と、ヒト腎臓前駆細胞とを備える、腎臓製造用キットを提供する。

本実施形態のキットを用いて、上述した腎臓の製造方法を実施することにより、腎臓を製造することができる。非ヒト動物としては、上述したように、ブタ、マウス等が挙げられる。非ヒト動物の後腎は、胚の形態で提供されてもよいし、胎仔を含む親動物の形態で提供されてもよい。また、後腎は後に膀胱となる総排出腔に接続した状態であってもよい。この場合、後腎が腎臓及び尿管を形成し、総排出腔が膀胱を形成し、これらの腎臓、尿管、膀胱が接続された状態となる。この結果、上述したように、製造された腎臓は、尿を生成するだけでなく、生成した尿を排泄することが可能となる。

本実施形態のキットにおいて、後腎間葉を組織特異的に除去する薬剤としては、例えば、上述したジフテリア毒素等が挙げられる。この場合、非ヒト動物としては、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム等により、後腎間葉特異的にジフテリア毒素受容体を発現する非ヒト動物が挙げられる。

あるいは、後腎間葉を組織特異的に除去することができる限り、上述したもの以外の種々のコンディショナルノックアウトシステムも用いることができる。後腎間葉を組織特異的に除去する薬剤としては、使用するシステムに応じて、ジフテリア毒素（ｉＤＴＲシステム）、タモキシフェン（Ｃｒｅ−ＥＲＴ２システム）、タクロリムス（Ｍｏｓ−ｉＣｓｐ３システム）、ドキシサイクリン、テトラサイクリン（Ｔｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆシステム）、ガンシクロビル（ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子システム）等を使用することができる。

これらのコンディショナルノックアウトシステムは、ゲノム編集技術等を用いて作製することができ、非ヒト動物の腎発生ニッチにおいて、組織特異的に細胞を除去することができる。また、細胞を除去する時期を薬剤の投与によって調節することができる。これらのシステムを用いることにより、標的細胞の除去を時空間特異的に制御し、腎臓再生に適した生きた足場を構築することができる。

後腎間葉を組織特異的に除去する薬剤の投与方法は特に制限されず、使用する薬剤に応じて適宜選択すればよい。例えば、インビトロで器官培養等の培地に添加すること、インビボで局所投与、腹腔内投与、静脈内注射、経口投与すること等が挙げられる。

また、ヒト腎臓前駆細胞としては、例えば、患者由来の腎臓前駆細胞等が挙げられる。ヒト腎臓前駆細胞としては、患者由来のｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）等から分化誘導した腎臓前駆細胞、患者における拒絶反応が抑制された他家のｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導した腎臓前駆細胞等が挙げられる。上記の他家のｉＰＳ細胞は、例えば、ｉＰＳ細胞バンクから入手することができる。

腎臓の製造は患者の体外で行い、その後患者の傍大動脈領域や体網に移植してもよい。あるいは、腎臓の製造は、患者の体内で行ってもよい。より詳細には、まず、非ヒト動物の後腎を患者の傍大動脈領域や体網に移植し、患者の体内において後腎のニッチを空け、ヒト腎臓前駆細胞を移植し、腎臓を製造してもよい。この方法によれば、再生された腎臓に引き込まれる血管系が患者の血管になり、機能的な腎臓を構築することができる点が有利である。

本実施形態のキットは、前記後腎の尿管芽を組織特異的に除去する薬剤を更に備えていてもよい。これにより、後腎間葉に由来する組織だけでなく、尿管芽に由来する組織も移植したヒト腎臓前駆細胞に由来する腎臓を製造することが可能となる。

尿管芽を組織特異的に除去する薬剤としては、例えば、上述した、タモキシフェン及びジフテリア毒素の組み合わせ等が挙げられる。この場合、非ヒト動物としては、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム等により、後腎間葉特異的にジフテリア毒素受容体を発現するとともに、タモキシフェンの投与により尿管芽特異的にジフテリア毒素受容体を発現する非ヒト動物が挙げられる。

あるいは、上述した種々のコンディショナルノックアウトシステムのいずれかを使用して尿管芽を除去することもできる。この場合、尿管芽を組織特異的に除去する薬剤は、採用したシステムに応じた適宜の薬剤となる。

上述した種々のコンディショナルノックアウトシステムを組み合わせることにより、複数の対象組織を任意の時期に除去することが可能となる。例えば、タモキシフェンを用いて尿管芽を組織特異的に除去した後に、タクロリムスを用いて後腎間葉を段階的に、組織特異的に除去することができる。その結果、ほぼ全ての腎臓組織を移植したヒト腎臓前駆細胞に由来するものにすることができる。

［腎臓再生用医薬］
１実施形態において、本発明は、非ヒト動物の後腎と、前記後腎の後腎間葉を組織特異的に除去する薬剤と、ヒト腎臓前駆細胞とを備える、腎臓再生用医薬を提供する。

本実施形態の医薬によれば、患者の体内で上述した腎臓の再生を行うことができる。本実施形態の医薬は次のようにして用いることができる。まず、非ヒト動物の後腎を患者の傍大動脈領域や体網に移植する。非ヒト動物の後腎としては、上述した腎臓製造用キットにおけるものと同様のものを用いることができる。

続いて、患者に、後腎間葉を組織特異的に除去する薬剤を投与する。薬剤としては、上述した腎臓製造用キットにおけるものと同様のものを用いることができる。薬剤の投与は、使用する薬剤に応じて、適宜、局所投与、腹腔内投与、静脈内注射、経口投与等により行うとよい。

続いて、ヒト腎臓前駆細胞を移植する。ヒト腎臓前駆細胞としては、例えば、患者由来のｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）等から分化誘導した腎臓前駆細胞、患者における拒絶反応が抑制された他家のｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から分化誘導した腎臓前駆細胞等が挙げられる。その後、移植した後腎の発生を進行させることにより、患者の体内で移植したヒト腎臓前駆細胞により構成された腎臓が製造（再生）される。

本実施形態の医薬によれば、再生された腎臓に引き込まれる血管系が患者の血管になり、機能的な腎臓を構築することができる点が有利である。

上記の腎臓再生用医薬は、後腎の尿管芽を組織特異的に除去する薬剤を更に備えていてもよい。これにより、後腎間葉に由来する組織だけでなく、尿管芽に由来する組織も移植したヒト腎臓前駆細胞に由来する腎臓を再生することができる。後腎の尿管芽を組織特異的に除去する薬剤としては、上述した腎臓製造用キットにおけるものと同様のものを用いることができる。

［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、上述した腎臓、尿管及び膀胱を備える移植用臓器を患者の体内に移植する工程（ａ）と、移植から所定期間後に、上記移植用臓器の膀胱と、患者の尿管とを接続する工程（ｂ）と、を備える、腎臓の移植方法を提供する。

本実施形態の方法は、腎疾患の治療方法であるともいえる。移植用臓器としては上述したものを用いることができる。

上記工程（ａ）で移植した移植用臓器を所定期間放置することにより、移植用臓器が成長し、尿産生を開始する。所定期間は、移植用臓器が十分に成長し、かつ、水腎症を起こす前までの期間であればよい。所定期間は、患者の症状等によって適宜調整すればよいが、例えば１〜１０週間であってよい。

続いて、移植から所定期間後（１〜１０週間後）に工程（ｂ）を実施する。工程（ｂ）において、移植用臓器の膀胱と、患者の尿管とを接続する。ここで、患者の尿管は、患者の膀胱につながっている。

移植用臓器の膀胱と、患者の膀胱とを患者の尿管で接続することにより、移植用臓器が産生した尿を、患者の膀胱へと排泄させることができる。より詳細には、移植用臓器の腎臓が産生した尿が、移植用臓器の尿管を通じて移植用臓器の膀胱まで排泄され、次いで、移植用臓器の膀胱から、患者の尿管を通じて患者の膀胱まで排泄される。

本実施形態の方法により、移植用臓器の腎臓が産生した尿を、患者の膀胱へと排泄させることができる。

１実施形態において、本発明は、非ヒト動物の後腎及び総排出腔を患者の体内に移植する工程（ａ１）と、前記後腎の後腎間葉を組織特異的に除去する工程（ａ２）と、前記後腎にヒト腎臓前駆細胞を移植する工程であって、移植したヒト前記腎臓前駆細胞が分化成熟して腎臓の一部を形成し、前記総排出腔が分化成熟して膀胱を形成し、当該膀胱は尿管を介して前記腎臓と接続している工程（ａ３）と、前記ヒト腎臓前駆細胞の移植から所定期間後に、前記膀胱と、患者の尿管とを接続する工程（ｂ）と、を備える、腎疾患の治療方法を提供する。

本実施形態の方法においては、腎臓の製造（再生）を、患者の体内で行う。工程（ａ２）及び工程（ａ３）は並行して実施してもよい。すなわち、ニッチを空ける時期と、ヒト腎臓前駆細胞を移植する時期は重なっていてもよい。例えば、除去薬剤の添加とヒト腎臓前駆細胞の移植を同時に実施してもよい。

上記工程（ａ３）におけるヒト腎臓前駆細胞の移植から所定期間経過すると、移植したヒト腎臓前駆細胞が腎臓を形成し、尿産生を開始する。所定期間は、腎臓及び膀胱が十分に成長し、かつ、水腎症を起こす前までの期間であればよい。所定期間は、患者の症状等によって適宜調整すればよいが、例えば２〜４週間であってよい。

続いて、移植から所定期間後（２〜４週間後）に工程（ｂ）を実施する。工程（ｂ）において、総排出腔が分化成熟して形成された膀胱と、患者の尿管とを接続する。ここで、患者の尿管は、患者の膀胱につながっている。

本実施形態の治療方法は、前記後腎の尿管芽を組織特異的に除去する工程（ａ２’）を更に備えていてもよい。これにより、後腎間葉だけでなく尿管芽も、移植したヒト腎臓前駆細胞に由来する細胞に置き換えることができる。その結果、実質的に移植したヒト腎臓前駆細胞に由来する細胞のみで構成された腎臓を製造することができる。

工程（ａ２’）を実施する場合、工程（ａ２）及び工程（ａ２’）はいずれを先に実施してもよいが、一方を実施した後、他方を実施するまでに４〜７日間の期間を設けることが好ましい。この間に、移植したヒト腎臓前駆細胞が発生プログラムを進行させて分化する。

工程（ａ２）及び工程（ａ３）、又は工程（ａ２’）及び工程（ａ３）は並行して実施してもよい。すなわち、ニッチを空ける時期と、ヒト腎臓前駆細胞を移植する時期は重なっていてもよい。例えば、除去薬剤の添加とヒト腎臓前駆細胞の移植を同時に実施してもよい。

例えば、まず、工程（ａ２）及び工程（ａ３）を同時に実施し、所定期間後、工程（ａ２’）及び工程（ａ３）を同時に実施してもよい。あるいは、まず、工程（ａ２’）及び工程（ａ３）を同時に実施し、所定期間後、工程（ａ２）及び工程（ａ３）を同時に実施してもよい。

次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

［実験例１］
（マウス胚における後腎間葉の組織特異的な除去）
Ｃｒｅリコンビナーゼ活性依存的にジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）を発現するｉＤＴＲマウスと、Ｓｉｘ２のプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を導入したＳｉｘ２−Ｃｒｅマウスとを交配した。なお、Ｓｉｘ２は、後腎間葉で特異的に発現する転写因子である。

続いて、胎生１３日目のＦ_１マウスから、後腎間葉特異的にジフテリア毒素受容体を発現したものを選択し、後腎を摘出した。摘出した後腎を、定法にしたがって器官培養し、培地にジフテリア毒素を添加した。その結果、ジフテリア毒素受容体を発現した、後腎間葉のＳｉｘ２陽性腎臓前駆細胞が死滅した。これにより後腎間葉が組織特異的に除去された。

［実験例２］
（腎臓前駆細胞の移植）
野生型マウス由来の腎臓前駆細胞を、定法により後腎から調製し、細胞解離試薬を用いて単一細胞に解離した。続いて、腎臓前駆細胞１×１０^５個を、実験例１で調製した、後腎間葉が組織特異的に除去された後腎組織に移植した。その後、後腎組織の器官培養を継続した。

［実験例３］
（腎臓組織の免疫染色１）
実験例２の後腎組織を、腎臓前駆細胞の移植から５日間培養後に４％パラホルムアルデヒド固定して組織切片標本を作製した。続いて、後腎間葉のマーカーであるＳｉｘ２及び尿管芽のマーカーであるサイトケラチン８をそれぞれ免疫染色した。図３は免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。倍率は１００倍である。図３において、Ｓｉｘ２陽性細胞は移植した腎臓前駆細胞由来である。また、サイトケラチン８陽性細胞はホスト動物（実験例１のＦ_１マウス）由来である。

その結果、実験例１のＦ_１マウス由来の尿管芽を足場として、実験例２で移植した腎臓前駆細胞がホストの発生プログラムを引き継ぎ、複雑な分化誘導を自律的に進めて後腎間葉を形成したことが確認された。この結果は、上述した方法により、後腎間葉を構成する細胞を、移植した腎臓前駆細胞由来の細胞に置き換えることができることを示す。

［実験例４］
（腎臓組織の免疫染色２）
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス（ＧＦＰ ｔｇマウス）由来の腎臓前駆細胞を、定法により後腎から調製し、細胞解離試薬を用いて単一細胞に解離した。続いて、腎臓前駆細胞１×１０^５個を、実験例１と同様にして調製した、後腎間葉が組織特異的に除去された後腎組織に移植した。その後、後腎組織の器官培養を継続した。

続いて、腎臓前駆細胞の移植から７日間培養後に４％パラホルムアルデヒド固定して組織切片標本を作製した。続いて、尿管芽のマーカーであるサイトケラチン８、及び糸球体のマーカーであるＷｉｌｍｓ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＷＴ１）をそれぞれ免疫染色した。続いて、移植細胞が発現しているＧＦＰ、免疫染色したサイトケラチン８及びＷＴ１の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。図４は免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。倍率は２００倍である。図４において、ＧＦＰ陽性細胞及びＷＴ１陽性細胞は移植した腎臓前駆細胞由来である。また、サイトケラチン８陽性細胞はホスト動物（実験例１のＦ_１マウス）由来である。

その結果、移植したＧＦＰ ｔｇマウス由来の腎臓前駆細胞が糸球体や尿細管を形成したことが確認された。この結果は、上述した方法により、腎臓前駆細胞から機能的な腎臓組織を形成することができることを示す。

［実験例５］
（マウスの生体内での腎臓の再生）
野生型マウスの傍大動脈領域に、ｉＤＴＲマウスとＳｉｘ２−Ｃｒｅマウスとを交配して得られた、後腎組織で組織特異的にジフテリア毒素受容体を発現する胎仔の後腎及び総排出腔を移植した。

続いて、ジフテリア毒素を投与することにより、上記の後腎の後腎間葉を除去し、ＧＦＰ ｔｇマウス由来の腎臓前駆細胞１×１０^５個を移植した。続いて、後腎を移植したマウスを７日間飼育した。

続いて、上記のマウスを開腹し、移植した後腎から形成された腎臓（再生腎臓）を観察した。

図５（ａ）は再生腎臓が存在する領域を撮影した写真である。倍率は１５倍である。右上に野生型マウス（ホスト）の腎臓が見えている。中央付近の点線で囲んだ領域に再生腎臓が存在する。

図５（ｂ）は図５（ａ）と同一視野において、ＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す写真である。倍率は１５倍である。その結果、移植した腎臓前駆細胞に由来するＧＦＰの蛍光が観察された。この結果は、マウスの体内において、インビボで腎臓の再生ができたことを示す。

図６（ａ）は、上記の再生腎臓を４％パラホルムアルデヒド固定して作製した組織切片標本の光学顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。図６（ａ）中、矢頭で示す部分に再生された糸球体が観察された。

図６（ｂ）は、図６（ａ）と同一視野において、ＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。図６（ｂ）中、矢頭で示す部分にＧＦＰの蛍光が観察された。この結果は、再生された糸球体が移植した腎臓前駆細胞に由来するものであることを示す。

以上の結果から、インビボにおいても腎臓の再生を行うことができることが明らかとなった。

［実験例６］
（マウス胚の後腎間葉及び尿管芽の双方の置換）
《尿管芽の組織特異的な除去》
本実験例では、Ｓｉｘ２−Ｃｒｅ−ＥＲ^{ｔｇ／ｗｔ}ＨｏｘＢ７−Ｃｒｅ^{ｔｇ／ｗｔ}の遺伝子型を有するｉＤＴＲマウスを用いた。まず、実験例１と同様にして、マウス胚から後腎を摘出して器官培養した。続いて、培地にジフテリア毒素を添加して尿管芽を組織特異的に除去した。

《腎臓前駆細胞の移植》
続いて、尿管芽を除去したマウス後腎に、実験例２と同様にして、野生型マウス由来の腎臓前駆細胞１×１０^５個を移植した。その後、後腎の器官培養を５日間継続した。

《後腎間葉の組織特異的な除去》
続いて、器官培養の培地にタモキシフェン及びジフテリア毒素を添加した。その結果、後腎間葉特異的なマーカーであるＳｉｘ２発現細胞において、Ｃｒｅ−ＥＲが核内に移行して組換えを起こし、ジフテリア毒素受容体を発現した。その結果、後腎間葉の細胞がジフテリア毒素により死滅した。これにより、後腎間葉を組織特異的に除去した。

《腎臓前駆細胞の移植》
続いて、後腎間葉を除去したマウス後腎に、実験例２と同様にして、野生型マウス由来の腎臓前駆細胞１×１０^５個を再度移植した。その後、後腎の器官培養を３〜５日間継続した。

《免疫染色》
続いて、器官培養した後腎を４％パラホルムアルデヒド固定して組織切片標本を作製した。続いて、尿管芽を染色する抗カルビンディン抗体で免疫染色して蛍光顕微鏡で観察した。

図７（ａ）は、陽性対照の後腎の代表的な写真である。陽性対照では、尿管芽の除去段階でジフテリア毒素を添加せず、また、腎臓前駆細胞も移植しなかった。したがって、陽性対照では、本来の尿管芽に由来する組織が維持されていた。

図７（ｂ）は、陰性対照の後腎の代表的な写真である。陰性対照では、尿管芽の除去段階でジフテリア毒素を添加し、また、腎臓前駆細胞を移植しなかった。したがって、陰性対照では、尿管芽が組織特異的に除去され、腎臓前駆細胞は移植されなかったために、尿管芽が欠失していた。

図７（ｃ）は、試験群の後腎の代表的な写真である。試験群では、尿管芽が組織特異的に除去され、腎臓前駆細胞が移植された。その結果、移植された腎臓前駆細胞により尿管芽が置き換えられ、尿管芽に由来する組織の成長が認められた。

下記表１は、陽性対照（ｎ＝５）、陰性対照（ｎ＝５）及び試験群（ｎ＝５）の後腎における尿管芽の先端の数を計測した結果である。

その結果、陰性対照では、陽性対照と比較して尿管芽の先端の数の減少が認められた。これに対し、試験群では、陽性対照と同程度の尿管芽の先端の数が計測された。この結果は、本実験例の方法により、後腎間葉及び尿管芽の双方を、移植した腎臓前駆細胞で置換することができることを示す。

本発明によれば、腎臓前駆細胞から腎臓を作製する技術を提供することができる。

Claims (15)

1. 非ヒト動物（但し、マウスを除く。）の発生途中の後腎の後腎間葉を組織特異的に除去する工程（ｉ）と、
   前記後腎にヒト腎臓前駆細胞を移植する工程（ｉｉ）と、
   前記後腎の発生を進行させる工程であって、移植した前記ヒト腎臓前駆細胞が分化成熟し、腎臓の一部を形成する工程（ｉｉｉ）と、
   を備える、腎臓の製造方法。
2. 前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の前又は後に、
   前記後腎の尿管芽を組織特異的に除去する工程（ｉｖ）と、
   前記後腎にヒト腎臓前駆細胞を移植する工程（ｖ）と、
   を更に備える、請求項１に記載の腎臓の製造方法。
3. 前記非ヒト動物がブタである、請求項１又は２に記載の腎臓の製造方法。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法により製造され、前記非ヒト動物由来の細胞と、ヒト細胞とを含み、前記ヒト細胞の割合が７０〜９９質量％である、腎臓。
5. 非ヒト動物由来の細胞と、ヒト細胞とを含み、前記ヒト細胞の割合が７０〜９９質量％である、腎臓。
6. 請求項４又は５に記載の腎臓を有する非ヒト動物。
7. 請求項４又は５に記載の腎臓と、尿管と、膀胱とを備える移植用臓器。
8. 前記尿管及び前記膀胱が前記非ヒト動物由来である、請求項７に記載の移植用臓器。
9. 発生途中の後腎の後腎間葉を組織特異的に除去することができる、遺伝子改変非ヒト動物。
10. 更に、前記後腎の尿管芽を組織特異的に除去することができる、請求項９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
11. 遺伝子改変ブタである、請求項９又は１０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
12. 非ヒト動物の発生途中の後腎と、前記後腎の後腎間葉を組織特異的に除去するための第１の薬剤と、ヒト腎臓前駆細胞とを備え、前記第１の薬剤が、ジフテリア毒素、タモキシフェン、タクロリムス、ドキシサイクリン、テトラサイクリン又はガンシクロビルを含む、腎臓製造用キット。
13. 前記後腎の尿管芽を組織特異的に除去するための第２の薬剤を更に備え、前記第２の薬剤が、ジフテリア毒素、タモキシフェン、タクロリムス、ドキシサイクリン、テトラサイクリン又はガンシクロビルを含む、請求項１２に記載の腎臓製造用キット。
14. 非ヒト動物の発生途中の後腎と、前記後腎の後腎間葉を組織特異的に除去するための第１の薬剤と、ヒト腎臓前駆細胞とを備え、前記第１の薬剤が、ジフテリア毒素、タモキシフェン、タクロリムス、ドキシサイクリン、テトラサイクリン又はガンシクロビルを含む、腎臓再生用医薬。
15. 前記後腎の尿管芽を組織特異的に除去するための第２の薬剤を更に備え、前記第２の薬剤が、ジフテリア毒素、タモキシフェン、タクロリムス、ドキシサイクリン、テトラサイクリン又はガンシクロビルを含む、請求項１４に記載の腎臓再生用医薬。

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