KR20190033065A - 신장의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

비인간 동물의 후신의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 공정과, 상기 후신에 인간 신장 전구세포를 이식하는 공정과, 상기 후신의 발생을 진행시키는 공정으로서, 이식한 상기 인간 신장 전구세포가 분화 성숙해 신장의 일부를 형성하는 공정을 구비하는 신장의 제조 방법.

Description

신장의 제조 방법
본 발명은 신장의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 신장의 제조 방법, 신장, 비인간 동물, 이식용 장기, 신장 제조용 키트 및 신장 재생용 의약에 관한 것이다. 본원은 2016년 6월 29일에 출원된 일본 특허출원 2016-129391호에 기초해 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
고령화나 적응 질환의 확대 등에 의해, 인공투석 환자는 급속히 증가하고 있다. 투석 의료에 의해 이들 환자를 구명하는 것은 가능하지만, 인공투석으로는 모든 신장 기능을 대신할 수 없기 때문에, 환자의 심혈관 질환이 증가해 치사율이 상승하는 경향이 있다. 또한, 투석 환자의 시간적 부담이나 정신적 부담은 매우 크고, 사회 복귀가 곤란한 경우도 많다.
또한, 신장 이식을 필요로 하는 말기 신부전의 환자는 세계에 약 2백만명 존재하고, 도너 장기의 부족으로부터 그 수는 더욱 증가하는 경향에 있다. 따라서, 말기 신부전은 의료상 중대한 문제이다.
현재, iPS 세포/ES 세포 등의 다능성 줄기세포로부터 여러 가지 조직 특이적인 전구세포 또는 조직 줄기세포의 유도가 가능해지고 있다(예를 들면, 비특허 문헌 1을 참조). 그러나, 예를 들면 신장은 자기 수복능이 낮은 장기이며, 신장 기능은 다종의 세포로 구성되는 복잡한 구조에 의존하고 있다. 이 때문에, 신장 전구세포로부터 복잡한 3차원 구조를 갖는 신장의 재생에는 아직 이르지 못하고 있다.
비특허문헌 1: Takasato M, et al., Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney, Nat. Cell Biol., 16(1), 118-126, 2014.
본 발명은 신장 전구세포로부터 신장을 제작하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 이하의 형태를 포함한다.
(1) 비인간 동물의 후신(後腎)의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 공정과, 상기 후신에 인간 신장 전구세포를 이식하는 공정과, 상기 후신의 발생을 진행시키는 공정으로서, 이식한 상기 인간 신장 전구세포가 분화 성숙해 신장의 일부를 형성하는 공정을 구비하는, 신장의 제조 방법.
(2) 상기 후신의 요관아(尿管芽)를 조직 특이적으로 제거하는 공정과, 상기 후신에 인간 신장 전구세포를 이식하는 공정을 더 구비하는, (1)에 기재된 신장의 제조 방법.
(3) 상기 비인간 동물이 돼지인, (1) 또는 (2)에 기재된 신장의 제조 방법.
(4) 상기 비인간 동물이 마우스인, (1) 또는 (2)에 기재된 신장의 제조 방법.
(5) (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 의해 제조된, 신장.
(6) 비인간 동물 유래의 세포와 인간 세포를 포함하고, 상기 인간 세포의 비율이 70 질량% 이상인, 신장.
(7) (5) 또는 (6)에 기재된 신장을 갖는 비인간 동물.
(8) (5) 또는 (6)에 기재된 신장, 요관 및 방광을 구비하는 이식용 장기.
(9) 상기 요관 및 상기 방광이 상기 비인간 동물 유래인, (8)에 기재된 이식용 장기.
(10) 후신의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거할 수 있는, 유전자 개변 비인간 동물.
(11) 상기 후신의 요관아를 조직 특이적으로 더 제거할 수 있는, (10)에 기재된 유전자 개변 비인간 동물.
(12) 유전자 개변 돼지인, (10) 또는 (11)에 기재된 유전자 개변 비인간 동물.
(13) 비인간 동물의 후신과, 상기 후신의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 약제와, 인간 신장 전구세포를 구비하는, 신장 제조용 키트.
(14) 상기 후신의 요관아를 조직 특이적으로 제거하는 약제를 더 구비하는, (13)에 기재된 신장 제조용 키트.
(15) 비인간 동물의 후신과, 상기 후신의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 약제와, 인간 신장 전구세포를 구비하는, 신장 재생용 의약.
(16) 상기 후신의 요관아를 조직 특이적으로 제거하는 약제를 더 구비하는, (15)에 기재된 신장 재생용 의약.
본 발명에 의하면, 신장 전구세포로부터 신장을 제작하는 기술을 제공할 수 있다.
도 1은 태생(胎生) 11일 전후의 마우스의 태자(胎仔)를 나타낸 모식도이다.
도 2의 (a)∼(c)는 신장이 발생하는 모습을 설명하는 모식도이다.
도 3은 실험예 3에서의 신장 조직 표본의 면역 염색의 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 실험예 4에서의 신장 조직 표본의 면역 염색의 결과를 나타낸 사진이다.
도 5의 (a) 및 (b)는 실험예 5에 있어서 마우스의 체내에서 재생한 신장을 촬영한 사진이다.
도 6의 (a) 및 (b)는 실험예 5에 있어서 마우스의 체내에서 재생한 신장의 조직 절편 표본의 현미경 사진이다.
도 7의 (a)∼(c)는 실험예 6에서의 후신의 조직 표본의 면역 염색의 결과를 나타낸 사진이다.
[신장의 제조 방법]
도 1은 태생 11일 전후의 마우스의 태자를 나타낸 모식도이다. 신장은 전신(前腎), 중신(中腎), 후신(後腎)의 3 단계를 거쳐 형성된다. 이 중 전신 및 중신은 이후에 퇴행 변성한다. 포유류 성체에서 기능하는 신장은 후신이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 신장은 요관아(尿管芽)와 그 주위의 후신 간엽의 상호작용에 의해 형성된다. 요관아는 집합관으로부터 요관까지를 구성하고, 후신 간엽에 포함되는 네프론 전구세포는 사구체 및 요세관의 기원이 된다. 본 명세서에서는, 요관아 및 후신 간엽을 포함하는 신장 발생 영역을 신장 발생 니치(niche)라고 한다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 비인간 동물의 후신의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 공정(i)과, 상기 후신에 인간 신장 전구세포를 이식하는 공정(ⅱ)와, 상기 후신의 발생을 진행시키는 공정으로서, 이식한 상기 인간 신장 전구세포가 분화 성숙해 신장의 일부를 형성하는 공정(ⅲ)을 구비하는 신장의 제조 방법을 제공한다.
종래, 신장 발생 니치로의 세포 이식은 정착 효율이 매우 나빴다. 이에 대해, 실시예에서 후술하는 바와 같이, 본 실시 형태의 제조 방법에 의하면, 이식한 신장 전구세포를 높은 효율로 생착시킬 수 있다. 또한, 이식한 신장 전구세포가 호스트의 발생 프로그램을 계승하고, 복잡한 분화 유도를 자율적으로 진행해 신장의 일부를 형성할 수 있다.
본 실시 형태의 신장의 제조 방법에 대해, 도 2를 참조하면서 보다 상세하게 설명한다. 도 2의 (a)∼(c)는 신장이 발생하는 모습을 설명하는 모식도이다. 이들 중 도 2의 (a)가 본 실시 형태의 신장의 제조 방법에 대응한다.
도 2의 (a)에서는, 비인간 동물의 배(胚, embryo)의 초기 신장의 후신 간엽을 제거 약제의 첨가에 의해 제거한다. 이에 따라, 호스트 유래의 신장 줄기세포가 존재하지 않는 상태, 즉, 니치가 빈 상태가 된다. 계속해서, 이 신장 발생 니치에 새로운 인간 신장 전구세포(신장 줄기세포)를 이식한다. 그러면, 이식한 인간 신장 전구세포가 정착하고, 호스트의 발생 프로그램을 계승해 신장의 발생을 진행시킨다. 그 결과, 이식한 인간 신장 전구세포에 의해 신장이 재생된다.
한편, 도 2의 (b)에서는, 비인간 동물의 배의 초기 신장의 후신 간엽을 제거 약제의 첨가에 의해 제거한다. 이에 따라, 호스트 유래의 신장 줄기세포가 존재하지 않는 상태, 즉, 니치가 빈 상태가 된다. 도 2의 (b)에서는, 새로운 인간 신장 전구세포의 이식은 실시하지 않는다. 이 상태로 신장의 발생을 진행시켜도 신장은 퇴축되어 버린다.
또한, 도 2의 (c)에서는, 비인간 동물의 배의 초기 신장의 후신 간엽에, 호스트 유래의 신장 줄기세포를 잔존시킨 채로, 새로운 인간 신장 전구세포를 이식하고 있다. 그러나, 신장 발생 니치를 점유하고 있는 호스트 유래의 기존 세포에 의한 경합이 강해, 이식한 인간 신장 전구세포는 정착되지 않는다. 그 결과, 호스트 유래의 세포로부터 구성되는 신장이 형성된다.
이하, 본 실시 형태의 신장의 제조 방법의 각 공정에 대해 상세하게 설명한다.
(공정(i))
본 공정에서는, 비인간 동물의 배의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거한다. 비인간 동물로는, 특별히 제한은 없고, 예를 들면 돼지라도 된다. 돼지는 장기의 크기가 인간 등으로의 이식에 적합하고, 유전자 개변 기술도 확립되어 있다. 또는, 비인간 동물은 마우스라도 무방하다. 마우스는, 유전자 개변 기술이나 여러 가지 실험계가 확립되어 있기 때문에 이용하기 쉽다.
후신 간엽의 조직 특이적인 제거는, 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 유전자 재조합 기술을 사용해 실시할 수 있다.
후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 보다 구체적인 방법을, 마우스계를 예로 들어 설명한다. 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 방법으로, 예를 들면 Cre 리콤비나아제(recombinase) 활성 의존적으로 디프테리아 독소 수용체(diphteria toxin receptor, DTR)를 발현하는 iDTR 마우스와, Six2 프로모터의 하류에 Cre 리콤비나아제 유전자를 도입한 Six2-Cre 마우스를 교배해 얻어진 자손의 후신 조직에 디프테리아 독소를 접촉시키는 것을 들 수 있다.
iDTR 마우스는, 디프테리아 독소 수용체를 코딩하는 유전자의 상류에 2개의 loxP 배열에 끼워진 전사 정지 배열을 갖고 있다. 이 때문에, 그대로는 디프테리아 독소 수용체를 발현하지 않는다. 그러나, Cre 리콤비나아제에 의해 2개의 loxP 배열에 끼워진 전사 정지 배열이 제거되면, 디프테리아 독소 수용체를 발현하게 된다.
마우스는 디프테리아 독소 수용체를 갖지 않기 때문에, 본래 디프테리아 독소를 마우스의 세포에 접촉시켜도 세포가 사멸되지 않는다. 그러나, 디프테리아 독소 수용체를 발현시킨 마우스의 세포에 디프테리아 독소를 접촉시키면, 사멸하는 것으로 알려져 있다. 상기 예에서는 이 현상을 이용하고 있다.
우선, iDTR 마우스와 후신 간엽 특이적으로 Cre 리콤비나아제를 발현하는 Six2-Cre 마우스를 교배하면, 얻어진 자손 중에 후신 조직에서 조직 특이적으로 디프테리아 독소 수용체를 발현하는 마우스가 출현한다. 한편, Six2는 후신 간엽에서 특이적으로 발현하는 전사 인자이다.
계속해서, 상기 마우스의 후신에 디프테리아 독소를 접촉시키면, 후신 간엽 특이적으로 세포를 사멸시켜 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거할 수 있다. 즉, 신장 발생 니치를 비울 수 있다.
디프테리아 독소의 접촉은, 부모 마우스 또는 마우스의 태자에 디프테리아 독소를 주사하는 것 등에 의해 실시해도 된다. 또는, 마우스의 태자로부터 후신을 적출하고, 적출한 후신을 기관 배양해, 그 배지 중에 디프테리아 독소를 첨가하는 것 등에 의해 실시해도 된다. 또는, 적출한 후신을 환자의 대동맥 주위 영역이나 대망(大網)에 이식해, 환자의 체내에서 디프테리아 독소를 국소 투여하는 것 등에 의해 실시해도 된다.
전술한 방법은, 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 방법의 하나로서, 마우스에 한정하지 않고 모든 비인간 동물에 적용할 수 있다.
(공정(ⅱ))
계속해서, 본 공정에서, 후신에 인간 신장 전구세포를 이식한다. 공정(i) 및 공정(ⅱ)는 병행해 실시해도 된다. 즉, 니치를 비우는 시기와 인간 신장 전구세포를 이식하는 시기는 겹쳐도 된다. 예를 들면, 제거 약제의 첨가와 인간 신장 전구세포의 이식을 동시에 실시해도 된다.
인간 신장 전구세포로는, 예를 들면 인간 유래의 간엽계 줄기세포(MSCs)나, iPS 세포, ES 세포 등의 다능성 줄기세포로부터 분화 유도한 신장 전구세포(신장 줄기세포) 등을 들 수 있다. 인간 신장 전구세포는 환자 유래의 세포라도 되고, 환자에서의 거절 반응이 억제된 이계(異系)의 세포라도 무방하다.
인간 신장 전구세포는, 제조 후의 신장을 이식하는 대상인 환자 유래의 세포인 것이 바람직하다. 예를 들면, 인간 골수, 지방조직, 유혈중(流血中) 또는 제대혈로부터 분취된 간엽계 줄기세포 등으로부터 분화 유도한 신장 전구세포를 들 수 있다. 환자 본인의 골수, 유혈중 또는 제대혈로부터 분취되는 간엽계 줄기세포로부터 분화 유도한 신장 전구세포라도 무방하다. 분취법은 일반적인 외과적 의학 방법에 의하면 된다. 분취된 세포는, 최적 조건을 선택해, 바람직하게는 2∼5 세포 계대배양한다. 또한, 간엽계 줄기세포의 형질 전환을 억제하면서 배양을 계속하는 것을 목적으로, Cambrex BioScience 제조의 인간간엽계 줄기세포 전용 배지 키트 등을 이용해 배양해도 된다.
인간 신장 전구세포에는, 요청에 따라, 아데노 바이러스 또는 레트로 바이러스 등을 이용해 원하는 유전자를 도입해도 된다. 예를 들면, 신장 형성을 보조하는 것을 목적으로, 글리아 세포 유래 신경 영양 인자(Glial cell line-derⅳed neurotrophic factor-GDNF)를 발현하도록 유전자 도입시켜도 된다. 이는 신장이 형성되기 직전의 간엽 조직은 GDNF를 발현하게 되어, 그 수용체인 c-ret를 발현하는 요관아를 끌어들임으로써 신장 발생의 최초의 중요한 스텝을 완료시키기 때문이다.
이식의 방법으로는, 예를 들면 주사바늘 등을 이용해, 후신에 인간 신장 전구세포를 주입하면 된다. 이식하는 인간 신장 전구세포의 수는, 예를 들면 1×103∼1×106개 정도가 바람직하다. 인간 신장 전구세포의 이식은 인비트로(in-vitro)로 실행할 수도 있기 때문에, 손기술의 숙련을 요하지 않고 매우 용이하다.
인간 신장 전구세포를 이식한 결과, 제조되는 신장은 신장 발생 니치에 이식한 인간 세포로 구성된 것이 된다. 이 신장은 환자에게 이식해 기능시킬 수 있다. 신장 전구세포가 환자 본인의 세포 또는 환자와의 거절 반응이 억제된 세포이면 보다 바람직하다.
(공정(ⅲ))
계속해서, 본 공정에서, 인간 신장 전구세포를 이식한 후신의 발생을 진행시킨다. 그 결과, 이식한 인간 신장 전구세포가 분화 성숙해 신장의 일부를 형성한다. 후신 발생의 진행은, 배로부터 후신을 적출하지 않고 인간 신장 전구세포를 이식한 경우에는, 배를 다시 부모 동물의 자궁으로 되돌려 성장시키는 것이나, 전배배양하는 것 등에 의해 실시할 수 있다. 또는, 후신을 적출해 인간 신장 전구세포를 이식한 경우에는, 후신의 기관 배양을 계속함으로써 실시할 수 있다. 또는, 후신을 환자의 대동맥 주위 영역이나 대망에 이식해, 환자의 체내에서 인간 신장 전구세포를 이식한 경우에는, 그대로 후신을 성장시킴으로써 실시할 수 있다.
그 결과, 실시예에서 후술하는 바와 같이, 이식한 인간 신장 전구세포가 호스트의 발생 프로그램을 계승해, 잔존하는 요관아와 상호작용 하면서 복잡한 분화 유도를 자율적으로 진행해 사구체나 요세관을 형성한다. 또한, 호스트측의 후신 간엽을 구성하는 신장 전구세포를 완전하게 제거하기 때문에, 재생되는 사구체 및 요세관은 실질적으로 이식한 인간 신장 전구세포에 유래하는 세포만으로 구성된다.
여기에서, '실질적으로'란, 비인간 동물의 신장 발생 니치를 이용해 신장을 제조한 경우에, 이식한 인간 신장 전구세포 이외의 세포가 혼입되는 것을 배제하지 않는다는 의미이다. 환언하면, 재생되는 사구체 및 요세관은, 70 질량% 이상이 이식한 인간 신장 전구세포로 이루어지는 것이 바람직하고, 80 질량% 이상이 이식한 인간 신장 전구세포로 이루어지는 것이 보다 바람직하고, 90 질량% 이상이 이식한 인간 신장 전구세포로 이루어지는 것이 더 바람직하고, 95 질량% 이상이 이식한 인간 신장 전구세포로 이루어지는 것이 보다 더 바람직하고, 99 질량% 이상이 이식한 인간 신장 전구세포로 이루어지는 것이 특히 바람직하다.
본 실시 형태의 신장의 제조 방법은, 상기 후신의 요관아를 조직 특이적으로 제거하는 공정(ⅳ)와, 상기 후신에 인간 신장 전구세포를 이식하는 공정(ⅴ)를 더 구비하고 있어도 된다. 또한, 공정(ⅳ) 및 (ⅴ)는, 전술한 공정(i)∼(ⅲ)의 전에 실시해도 되고, 전술한 공정(i)∼(ⅲ)의 후에 실시해도 된다. 또한, 공정(ⅳ) 및 (ⅴ)의 이후에 공정(ⅲ)을 더 실시해도 된다.
이에 따라, 후신 간엽 뿐만 아니라 요관아도, 이식한 인간 신장 전구세포에 유래하는 세포로 치환할 수 있다. 그 결과, 실질적으로 이식한 인간 신장 전구세포에 유래하는 세포만으로 구성된 신장을 제조할 수 있다. 이하, 각 공정에 대해 설명한다.
(공정(ⅳ))
본 공정에 있어서, 비인간 동물의 후신의 요관아를 조직 특이적으로 제거한다. 요관아의 조직 특이적인 제거는, 요관아를 조직 특이적으로 제거할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 유전자 재조합 기술을 사용해 실시할 수 있다.
예를 들면, 전술한 iDTR 마우스와 Six2-Cre 마우스를 교배해 얻어진 마우스에서, 요관아 특이적 프로모터의 하류에 Cre-ER 단백질을 코딩하는 유전자를 더 도입한 마우스를 이용할 수 있다. 여기에서, 요관아 특이적 프로모터로는, 사이토케라틴 8의 프로모터, HoxB7의 프로모터 등을 들 수 있다.
이와 같은 마우스로는, 예를 들면 Six2-Cretg/wt사이토케라틴8-Cre-ERtg/wt의 유전자형을 갖는 iDTR 마우스, Six2-Cretg/wtHoxB7-Cre-ERtg/wt의 유전자형을 갖는 iDTR 마우스 등을 들 수 있다. 여기에서, 'tg'는 트랜스제닉(transgenic)인 것을 나타내고, 'wt'는 야생형인 것을 나타낸다.
Cre-ER 단백질이란, Cre 리콤비나아제와 변이 에스트로겐 수용체의 융합 단백질이다. 상기 마우스는 요관아의 마커인 사이토케라틴 8 또는 HoxB7의 프로모터 의존적으로 Cre-ER을 발현한다.
Cre-ER 단백질은 통상 세포질에 존재하지만, 에스트로겐 유도체인 타목시펜(tamoxifen)과 결합함으로써 핵내로 이행해, loxP 배열에 대해 재조합을 일으킨다. 이를 이용해 Cre-loxP 시스템이 작동하는 시기를 타목시펜 의존적으로 조절하는 것이 가능하다. 따라서, Cre-ER 및 Cre가 동시에 발현하고 있어도, 타목시펜 투여 여부에 의해, Cre-ER의 활성 발현을 제어할 수 있다. 여기에서, Cre-ER 대신에, Cre-ER의 개변체인 Cre-ERT, Cre-ERT2 등을 이용해도 된다.
상기 마우스는, 후신 간엽 특이적으로 디프테리아 독소 수용체를 발현한다. 따라서, 우선, 전술한 공정(i), (ⅱ), (ⅲ)을 실행하면 좋다. 구체적으로는, 상기 마우스의 배의 후신에 디프테리아 독소를 접촉시킴으로써, 후신 간엽을 제거한다. 계속해서, 전술한 방법에 의해 후신에 인간 신장 전구세포를 이식해 후신의 발생을 진행시킨다. 그 결과, 이식한 인간 신장 전구세포에 의해 후신 간엽이 재생된다.
계속해서, 이 후신에 타목시펜을 접촉시키면, 요관아 특이적으로 디프테리아 독소 수용체가 발현한다. 따라서, 이 후신에 디프테리아 독소를 접촉시킴으로써, 요관아를 조직 특이적으로 제거할 수 있다. 즉, 신장 발생 니치를 비울 수 있다.
상기 마우스의 예에서는, 후신 간엽 특이적 프로모터의 하류에 Cre 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되고, 요관아 특이적 프로모터의 하류에 Cre-ER 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되었다. 그러나, 후신 간엽 특이적 프로모터의 하류에 Cre-ER 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되고, 요관아 특이적 프로모터의 하류에 Cre 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어도 된다. 또한, Cre-ER 대신에, Cre-ER의 개변체인 Cre-ERT, Cre-ERT2 등을 이용해도 된다.
예를 들면, iDTR 마우스와 후신 간엽 특이적 프로모터의 하류에 Cre-ER 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한 마우스를 교배해 얻어진 마우스에, 요관아 특이적인 프로모터의 하류에 Cre 단백질을 코딩하는 유전자를 더 도입한 마우스를 이용해도 된다.
보다 구체적으로는, 예를 들면 Six2-Cre-ERtg/wtHoxB7-Cretg/wt의 유전자형을 갖는 iDTR 마우스 등을 들 수 있다. 여기에서, 'tg', 'wt'는 전술한 바와 같은 의미를 나타낸다.
이 마우스는 후신 간엽 특이적으로 Cre-ER을 발현한다. 또한, 요관아 특이적으로 디프테리아 독소 수용체를 발현한다. 따라서, 이 마우스를 사용하는 경우에는, 공정(i)∼(ⅲ)을 실시하기 전에, 공정(ⅳ) 및 (ⅴ)를 실시하게 된다. 구체적으로는, 마우스의 배의 후신에 디프테리아 독소를 접촉시킴으로써, 요관아를 제거할 수 있다.
전술한 방법은, 요관아를 조직 특이적으로 제거하는 방법의 하나로서, 마우스에 한정하지 않고 모든 비인간 동물에 적용할 수 있다.
(공정(ⅴ))
계속해서, 본 공정에서, 상기 후신에 인간 신장 전구세포를 이식해 요관아의 발생을 진행시킨다. 그 결과, 이식한 인간 신장 전구세포에 의해 요관아가 재생된다. 공정(ⅳ) 및 공정(ⅴ)는 병행해 실시해도 된다. 즉, 니치를 비우는 시기와 인간 신장 전구세포를 이식하는 시기는 겹쳐도 된다. 예를 들면, 제거 약제의 첨가와 인간 신장 전구세포의 이식을 동시에 실시해도 된다.
계속해서, 전술한 공정(ⅲ)을 실시해, 인간 신장 전구세포를 이식한 배(후신)의 발생을 진행시킨다. 그 결과, 이식한 인간 신장 전구세포가 분화 성숙해 신장의 일부를 형성한다.
인간 신장 전구세포로는 전술한 바와 같은 것을 이용할 수 있다. 여기에서, 인간 신장 전구세포가 전술한 후신 간엽의 재생에서의 인간 신장 전구세포와 유래가 같은 경우에는, 제조되는 신장은, 사구체, 요세관 뿐만이 아니라, 집합관, 요관도 유래가 같은 세포로 구성된 것이 된다.
이 때문에, 인간 신장 전구세포가 환자 유래의 세포 또는 환자와의 거절 반응이 억제된 세포이면, 환자에게 이식한 경우, 보다 거절 반응이 적은 신장을 제조할 수 있다.
예를 들면, Six2-Cre-ERtg/wtHoxB7-Cretg/wt의 유전자형을 갖는 iDTR 마우스를 이용해 공정(ⅳ) 및 (ⅴ)를 먼저 실시한 경우에는, 계속해서 전술한 공정(i), (ⅱ), (ⅲ)을 실시해도 된다. 즉, 이식한 인간 신장 전구세포에 의해 요관아가 재생된 마우스의 후신에 타목시펜을 접촉시키면, 이번에는 후신 간엽 특이적으로 디프테리아 독소 수용체가 발현한다. 따라서, 이 후신에 디프테리아 독소를 접촉시킴으로써, 이번에는 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거할 수 있다. 즉, 신장 발생 니치를 비울 수 있다.
본 실시 형태의 신장의 제조 방법에 있어서, 후신 간엽의 제거와 요관아의 제거는 어느 것을 먼저 실시해도 된다. 요관아의 제거를 먼저 실시하는 경우에는, 전술한 Cre-loxP 시스템을 적절하게 개변해도 된다.
[신장]
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 전술한 제조 방법에 의해 제조된 신장을 제공한다. 본 실시 형태의 신장은, 호스트인 비인간 동물의 신장 발생 니치 및 발생 프로그램을 이용해, 원하는 인간 신장 전구세포로부터 제조된다. 따라서, 환자에게 이식해 기능시킬 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 실시 형태의 신장은, 후신 간엽 혹은 요관아, 또는 이들 모두가, 이식한 인간 신장 전구세포로 치환되어 형성되고 있다. 이 때문에, 특히, 후신 간엽 및 요관아 모두가 이식한 인간 신장 전구세포로 치환된 신장인 경우에는, 상기 신장은 실질적으로 이식한 인간 신장 전구세포에 유래하는 세포만으로 구성되어 있다. 이 때문에, 신장을 구성하는 세포를 특정하는 것에 의해, 전술한 제조 방법에 의해 제조된 신장인지, 이식한 인간 신장 전구세포를 조제하는 근원이 된 환자 본래의 신장인지를 특정하는 것이 곤란하다.
상기 신장은, 비인간 동물 유래의 세포와 인간 세포를 포함하고, 상기 인간 세포의 비율이 70 질량% 이상, 보다 바람직하게는 80 질량% 이상, 더 바람직하게는 90 질량% 이상, 보다 더 바람직하게는 95 질량% 이상, 특히 바람직하게는 99 질량% 이상인 것이라도 된다. 여기에서, 비인간 동물로는, 전술한 바와 같이, 예를 들면 돼지, 마우스 등을 들 수 있다. 이와 같은 신장은, 전술한 신장의 제조 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 실시 형태의 신장은, 예를 들면 전술한 제조 방법에 의해, 후신 간엽이 이식한 인간 신장 전구세포로 치환되어 형성된 것이라도 된다. 이 경우, 요관아에 유래하는 집합관이나 요관은, 호스트인 비인간 동물에 유래하는 것이 된다.
또는, 본 실시 형태의 신장은, 전술한 제조 방법에 의해, 요관아가 이식한 인간 신장 전구세포로 치환되어 형성된 것이라도 된다. 이 경우, 후신 간엽에 유래하는 사구체나 요세관은, 호스트인 비인간 동물에 유래하는 것이 된다.
또는, 본 실시 형태의 신장은, 전술한 제조 방법에 의해, 후신 간엽 및 요관아 모두가 이식한 인간 신장 전구세포로 치환되어 형성된 것이라도 된다. 이 경우, 사구체, 요세관, 집합관, 요관의 실질적으로 전부가 이식한 인간 신장 전구세포에 유래하는 것이 된다. 그러나, 형성된 신장에 호스트인 비인간 동물에 유래하는 세포가 잔존하는 경우가 있다.
[이식용 장기]
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 전술한 어느 하나의 신장, 요관 및 방광을 구비하는 이식용 장기를 제공한다.
이전에 본 발명자들은, 재생 신장의 이식에 의해 뇨를 생성할 수는 있어도, 생성한 뇨를 배설하지 못하고 수신증(水腎症)을 일으켜, 신장 기능을 장기간 지속할 수 없다는 것을 알아냈다. 또한, 본 발명자들은, 신장 뿐만이 아니라, 신장, 요관 및 방광을 구비하는 구조체를 이식함으로써, 뇨의 생성 뿐만 아니라, 생성한 뇨를 배설하는 것이 가능해진다는 것을 알아냈다.
따라서, 본 실시 형태의 이식용 장기는, 신장, 요관 및 방광을 구비하기 때문에, 환자에게 이식한 경우에도, 뇨의 생성 뿐만 아니라, 생성한 뇨를 배설할 수 있어 신장 기능을 장시간 지속할 수 있다.
본 실시 형태의 이식용 장기는, 환자의 대동맥 주위 영역이나 대망에 이식해도 되고, 예를 들면 환자의 비장(비동맥 주변)에 이식해도 된다. 또한, 상기 이식용 장기를 구성하는 방광은, 환자의 요관에 접속되어도 된다. 이에 따라, 신장, 제1 요관, 제1 방광, 제2 요관 및 제2 방광이 이 순서로 접속된 장기 구조체가 형성된다. 여기에서, 제2 요관과 제2 방광은 환자가 본래 갖고 있는 요관 및 방광이다.
이와 같은 장기 구조체를 형성함으로써, 전술한 이식용 장기를 구성하는 재생 신장이 생성한 뇨를 배설하는 것이 더욱 용이하게 된다.
본 실시 형태의 이식용 장기에 있어서, 상기 요관(제1 요관) 및 상기 방광(제1 방광)은, 전술한 신장의 제조 방법에서의 비인간 동물 유래라도 무방하다. 요관이나 방광은 일반적으로 면역원성이 낮기 때문에, 요관이나 방광이 비인간 동물 유래라도 크게 문제되지 않는다. 여기에서, 비인간 동물은 전술한 신장의 제조 방법에서 스캐폴드가 되는 신장 발생 니치를 제공한 호스트 동물이다. 즉, 본 실시 형태의 이식용 장기는, 전술한 제조 방법에 의해 형성된 신장과, 이것에 이어지는 요관과, 이것에 이어지는 방광으로 구성되어 있어도 된다.
본 실시 형태의 이식용 장기는, 신장, 요관 및 방광이 접속된 상태로 비인간 동물로부터 적출해 보존·유통시킬 수 있다. 여기에서, 이식용 장기를 동결해 보존·유통시켜도 된다. 또는, 본 실시 형태의 이식용 장기는, 본 실시 형태의 이식용 장기를 갖는 비인간 동물의 형태로 유통시킬 수도 있다.
[유전자 개변 비인간 동물]
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 후신의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거할 수 있는 유전자 개변 비인간 동물을 제공한다. 유전자 개변 비인간 동물은, 예를 들면 유전자 개변 마우스라도 되고, 유전자 개변 돼지라도 된다. 또한, 유전자 개변의 방법은 특별히 한정되지 않고, ES 세포를 이용한 방법이라도 되고, 게놈 편집을 이용한 방법이라도 된다.
본 실시 형태의 유전자 개변 비인간 동물을 이용해 전술한 신장의 제조 방법을 실시함으로써, 인간에게 이식해 기능시키는 것이 가능한 신장을 제조할 수 있다. 따라서, 본 실시 형태의 유전자 개변 비인간 동물은, 전술한 신장의 제조용이라고 할 수 있다. 또는, 본 실시 형태의 유전자 개변 비인간 동물은, 전술한 이식용 장기의 제조용이라고 할 수 있다.
본 실시 형태의 유전자 개변 비인간 동물의 보다 구체적인 예로는, 예를 들면 전술한 Cre 리콤비나아제 활성 의존적으로 디프테리아 독소 수용체(DTR)를 발현하는 구조체(construct)와, 후신 간엽 특이적인 프로모터의 하류에 Cre 리콤비나아제 유전자를 접속한 구조체를 갖는 유전자 개변 비인간 동물을 들 수 있다. 이 시스템은 본래 디프테리아 독소에 감수성이 없는 비인간 동물에 적용할 수 있다. 이와 같은 비인간 동물로는, 예를 들면 마우스를 들 수 있다.
여기에서, 후신 간엽 특이적인 프로모터로는, 예를 들면 전사 인자인 Six2 프로모터 등을 들 수 있다. 이 유전자 개변 비인간 동물은, 후신 간엽 특이적으로 Cre 리콤비나아제를 발현한다. 그 결과, 후신 간엽 특이적으로 디프테리아 독소 수용체를 발현한다. 따라서, 디프테리아 독소를 접촉시키면 후신 간엽을 특이적으로 사멸시켜 제거할 수 있다.
여기에서, Cre 리콤비나아제로서, 타목시펜의 존재하에서 Cre 리콤비나아제를 핵내로 이행시킬 수 있는 Cre-ER 등을 이용해도 된다. 이 경우, 타목시펜을 투여한 경우에만 Cre 리콤비나아제가 핵내로 이행해, 디프테리아 독소 수용체를 발현시킬 수 있다.
또는, 본 실시 형태의 유전자 개변 비인간 동물은, Cre 리콤비나아제 활성 의존적으로 디프테리아 독소(diphteria toxin A subunit, DT-A)를 발현하는 구조체와, 후신 간엽 특이적인 프로모터의 하류에 Cre 리콤비나아제 유전자를 접속한 구조체를 갖는 유전자 개변 비인간 동물을 들 수 있다. 이 시스템은 본래 디프테리아 독소에 감수성이 있는 비인간 동물에 적용할 수 있다. 이와 같은 비인간 동물로는, 예를 들면 돼지를 들 수 있다.
여기에서, 후신 간엽 특이적인 프로모터로는, 예를 들면 전사 인자인 Six2 프로모터 등을 들 수 있다. 이 유전자 개변 비인간 동물은 후신 간엽 특이적으로 Cre 리콤비나아제를 발현한다. 그 결과, 후신 간엽 특이적으로 디프테리아 독소를 발현해, 사멸시켜 제거할 수 있다.
여기에서, Cre 리콤비나아제로서, 타목시펜의 존재하에서 Cre 리콤비나아제를 핵내로 이행시킬 수 있는 Cre-ER 등을 이용해도 된다. 이 경우, 타목시펜을 투여한 경우에만 Cre 리콤비나아제가 핵내로 이행해 디프테리아 독소를 발현시킬 수 있다. 또한, Cre-ER 대신에, Cre-ER의 개변체인 Cre-ERT, Cre-ERT2 등을 이용해도 된다.
또한, 본 실시 형태의 비인간 동물은, 후신의 요관아를 조직 특이적으로 제거할 수 있도록 유전자 개편되어 있어도 된다. 구체적으로는, 예를 들면 Cre 리콤비나아제 활성 의존적으로 디프테리아 독소 수용체(DTR)를 발현하는 구조체, 및 후신 간엽 특이적인 프로모터의 하류에 Cre 리콤비나아제 유전자를 접속한 구조체 외에, 요관아 특이적인 프로모터의 하류에 Cre 리콤비나아제 유전자를 더 접속한 구조체를 갖는 유전자 개변 비인간 동물을 들 수 있다. 이 시스템은 본래 디프테리아 독소에 감수성이 없는 비인간 동물에 적용할 수 있다. 이와 같은 비인간 동물로는, 예를 들면 마우스를 들 수 있다.
여기에서, 요관아 특이적인 프로모터로는, 예를 들면 사이토케라틴 8의 프로모터, HoxB7의 프로모터 등을 들 수 있다. 이 유전자 개변 비인간 동물은, 요관아 특이적으로 Cre 리콤비나아제를 발현한다. 그 결과, 요관아 특이적으로 디프테리아 독소 수용체를 발현한다. 따라서, 디프테리아 독소를 접촉시키면 요관아를 특이적으로 사멸시켜 제거할 수 있다. 여기에서, Cre 리콤비나아제로서 Cre-ER, Cre-ERT, Cre-ERT2 등을 이용해도 된다.
본 실시 형태의 유전자 개변 비인간 동물에 있어서, 세포를 사멸시키는 시스템은 대상으로 하는 비인간 동물의 종에 적용할 수 있고, 조직 특이적, 시기 특이적으로 작동시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한없이 이용할 수 있다.
따라서, 디프테리아 독소 또는 디프테리아 독소 수용체 이외의 시스템에 의해 세포를 사멸시키는 구성이라도 된다. 예를 들면, 조직 특이적인 프로모터의 하류에서, 간시클로비르(Ganciclovir)의 투여에 의해 아포토시스(apoptosis)를 유도하는 헤르페스 바이러스 유래 티미딘키나아제 유전자(HSV-TK)를 발현시키는 시스템을 들 수 있다. HSV-TK를 발현시킨 세포는 간시클로비르 투여하에서 세포사가 유도된다.
또는, AP20187의 투여에 의해, 카스파제 3, 카스파제 8, 카스파제 9 등을 이량체화시켜 아포토시스를 유도하는 시스템을 이용해도 된다.
본 실시 형태의 유전자 개변 비인간 동물은, 후신의 후신 간엽 또는 요관아를 조직 특이적으로 제거할 수 있는 한 전술한 것으로 한정되지 않고, 여러 가지 유전자 재조합 시스템이나, 유전자 재조합 시스템의 조합을 갖고 있어도 된다.
[신장 제조용 키트]
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 비인간 동물의 후신과, 상기 배의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 약제와, 인간 신장 전구세포를 구비하는 신장 제조용 키트를 제공한다.
본 실시 형태의 키트를 이용해, 전술한 신장의 제조 방법을 실시함으로써 신장을 제조할 수 있다. 비인간 동물로는, 전술한 바와 같이, 돼지, 마우스 등을 들 수 있다. 비인간 동물의 후신은, 배의 형태로 제공되어도 되고, 태자를 포함하는 부모 동물의 형태로 제공되어도 된다. 또한, 후신은 이후에 방광이 되는 총배출강에 접속된 상태라도 무방하다. 이 경우, 후신이 신장 및 요관을 형성하고, 총배출강이 방광을 형성하고, 이들 신장, 요관, 방광이 접속된 상태가 된다. 그 결과, 전술한 바와 같이, 제조된 신장은, 뇨를 생성할 뿐만 아니라, 생성한 뇨를 배설하는 것이 가능해진다.
본 실시 형태의 키트에 있어서, 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 약제로는, 예를 들면 전술한 디프테리아 독소 등을 들 수 있다. 이 경우, 비인간 동물로는, Cre-loxP 시스템 등에 의해, 후신 간엽 특이적으로 디프테리아 독소 수용체를 발현하는 비인간 동물을 들 수 있다.
또는, 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거할 수 있는 한, 전술한 것 이외의 여러 가지 컨디셔널 녹아웃 시스템(conditional knock-out system)도 이용할 수 있다. 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 약제로는, 사용하는 시스템에 따라, 디프테리아 독소(iDTR 시스템), 타목시펜(Cre-ERT2 시스템), 타크로리무스(tacrolimus, Mos-iCsp3 시스템), 독시사이클린, 테트라사이클린(Tet-on/off 시스템), 간시클로비르(헤르페스 바이러스 유래 티미딘키나아제 유전자 시스템) 등을 사용할 수 있다.
이들 컨디셔널 녹아웃 시스템은, 게놈 편집 기술 등을 이용해 제작할 수 있고, 비인간 동물의 신장 발생 니치에서 조직 특이적으로 세포를 제거할 수 있다. 또한, 세포를 제거하는 시기를 약제의 투여에 의해 조절할 수 있다. 이들 시스템을 이용함으로써 표적 세포의 제거를 시공간 특이적으로 제어해, 신장 재생에 적합한 살아있 스캐폴드를 구축할 수 있다.
후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 약제의 투여 방법은 특별히 제한되지 않고, 사용하는 약제에 따라 적절하게 선택하면 된다. 예를 들면, 인비트로(in-vitro)로 기관 배양 등의 배지에 첨가하는 것, 인비보(in-vivo)로 국소 투여, 복강내 투여, 정맥내 주사, 경구 투여하는 것 등을 들 수 있다.
또한, 인간 신장 전구세포로는, 예를 들면 환자 유래의 신장 전구세포 등을 들 수 있다. 인간 신장 전구세포로는, 환자 유래의 iPS 세포, 간엽계 줄기세포(MSCs) 등으로부터 분화 유도한 신장 전구세포, 환자에서의 거절 반응이 억제된 이계(異系)의 iPS 세포나 ES 세포 등의 다능성 줄기세포로부터 분화 유도한 신장 전구세포 등을 들 수 있다. 상기 이계의 iPS 세포는, 예를 들면 iPS 세포 뱅크로부터 입수할 수 있다.
신장의 제조는 환자의 체외에서 실시하고, 그 후 환자의 대동맥 주위 영역이나 대망에 이식해도 된다. 또는, 신장의 제조는 환자의 체내에서 실시해도 된다. 보다 상세하게는, 우선, 비인간 동물의 후신을 환자의 대동맥 주위 영역이나 대망에 이식하고, 환자의 체내에서 후신의 니치를 비워 인간 신장 전구세포를 이식해 신장을 제조해도 된다. 이 방법에 의하면, 재생된 신장으로 끌어들여지는 혈관계가 환자의 혈관이 되어, 기능적인 신장을 구축할 수 있다는 점에서 유리하다.
본 실시 형태의 키트는, 상기 후신의 요관아를 조직 특이적으로 제거하는 약제를 더 구비하고 있어도 된다. 이에 따라, 후신 간엽에 유래하는 조직 뿐만이 아니라, 요관아에 유래하는 조직도 이식한 인간 신장 전구세포에 유래하는 신장을 제조하는 것이 가능해진다.
요관아를 조직 특이적으로 제거하는 약제로는, 예를 들면 전술한 타목시펜 및 디프테리아 독소의 조합 등을 들 수 있다. 이 경우, 비인간 동물로는, Cre-loxP 시스템 등에 의해, 후신 간엽 특이적으로 디프테리아 독소 수용체를 발현함과 함께, 타목시펜의 투여에 의해 요관아 특이적으로 디프테리아 독소 수용체를 발현하는 비인간 동물을 들 수 있다.
또는, 전술한 여러 가지 컨디셔널 녹아웃 시스템 중 어느 하나를 사용해 요관아를 제거할 수도 있다. 이 경우, 요관아를 조직 특이적으로 제거하는 약제는, 채용한 시스템에 부합하는 적절한 약제가 된다.
전술한 여러 가지 컨디셔널 녹아웃 시스템을 조합함으로써, 복수의 대상 조직을 임의의 시기에 제거하는 것이 가능해진다. 예를 들면, 타목시펜을 이용해 요관아를 조직 특이적으로 제거한 후에, 타크로리무스를 이용해 후신 간엽을 단계적으로, 조직 특이적으로 제거할 수 있다. 그 결과, 거의 모든 신장 조직을 이식한 인간 신장 전구세포에 유래하는 것으로 할 수 있다.
[신장 재생용 의약]
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 비인간 동물의 후신과, 상기 후신의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 약제와, 인간 신장 전구세포를 구비하는 신장 재생용 의약을 제공한다.
본 실시 형태의 의약에 의하면, 환자의 체내에서 전술한 신장의 재생을 실시할 수 있다. 본 실시 형태의 의약은 다음과 같이 하여 이용할 수 있다. 우선, 비인간 동물의 후신을 환자의 대동맥 주위 영역이나 대망에 이식한다. 비인간 동물의 후신으로는, 전술한 신장 제조용 키트에서의 것과 같은 것을 이용할 수 있다.
계속해서, 환자에게 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 약제를 투여한다. 약제로는, 전술한 신장 제조용 키트에서의 것과 같은 것을 이용할 수 있다. 약제의 투여는, 사용하는 약제에 따라 적절하게 국소 투여, 복강내 투여, 정맥내 주사, 경구 투여 등에 의해 실시하면 된다.
계속해서, 인간 신장 전구세포를 이식한다. 인간 신장 전구세포로는, 예를 들면 환자 유래의 iPS 세포, 간엽계 줄기세포(MSCs) 등으로부터 분화 유도한 신장 전구세포, 환자에서의 거절 반응이 억제된 이계의 iPS 세포나 ES 세포로부터 분화 유도한 신장 전구세포 등을 들 수 있다. 그 후, 이식한 후신의 발생을 진행시킴으로써, 환자의 체내에서 이식한 인간 신장 전구세포에 의해 구성된 신장이 제조(재생)된다.
본 실시 형태의 의약에 의하면, 재생된 신장으로 끌어들여지는 혈관계가 환자의 혈관이 되어, 기능적인 신장을 구축할 수 있다는 점에서 유리하다.
상기 신장 재생용 의약은, 후신의 요관아를 조직 특이적으로 제거하는 약제를 더 구비하고 있어도 된다. 이에 따라, 후신 간엽에 유래하는 조직 뿐만이 아니라 요관아에 유래하는 조직도 이식한 인간 신장 전구세포에 유래하는 신장을 재생할 수 있다. 후신의 요관아를 조직 특이적으로 제거하는 약제로는, 전술한 신장 제조용 키트에서의 것과 같은 것을 이용할 수 있다.
[그 외의 실시 형태]
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 전술한 신장, 요관 및 방광을 구비하는 이식용 장기를 환자의 체내에 이식하는 공정(a)와, 이식으로부터 소정 기간 후에, 상기 이식용 장기의 방광과 환자의 요관을 접속하는 공정(b)를 구비하는 신장의 이식 방법을 제공한다.
본 실시 형태의 방법은, 신장 질환의 치료 방법이라고도 할 수 있다. 이식용 장기로는 전술한 것을 이용할 수 있다.
상기 공정(a)에서 이식한 이식용 장기를 소정 기간 방치함으로써, 이식용 장기가 성장해 요산생(尿産生)을 개시한다. 소정 기간은, 이식용 장기가 충분히 성장하고, 또한, 수신증을 일으키기 전까지의 기간이면 된다. 소정 기간은 환자의 증상 등에 따라 적절하게 조정하면 되지만, 예를 들면 1∼10주간이라도 된다.
계속해서, 이식으로부터 소정 기간 후(1∼10주일 후)에 공정(b)를 실시한다. 공정(b)에서, 이식용 장기의 방광과 환자의 요관을 접속한다. 여기에서, 환자의 요관은 환자의 방광에 연결되어 있다.
이식용 장기의 방광과 환자의 방광을 환자의 요관으로 접속함으로써, 이식용 장기가 산생한 뇨를 환자의 방광으로 배설시킬 수 있다. 보다 상세하게는, 이식용 장기의 신장이 산생한 뇨가 이식용 장기의 요관을 통해 이식용 장기의 방광까지 배설되고, 계속해서 이식용 장기의 방광으로부터 환자의 요관을 통해 환자의 방광까지 배설된다.
본 실시 형태의 방법에 의해, 이식용 장기의 신장이 산생한 뇨를 환자의 방광으로 배설시킬 수 있다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 비인간 동물의 후신 및 총배출강을 환자의 체내에 이식하는 공정(a1)과, 상기 후신의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 공정(a2)와, 상기 후신에 인간 신장 전구세포를 이식하는 공정으로서, 이식한 인간 상기 신장 전구세포가 분화 성숙해 신장의 일부를 형성하고, 상기 총배출강이 분화 성숙해 방광을 형성하고, 상기 방광은 요관을 개재해 상기 신장과 접속하는 공정(a3)과, 상기 인간 신장 전구세포의 이식으로부터 소정 기간 후에, 상기 방광과 환자의 요관을 접속하는 공정(b)를 구비하는 신장 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 실시 형태의 방법에 있어서는, 신장의 제조(재생)를 환자의 체내에서 실시한다. 공정(a2) 및 공정(a3)은 병행해 실시해도 된다. 즉, 니치를 비우는 시기와 인간 신장 전구세포를 이식하는 시기는 겹쳐도 된다. 예를 들면, 제거 약제의 첨가와 인간 신장 전구세포의 이식을 동시에 실시해도 된다.
상기 공정(a3)에서의 인간 신장 전구세포의 이식으로부터 소정 기간이 경과하면, 이식한 인간 신장 전구세포가 신장을 형성해 요산생을 개시한다. 소정 기간은, 신장 및 방광이 충분히 성장하고, 또한, 수신증을 일으키기 전까지의 기간이면 된다. 소정 기간은, 환자의 증상 등에 따라 적절하게 조정하면 되지만, 예를 들면 2∼4주간이라도 된다.
계속해서, 이식으로부터 소정 기간 후(2∼4주일 후)에 공정(b)를 실시한다. 공정(b)에서, 총배출강이 분화 성숙해 형성된 방광과 환자의 요관을 접속한다. 여기에서, 환자의 요관은 환자의 방광에 연결되어 있다.
본 실시 형태의 치료 방법은, 상기 후신의 요관아를 조직 특이적으로 제거하는 공정(a2')를 더 구비하고 있어도 된다. 이에 따라, 후신 간엽 뿐만이 아니라 요관아도 이식한 인간 신장 전구세포에 유래하는 세포로 치환할 수 있다. 그 결과, 실질적으로 이식한 인간 신장 전구세포에 유래하는 세포만으로 구성된 신장을 제조할 수 있다.
공정(a2')를 실시하는 경우, 공정(a2) 및 공정(a2')는 어느 것을 먼저 실시해도 무방하지만, 한쪽을 실시한 후 다른 쪽을 실시하기까지 4∼7일간의 기간을 두는 것이 바람직하다. 그 동안에 이식한 인간 신장 전구세포가 발생 프로그램을 진행시켜 분화한다.
공정(a2) 및 공정(a3), 또는 공정(a2') 및 공정(a3)은 병행해 실시해도 된다. 즉, 니치를 비우는 시기와 인간 신장 전구세포를 이식하는 시기는 겹쳐도 된다. 예를 들면, 제거 약제의 첨가와 인간 신장 전구세포의 이식을 동시에 실시해도 된다.
예를 들면, 우선, 공정(a2) 및 공정(a3)을 동시에 실시하고, 소정 기간 후, 공정(a2') 및 공정(a3)을 동시에 실시해도 된다. 또는, 우선, 공정(a2') 및 공정(a3)을 동시에 실시하고, 소정 기간 후, 공정(a2) 및 공정(a3)을 동시에 실시해도 된다.
실시예
이하, 실험예를 들어 본 발명을 더 상세히 설명하지만, 본 발명은 이하의 실험예로 한정되는 것은 아니다.
[실험예 1]
(마우스배에서의 후신 간엽의 조직 특이적인 제거)
Cre 리콤비나아제 활성 의존적으로 디프테리아 독소 수용체(DTR)를 발현하는 iDTR 마우스와, Six2 프로모터의 하류에 Cre 리콤비나아제 유전자를 도입한 Six2-Cre 마우스를 교배했다. 한편, Six2는 후신 간엽에서 특이적으로 발현하는 전사 인자이다.
계속해서, 태생 13일째의 F1 마우스로부터, 후신 간엽 특이적으로 디프테리아 독소 수용체를 발현한 것을 선택해 후신을 적출했다. 적출한 후신을, 통상적 방법에 따라 기관 배양하고, 배지에 디프테리아 독소를 첨가했다. 그 결과, 디프테리아 독소 수용체를 발현한, 후신 간엽의 Six2 양성 신장 전구세포가 사멸했다. 이에 따라, 후신 간엽이 조직 특이적으로 제거되었다.
[실험예 2]
(신장 전구세포의 이식)
야생형 마우스 유래의 신장 전구세포를, 통상적 방법에 따라 후신으로부터 조제하고, 세포 해리 시약을 이용해 단일 세포로 해리했다. 계속해서, 신장 전구세포 1×105개를, 실험예 1에서 조제한, 후신 간엽이 조직 특이적으로 제거된 후신 조직에 이식했다. 그 후, 후신 조직의 기관 배양을 계속했다.
[실험예 3]
(신장 조직의 면역 염색 1)
실험예 2의 후신 조직을, 신장 전구세포의 이식으로부터 5일간 배양 후에 4% 파라포름알데히드 고정해 조직 절편 표본을 제작했다. 계속해서, 후신 간엽의 마커인 Six2 및 요관아의 마커인 사이토케라틴 8을 각각 면역 염색했다. 도 3은 면역 염색의 결과를 나타낸 형광 현미경 사진이다. 배율은 100배이다. 도 3에서, Six2 양성 세포는 이식한 신장 전구세포 유래이다. 또한, 사이토케라틴 8 양성 세포는 호스트 동물(실험예 1의 F1 마우스) 유래이다.
그 결과, 실험예 1의 F1 마우스 유래의 요관아를 스캐폴드로 하여, 실험예 2에서 이식한 신장 전구세포가 호스트의 발생 프로그램을 계승하고, 복잡한 분화 유도를 자율적으로 진행해 후신 간엽을 형성한 것이 확인되었다. 이 결과는, 전술한 방법에 의해, 후신 간엽을 구성하는 세포를 이식한 신장 전구세포 유래의 세포로 치환할 수 있다는 것을 나타낸다.
[실험예 4]
(신장 조직의 면역 염색 2)
녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 조합한 트랜스제닉 마우스(GFP tg 마우스) 유래의 신장 전구세포를, 통상적 방법에 따라 후신으로부터 조제하고, 세포 해리 시약을 이용해 단일 세포로 해리했다. 계속해서, 신장 전구세포 1×105개를, 실험예 1과 동일하게 조제한, 후신 간엽이 조직 특이적으로 제거된 후신 조직에 이식했다. 그 후, 후신 조직의 기관 배양을 계속했다.
계속해서, 신장 전구세포의 이식으로부터 7일간 배양 후에 4% 파라포름알데히드 고정해 조직 절편 표본을 제작했다. 계속해서, 요관아의 마커인 사이토케라틴 8 및 사구체의 마커인 Wilms tumor suppressor protein-1(WT1)을 각각 면역 염색했다. 계속해서, 이식 세포가 발현하고 있는 GFP, 면역 염색한 사이토케라틴 8 및 WT1의 형광을 형광 현미경으로 관찰했다. 도 4는 면역 염색의 결과를 나타낸 형광 현미경 사진이다. 배율은 200배이다. 도 4에서, GFP 양성 세포 및 WT1 양성 세포는 이식한 신장 전구세포 유래이다. 또한, 사이토케라틴 8 양성 세포는 호스트 동물(실험예 1의 F1 마우스) 유래이다.
그 결과, 이식한 GFP tg 마우스 유래의 신장 전구세포가 사구체나 요세관을 형성한 것이 확인되었다. 이 결과는, 전술한 방법에 의해, 신장 전구세포로부터 기능적인 신장 조직을 형성할 수 있다는 것을 나타낸다.
[실험예 5]
(마우스 생체내에서의 신장의 재생)
야생형 마우스의 대동맥 주위 영역에, iDTR 마우스와 Six2-Cre 마우스를 교배해 얻어진, 후신 조직에서 조직 특이적으로 디프테리아 독소 수용체를 발현하는 태자의 후신 및 총배출강을 이식했다.
계속해서, 디프테리아 독소를 투여함으로써 상기 후신의 후신 간엽을 제거하고, GFP tg 마우스 유래의 신장 전구세포 1×105개를 이식했다. 계속해서, 후신을 이식한 마우스를 7일간 사육했다.
계속해서, 상기 마우스를 개복해, 이식한 후신으로부터 형성된 신장(재생 신장)을 관찰했다.
도 5의 (a)는 재생 신장이 존재하는 영역을 촬영한 사진이다. 배율은 15배이다. 우측 상부에 야생형 마우스(호스트)의 신장이 보인다. 중앙 부근의 점선으로 둘러싼 영역에 재생 신장이 존재한다.
도 5의 (b)는 도 5의 (a)와 동일 시야에서, GFP의 형광을 관찰한 결과를 나타낸 사진이다. 배율은 15배이다. 그 결과, 이식한 신장 전구세포에 유래하는 GFP의 형광이 관찰되었다. 이 결과는, 마우스의 체내에서 인비보로 신장의 재생이 가능했다는 것을 나타낸다.
도 6의 (a)는, 상기 재생 신장을 4% 파라포름알데히드 고정해 제작한 조직 절편 표본의 광학 현미경 사진이다. 배율은 400배이다. 도 6의 (a) 중 화살표로 가리키는 부분에 재생된 사구체가 관찰되었다.
도 6의 (b)는, 도 6의 (a)와 동일 시야에서, GFP의 형광을 관찰한 결과를 나타낸 형광 현미경 사진이다. 배율은 400배이다. 도 6의 (b) 중 화살표로 가리키는 부분에 GFP의 형광이 관찰되었다. 이 결과는, 재생된 사구체가 이식한 신장 전구세포에 유래하는 것임을 나타낸다.
이상의 결과로부터, 인비보에서도 신장의 재생을 실시할 수 있는 것이 분명해졌다.
[실험예 6]
(마우스배의 후신 간엽 및 요관아의 쌍방의 치환)
《요관아의 조직 특이적인 제거》
본 실험예에서는, Six2-Cre-ERtg/wtHoxB7-Cretg/wt의 유전자형을 갖는 iDTR 마우스를 이용했다. 우선, 실험예 1과 마찬가지로 하여, 마우스배로부터 후신을 적출해 기관 배양했다. 계속해서, 배지에 디프테리아 독소를 첨가해 요관아를 조직 특이적으로 제거했다.
《신장 전구세포의 이식》
계속해서, 요관아를 제거한 마우스 후신에, 실험예 2와 마찬가지로 하여, 야생형 마우스 유래의 신장 전구세포 1×105개를 이식했다. 그 후, 후신의 기관 배양을 5일간 계속했다.
《후신 간엽의 조직 특이적인 제거》
계속해서, 기관 배양의 배지에 타목시펜 및 디프테리아 독소를 첨가했다. 그 결과, 후신 간엽 특이적인 마커인 Six2 발현 세포에서, Cre-ER가 핵내로 이행해 재조합을 일으켜 디프테리아 독소 수용체를 발현했다. 그 결과, 후신 간엽의 세포가 디프테리아 독소에 의해 사멸했다. 이에 따라, 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거했다.
《신장 전구세포의 이식》
계속해서, 후신 간엽을 제거한 마우스 후신에, 실험예 2와 마찬가지로 하여, 야생형 마우스 유래의 신장 전구세포 1×105개를 다시 이식했다. 그 후, 후신의 기관 배양을 3∼5일간 계속했다.
《면역 염색》
계속해서, 기관 배양한 후신을 4% 파라포름알데히드 고정해 조직 절편 표본을 제작했다. 계속해서, 요관아를 염색하는 항카르빈딘 항체(Anti-Calbindin Antibody)로 면역 염색해 형광 현미경으로 관찰했다.
도 7의 (a)는, 양성 대조의 후신의 대표적인 사진이다. 양성 대조에서는, 요관아 제거 단계에서 디프테리아 독소를 첨가하지 않고, 또한, 신장 전구세포도 이식하지 않았다. 따라서, 양성 대조에서는 본래의 요관아에 유래하는 조직이 유지되고 있었다.
도 7의 (b)는, 음성 대조의 후신의 대표적인 사진이다. 음성 대조에서는, 요관아 제거 단계에서 디프테리아 독소를 첨가하고, 또한, 신장 전구세포를 이식하지 않았다. 따라서, 음성 대조에서는, 요관아가 조직 특이적으로 제거되고 신장 전구세포는 이식되지 않았기 때문에, 요관아가 결실되어 있었다.
도 7의 (c)는, 시험군의 후신의 대표적인 사진이다. 시험군에서는, 요관아가 조직 특이적으로 제거되고 신장 전구세포가 이식되었다. 그 결과, 이식된 신장 전구세포에 의해 요관아가 치환되어, 요관아에 유래하는 조직의 성장이 인정되었다.
하기 표 1은, 양성 대조(n=5), 음성 대조(n=5) 및 시험군(n=5)의 후신에서의 요관아의 선단의 수를 계측한 결과이다.
양성 대조 음성 대조 시험군
요관아의 선단의 수
(평균치±표준 편차)		 145.2±22.2 73.2±29.2 120.8±23.8
그 결과, 음성 대조에서는, 양성 대조와 비교해 요관아의 선단의 수의 감소가 인정되었다. 이에 대해, 시험군에서는, 양성 대조와 동일한 정도의 요관아의 선단의 수가 계측되었다. 이 결과는, 본 실험예의 방법에 의해, 후신 간엽 및 요관아의 쌍방을 이식한 신장 전구세포로 치환할 수 있다는 것을 나타낸다.
〈산업상 이용가능성〉
본 발명에 의하면, 신장 전구세포로부터 신장을 제작하는 기술을 제공할 수 있다.

Claims (16)

  1. 비인간 동물의 후신의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 공정과,
    상기 후신에 인간 신장 전구세포를 이식하는 공정과,
    상기 후신의 발생을 진행시키는 공정으로서, 이식한 상기 인간 신장 전구세포가 분화 성숙해 신장의 일부를 형성하는 공정을 구비하는, 신장의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 후신의 요관아를 조직 특이적으로 제거하는 공정과,
    상기 후신에 인간 신장 전구세포를 이식하는 공정을 더 구비하는, 신장의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 비인간 동물이 돼지인, 신장의 제조 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 비인간 동물이 마우스인, 신장의 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조된, 신장.
  6. 비인간 동물 유래의 세포와, 인간 세포를 포함하고, 상기 인간 세포의 비율이 70 질량% 이상인, 신장.
  7. 제5항 또는 제6항에 기재된 신장을 갖는 비인간 동물.
  8. 제5항 또는 제6항에 기재된 신장, 요관 및 방광을 구비하는 이식용 장기.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 요관 및 상기 방광이 상기 비인간 동물 유래인, 이식용 장기.
  10. 후신의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거할 수 있는, 유전자 개변 비인간 동물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 후신의 요관아를 조직 특이적으로 더 제거할 수 있는, 유전자 개변 비인간 동물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    유전자 개변 돼지인, 유전자 개변 비인간 동물.
  13. 비인간 동물의 후신과, 상기 후신의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 약제와, 인간 신장 전구세포를 구비하는, 신장 제조용 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 후신의 요관아를 조직 특이적으로 제거하는 약제를 더 구비하는, 신장 제조용 키트.
  15. 비인간 동물의 후신과, 상기 후신의 후신 간엽을 조직 특이적으로 제거하는 약제와, 인간 신장 전구세포를 구비하는, 신장 재생용 의약.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 후신의 요관아를 조직 특이적으로 제거하는 약제를 더 구비하는, 신장 재생용 의약.
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