WO2023195429A1 - 非ヒト動物、及びその利用 - Google Patents
非ヒト動物、及びその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2023195429A1 WO2023195429A1 PCT/JP2023/013642 JP2023013642W WO2023195429A1 WO 2023195429 A1 WO2023195429 A1 WO 2023195429A1 JP 2023013642 W JP2023013642 W JP 2023013642W WO 2023195429 A1 WO2023195429 A1 WO 2023195429A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- cell
- cells
- foreign
- human
- drug
- Prior art date
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title abstract description 13
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 110
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 51
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 36
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 36
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 12
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 11
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 claims description 7
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000885 nephron Anatomy 0.000 description 25
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 19
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 13
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 12
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 7
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 6
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 5
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 5
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 5
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 4
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 4
- 206010061481 Renal injury Diseases 0.000 description 4
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000013210 evaluation model Methods 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 208000037806 kidney injury Diseases 0.000 description 4
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 4
- 238000012174 single-cell RNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 3
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 3
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000029795 kidney development Effects 0.000 description 2
- 238000001001 laser micro-dissection Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 210000004926 tubular epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101001093997 Homo sapiens Solute carrier family 22 member 8 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091006739 SLC22A6 Proteins 0.000 description 1
- 102100035227 Solute carrier family 22 member 8 Human genes 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007665 chronic toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000160 chronic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 230000000642 iatrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002705 metabolomic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001431 metabolomic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002988 nephrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000008560 physiological behavior Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000512 proximal kidney tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000009103 reabsorption Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000036325 urinary excretion Effects 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
Definitions
- the present invention relates to non-human animals and their uses.
- Acute kidney injury accounts for approximately 15% of all hospitalized patients (see, for example, Non-Patent Document 1), and even in Stage 1 AKI, the mortality rate, hospitalization period, and medical costs significantly increase. (For example, see Non-Patent Document 2.)
- Non-Patent Document 3 drug-induced kidney injury accounts for approximately 20% of AKI (see, for example, Non-Patent Document 3), and is a serious disease that necessitates refraining from using anticancer drugs, antibiotics, etc. that can cause kidney damage. It also influences treatment choices for diseases. Furthermore, since the cause of onset is iatrogenic, it also poses a problem from a medical safety perspective. However, the treatment is limited to reducing or discontinuing the suspected drug, replacing fluids with physiological saline, and administering steroids, and no progress has been made in the development of specific treatments (see, for example, Non-Patent Document 3).
- Non-Patent Document 4 There is also a report that 19% of new drugs fail due to nephrotoxicity during clinical trials (see, for example, Non-Patent Document 5).
- Troth SP Simutis F
- Friedman GS Friedman GS
- Todd S Sistare FD
- Kidney Safety Assessment Current Practices in Drug Development. Seminars in Nephrology. 2019;39(2):120-31.
- Tiong HY Huang P
- Xiong S Li Y
- Vathsala A Zink D.
- Drug-induced nephrotoxicity clinical impact and preclinical in vitro models. Mol Pharm. 2014;11(7):1933-48.
- an object of the present invention is to provide a non-human animal, a method for producing a non-human animal, and a method for evaluating a drug, which are suitably used for the development of new drugs and specific treatments for diseases.
- the present invention includes the following aspects.
- [1] A non-human animal that has a chimeric organ containing foreign cells in its body.
- [2] The non-human cell according to [1], wherein the foreign cell is a rodent cell, a human cell, a cell derived from an individual patient, a labeled cell, a genome-edited cell, or a combination thereof. animal.
- [5] The method for producing a non-human animal according to any one of [1] to [4], A manufacturing method comprising the step of injecting foreign cells into the kidney of a newborn baby.
- a non-human animal a method for producing a non-human animal, and a method for producing a non-human animal, which is suitably used for the development of new drugs using human-specific safety evaluation and drug efficacy evaluation, and for the development of specific treatments for diseases.
- a drug evaluation method can be provided.
- FIG. 2 is a diagram showing an example of a drug evaluation method according to the present embodiment.
- 1 is a diagram showing a series of steps of a newborn transplantation method in Experimental Example 1.
- FIG. These are the results of single cell analysis performed on chimeric nephrons formed from progenitor cells transplanted under the kidney capsule of newborn mice in Experimental Example 1. These are the results of immunostaining of the proportion of foreign nephrons in the cell injection area two weeks after transplantation in Experimental Example 1.
- Non-human animals In one embodiment, the present invention provides a non-human animal having a chimeric organ containing foreign cells in its body.
- non-human animals examples include cats, dogs, horses, monkeys, cows, sheep, pigs, goats, rabbits, hamsters, guinea pigs, rats, mice, and the like.
- rodents are preferred from the viewpoint of drug evaluation results.
- examples of rodents include hamsters, guinea pigs, rats, mice, etc., with rats and mice being preferred.
- Chimeric organs include, but are not limited to, the liver, cornea, skin, large intestine, small intestine, pancreas, stomach, muscle tissue, heart, lungs, esophagus, bone marrow, kidney, spleen, testis, ovary, etc. Organs that are subject to evaluation are preferred.
- kidney organoids When kidney organoids are transplanted into rodents, they draw in host blood vessels and mature, but because they are not connected to the host's urine excretion pathway, they expand with the urine they produce, making them unable to survive for long periods of time.
- the foreign cells contained in the chimeric organ are not particularly limited, and include rodent cells, human cells, cells derived from individual patients, labeled cells, genome-edited cells, or cells that are a combination of these.
- the present invention involves, for example, injecting foreign nephron progenitor cells into the nephrogenic region of a mouse to construct a foreign kidney that integrates into the host kidney (chimeric kidney).
- foreign cells include mouse (same species), rat (xenogeneic) fetal kidney cells, NPCs derived from mouse ES cells, and NPCs derived from human iPS cells.
- the host mouse is preferably a fetus or a newborn.
- the non-human animal of the present invention is preferably a drug administration model.
- Such non-human animals preferably have chimeric organs with humans and are suitably used as preclinical test models during new drug development.
- genetically modified host animals equipped with a system that conditionally removes at least a portion of the target organ of the host, such as a host animal that can induce programmed cell death in a regulated manner.
- Non-human animals may also be used.
- Such systems include, for example, a DTA non-human animal that expresses diphtheria toxin A (DTA) in a Cre recombinase activity-dependent manner, and a Six2-CreERT2 non-human animal in which the CreERT2 gene is introduced downstream of the Six2 promoter.
- DTA diphtheria toxin A
- Six2-CreERT2 non-human animal in which the CreERT2 gene is introduced downstream of the Six2 promoter.
- tamoxifen is contacted with the target organs of the resulting offspring (Fujimoto T, Yamanaka S. Generation of Human Renal Vesicles in Mouse Organ Niche Using Nephron Progenitor Cell Replacement System. 2020;32(11): 108130.
- DTA non-human animals have a transcription termination sequence sandwiched between two loxP sequences upstream of the gene encoding diphtheria toxin A. Therefore, diphtheria toxin A is not expressed as it is. However, when the transcription termination sequence sandwiched between two loxP sequences is removed by Cre recombinase, diphtheria toxin A is expressed.
- CreERT2 is normally restricted to the cytoplasm and can only translocate into the nucleus and become active after exposure to tamoxifen. The above example takes advantage of this phenomenon.
- the created chimeric kidney will be administered the drug for a short period of time or repeatedly, and its toxicity will be evaluated.
- the reaction in foreign cells derived from the chimeric kidney exposed to the drug will be quantitatively evaluated using methods such as single cell RNA sequencing, immunostaining, laser microdissection, and quantitative PCR.
- quantitative evaluation is not limited to transcriptional analysis (transcriptomics), and multi-omics analysis including genome analysis (genomics), protein analysis (proteomics), metabolite analysis (metabolomics), etc. can also be used.
- mice with human-mouse chimeric kidneys In preclinical studies using rodents, for example, by using mice with human-mouse chimeric kidneys, the situation is closer to clinical studies than when analyzing mouse kidneys, which have different expression of transporters than human kidneys. It becomes possible to evaluate the Furthermore, by genetically modifying cells to be transplanted, non-human animals having genetically modified chimeric organs can be produced. Genetically modified foreign cells include genome-edited cells. It is possible to study the differences in reactivity to drugs in chimeric organs containing foreign cells whose transporters have been knocked out by genome editing, which can lead to drug discovery.
- the blood vessels that supply nutrients to organoids are mainly venous, and transplanted organoids cannot mature to the same level as the original kidney (Ryan AR, England AR. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. 2021;477:98-116.).
- the present invention is superior to organoid transplantation in that it has been confirmed that foreign cells differentiate into mature nephrons, are connected to the host's urinary tract, and remain engrafted for a long period of 4 months or more. .
- chimeric kidneys can be created by injecting foreign mouse/rat stem cells into mouse embryos.
- the chimera formation rate when using human iPS cells is extremely low (see Gafni O, Weinberger L. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. 2013;504(7479):282-6.).
- human iPS cells may differentiate into neural or reproductive systems, so creating a human chimeric kidney poses high technical and ethical hurdles.
- human cells differentiated into renal lineage cells can be used, so there is no concern about such ethical issues.
- mice having genetically modified chimeric organs can be produced quickly and at low cost by genetically modifying foreign cells used to produce chimeric kidneys.
- the non-human animal of the present invention is preferably a disease model.
- a pathological model can be created by using cells differentiated into desired progenitor cells from disease-specific human iPS cells as foreign cells.
- cells with a predetermined disease may be used as foreign cells by genome editing, or human cells may be used as foreign cells and a pathological model may be created by treatment with a drug.
- the present invention provides a method for producing the above-mentioned non-human animal, which comprises a step of injecting foreign cells into the kidney of a fetus or newborn.
- the present inventor previously invented a fetal transplantation method in which foreign renal progenitor cells are directly injected into the retroperitoneal region of a fetal mouse inside the mother's body to produce and survive mice with chimeric kidneys (Yamanaka S, Saito Y, Fujimoto T, Takamura T, Tajiri S, Matsumoto K, et al. Kidney Regeneration in Later-Stage Mouse Embryos via Transplanted Renal Progenitor Cells. J Am Soc Nephrol. 2019;30(12):2293-305.).
- This method has low accuracy in cell injection locations and low survival rate of host fetuses, and a simpler method was required to establish it as an evaluation model.
- the present inventors developed a method to detect the nephron progenitor cells under the renal capsule of newborn mice at 0-1 days after birth. He invented a neonatal transplantation method that involves direct injection of foreign cells.
- Examples of the foreign cells injected into the kidney of the newborn host include cells similar to those listed under ⁇ Non-human animals>>.
- progenitor cells obtained by differentiating pluripotent stem cells derived from a patient with a genetic disease, or progenitor cells in which at least one target gene has been edited by genome editing.
- progenitor cells By using such progenitor cells, chimeric organs can be produced in 2 to 3 weeks, and the phenotype of the organ can be easily changed.
- a non-human animal having chimeric organs can be easily produced without relying on the production of genetically modified non-human animals such as the production of knockout mice.
- organoids are maintained in vivo for about two months, chimeric organs produced in non-human animals according to the present invention are maintained for a long period of time. Therefore, the non-human animals of the invention can withstand repeated dose studies.
- the foreign cell is preferably a cell having a labeled protein linked to the edited target gene.
- multiple types of genome editing systems such as the CRISPR-Cas system that modify the functions of multiple types of renal tubular transporters, which are genes responsible for drug-induced renal damage, are introduced into foreign cells.
- a gene encoding a marker protein linked to the target gene is also loaded onto a vector (eg, adeno-associated virus vector: AAV) equipped with the CRISPR-Cas system.
- a vector eg, adeno-associated virus vector: AAV
- a virus vector equipped with a CRISPR-Cas system that modifies each of the three target genes A, B, and C is encoded with a gene encoding a red fluorescent protein, a gene encoding a yellow fluorescent protein, and a gene encoding a green fluorescent protein, respectively.
- the virus vector loaded with the gene is used to infect progenitor cells as foreign cells in combinations of A, B, C, A+B, A+C, B+C, and A+B+C.
- non-human animals with chimeric organs produced using each of these foreign cells we will explore combinations of genetic modifications that reduce nephrotoxicity. The details of the optimal combination can be easily recognized from the type of labeled fluorescence.
- the present invention includes the steps of administering a drug to the non-human animal described above, obtaining a single cell derived from a foreign cell from a chimeric organ after administering the drug, and evaluating the single cell. Provides a drug evaluation method.
- the method of administration is not particularly limited, and may include intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., as well as intranasal, transbronchial, intramuscular, percutaneous, or Oral methods are mentioned, and it is preferable that the method of administration is determined by the method of administration envisaged in drug development.
- single cells derived from foreign cells are obtained from the chimeric organ exposed to the drug after drug administration, and the single cells are evaluated. Evaluation methods are not particularly limited, and include techniques such as single cell RNA sequencing, immunostaining, laser microdissection, and quantitative PCR. Since single cells derived from foreign cells are obtained from the chimeric organ and evaluated, the occupancy rate of foreign cells in the chimeric organ may be low. Furthermore, differences in drug sensitivity between foreign cells and host-derived cells can be evaluated simultaneously. For example, as shown in Figure 2, cisplatin (CDDP) was administered to mice with chimeric kidneys, and the presence or absence of the drug was determined in both host-derived cells (native cells) and foreign cells (neo-cells) in the renal tubules. Can be evaluated using a single cell.
- CDDP cisplatin
- iPS cells derived from patients as foreign cells and evaluating the effectiveness and safety of drugs using non-human animals produced, it can be useful for tailored medical care.
- Example 1 The present inventors previously succeeded in producing and surviving mice with chimeric kidneys by directly injecting foreign renal progenitor cells into the retroperitoneal region of fetal mice within their mothers (Yamanaka S, Saito Y , Fujimoto T, Takamura T, Tajiri S, Matsumoto K, et al. Kidney Regeneration in Later-Stage Mouse Embryos via Transplanted Renal Progenitor Cells. J Am Soc Nephrol. 2019;30(12):2293-305.). This method has low accuracy in cell injection locations and low survival rate of host fetuses, and a simpler method was required to establish it as an evaluation model.
- Cisplatin was intraperitoneally administered to the mouse individual having the chimeric kidney produced in Experimental Example 1 two weeks after transplantation, and the regenerated nephrons were collected 48 hours later and evaluated by fluorescent immunostaining.
- dose-dependent Kim-1 expression was confirmed in exogenous proximal tubular cells upon administration of cisplatin.
- single cell RNA sequencing was performed on the collected samples.
- enhanced expression of disorder-related genes other than Kim-1 was also confirmed.
- Regenerated nephrons from the individual mice with chimeric kidneys produced in Experimental Example 1 were collected 4 months after transplantation and evaluated by fluorescent immunostaining. As shown in FIG. 8, regenerated nephrons remained even 4 months after transplantation. From this, it was confirmed that chronic repeated administration tests are also possible by taking advantage of the long-term survival of mice with chimeric kidneys.
- Example 3 In Experimental Example 1, GFP-expressing human nephron progenitor cells were directly injected under the renal capsule of a newborn mouse 0-1 day after birth, instead of cells collected from the kidney of an EGFP mouse embryo. Two weeks after transplantation, foreign nephrons in the cell injection area were examined by immunostaining (see FIG. 9(A)). As shown in FIG. 9(A), the formation of glomeruli and renal tubules derived from GFP-expressing human nephron progenitor cells was confirmed.
- cisplatin was intraperitoneally administered to individual mice with chimeric kidneys two weeks after transplantation of GFP-expressing human nephron progenitor cells, and regenerated nephrons were collected 48 hours later and evaluated by fluorescent immunostaining. As shown in FIG. 9(B), human Kim-1 expression was confirmed in exogenous proximal tubular cells upon administration of cisplatin.
- a non-human animal a method for producing a non-human animal, and a method for evaluating a drug, which are suitably used for the development of new drugs and specific treatments for diseases.
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
Abstract
外来細胞を含むキメラ臓器を体内に有する、非ヒト動物。
Description
本発明は、非ヒト動物、及びその利用に関する。
急性腎障害(AKIともいう。)は、全入院患者の約15%を占め(例えば、非特許文献1参照。)、Stage1のAKIであっても死亡率、入院期間、医療費ともに有意に上昇させる(例えば、非特許文献2参照。)。
その中で、薬剤性腎障害はAKIの約20%を占めており(例えば、非特許文献3参照。)、腎障害をきたしうる抗癌剤、抗菌薬などの使用を控えざるをえないなど、重症疾患の治療選択にも影響を与える。
また発症原因が医原性であるため医療安全の観点からも問題となる。しかし、その治療は被疑薬の減量・中止や生理食塩水の補液、ステロイド投与といった程度で、特異的な治療法の開発は進んでいない(例えば、非特許文献3参照。)。
また発症原因が医原性であるため医療安全の観点からも問題となる。しかし、その治療は被疑薬の減量・中止や生理食塩水の補液、ステロイド投与といった程度で、特異的な治療法の開発は進んでいない(例えば、非特許文献3参照。)。
創薬に際しては、齧歯類を用いた前臨床試験によって有害事象、及び治療効果を確認した後に、人体を用いた臨床試験が行われる。しかし、齧歯類における反応は人体での反応と完全には一致しておらず、前臨床試験では確認できなかった腎毒性が臨床試験で初めて指摘され、薬剤開発に頓挫する例も多く、その経済的・時間的損失は甚大である(例えば、非特許文献4参照。)。19%の新薬が、臨床試験の段階で腎毒性によって頓挫するという報告もある(例えば、非特許文献5参照。)。
Iwagami M, Moriya H, Doi K, Yasunaga H, Isshiki R, Sato I, et al. Seasonality of acute kidney injury incidence and mortality among hospitalized patients. Nephrology Dialysis Transplantation. 2018;33(8):1354-62.
Collister D, Pannu N, Ye F, James M, Hemmelgarn B, Chui B, et al. Health Care Costs Associated with AKI. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 2017;12(11):1733-43.
Awdishu L, Mehta RL. The 6R’s of drug induced nephrotoxicity. BMC Nephrology. 2017;18(1).
Troth SP, Simutis F, Friedman GS, Todd S, Sistare FD. Kidney Safety Assessment: Current Practices in Drug Development. Seminars in Nephrology. 2019;39(2):120-31.
Tiong HY, Huang P, Xiong S, Li Y, Vathsala A, Zink D. Drug-induced nephrotoxicity: clinical impact and preclinical in vitro models. Mol Pharm. 2014;11(7):1933-48.
このような背景から、新規薬剤開発において前臨床試験の段階で腎毒性を正確に検出すること、及び薬剤性腎障害等の腎障害に対する特異的な治療法を開発することの必要性は高く、ヒト腎臓を搭載したキメラマウス、キメララット等の齧歯類動物を用いたヒト腎毒性評価モデルがそのニーズに対処できると考える。
そこで、本発明は、新規薬剤開発、及び疾患に対する特異的な治療法開発に好適に用いられる非ヒト動物、非ヒト動物の製造方法、及び薬剤評価方法を提供することを目的とする。
そこで、本発明は、新規薬剤開発、及び疾患に対する特異的な治療法開発に好適に用いられる非ヒト動物、非ヒト動物の製造方法、及び薬剤評価方法を提供することを目的とする。
本発明は、以下の態様を含む。
[1]外来細胞を含むキメラ臓器を体内に有する、非ヒト動物。
[2]前記外来細胞は、齧歯類細胞、ヒト細胞、個別の患者由来の細胞、標識細胞、若しくはゲノム編集された細胞、又はこれらを組み合わせた細胞である、[1]に記載の非ヒト動物。
[3]病態モデルである、[1]に記載の非ヒト動物。
[4]薬剤投与モデルである、[1]に記載の非ヒト動物。
[5][1]~[4]のいずれか一つに記載の非ヒト動物の製造方法であって、
新生仔の腎臓に外来細胞を注入する工程を有する、製造方法。
[6]前記外来細胞は、遺伝性疾患患者由来の多能性幹細胞を分化させてなる前駆細胞である、[5]に記載の製造方法。
[7]前記外来細胞は、少なくとも1種の標的遺伝子が編集された細胞である、[5]に記載の製造方法。
[8]前記外来細胞は、編集された標的遺伝子と紐づけられた標識タンパク質を有する細胞である、[7]に記載の製造方法。
[9][1]~[4]のいずれか一つに記載の非ヒト動物に薬剤を投与する工程、
薬剤投与後のキメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得し、前記単一細胞を評価する工程を有する、薬剤評価方法。
[1]外来細胞を含むキメラ臓器を体内に有する、非ヒト動物。
[2]前記外来細胞は、齧歯類細胞、ヒト細胞、個別の患者由来の細胞、標識細胞、若しくはゲノム編集された細胞、又はこれらを組み合わせた細胞である、[1]に記載の非ヒト動物。
[3]病態モデルである、[1]に記載の非ヒト動物。
[4]薬剤投与モデルである、[1]に記載の非ヒト動物。
[5][1]~[4]のいずれか一つに記載の非ヒト動物の製造方法であって、
新生仔の腎臓に外来細胞を注入する工程を有する、製造方法。
[6]前記外来細胞は、遺伝性疾患患者由来の多能性幹細胞を分化させてなる前駆細胞である、[5]に記載の製造方法。
[7]前記外来細胞は、少なくとも1種の標的遺伝子が編集された細胞である、[5]に記載の製造方法。
[8]前記外来細胞は、編集された標的遺伝子と紐づけられた標識タンパク質を有する細胞である、[7]に記載の製造方法。
[9][1]~[4]のいずれか一つに記載の非ヒト動物に薬剤を投与する工程、
薬剤投与後のキメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得し、前記単一細胞を評価する工程を有する、薬剤評価方法。
本発明によれば、ヒトに特化した安全性評価、薬効評価を利用した新規薬剤開発、及び疾患に対する特異的な治療法開発に好適に用いられる非ヒト動物、非ヒト動物の製造方法、及び薬剤評価方法を提供することができる。
≪非ヒト動物≫
本発明は、1実施形態において、外来細胞を含むキメラ臓器を体内に有する、非ヒト動物を提供する。
本発明は、1実施形態において、外来細胞を含むキメラ臓器を体内に有する、非ヒト動物を提供する。
非ヒト動物としては、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。中でも、薬剤評価の実績という観点からは、齧歯類が好ましい。齧歯類としては、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられ、ラット、マウスが好ましい。
キメラ臓器としては、特に限定されず、肝臓、角膜、皮膚、大腸、小腸、膵臓、胃、筋組織、心臓、肺、食道、骨髄、腎臓、脾臓、精巣、卵巣等が挙げられ、動物実験での評価対象となる臓器が好ましい。
例えば、薬剤性腎障害の主座となる近位尿細管上皮細胞において、細胞表面のトランスポーターの発現は、ヒトと齧歯類では異なることが知られている。この種差は、創薬における動物実験(前臨床試験)と臨床試験の結果の不一致として以前より指摘されており、実際に動物実験における安全性試験の約30%が偽陰性であったとの報告がある(種差による限界)。
また、in vitro実験系で最も一般的な不死化したヒト尿細管上皮細胞の単層培養による毒素添加実験では、トランスポーターのOAT1及びOAT3の発現を失っているなど、形質の変化が問題である。近年3D培養による腎オルガノイドや、流体デバイスを用いて尿細管細胞の極性を保ったまま薬剤毒性を評価するモデルなどが提唱されてはいるが、in vitroでは血流や尿流がないため薬剤の生理的な投与は再現できず、また長期間培養することができないため慢性毒性評価は不可能であるといった問題がある(in vitroの限界)。
腎オルガノイドを齧歯類に移植すると、ホスト血管を引き込んで成熟するが、ホストの尿排泄経路に接続されていないために産生した尿によって拡張してしまい、やはり長期間生存させることはできない。
キメラ臓器が含有する外来細胞としては、特に限定されず、齧歯類細胞、ヒト細胞、個別の患者由来の細胞、標識細胞、若しくはゲノム編集された細胞、又はこれらを組み合わせた細胞が挙げられる。
本発明は、例えば、マウスの腎発生領域に外来ネフロン前駆細胞を注入して、ホストの腎臓に組み込まれた外来腎臓(キメラ腎臓)を構築するものである。
キメラ腎臓構築において、外来細胞としては、マウス(同種)、ラット(異種)の胎仔腎細胞、マウスES細胞から誘導したNPCs、ヒトiPS細胞から誘導したNPCsが挙げられる。ホストマウスは、胎仔又は新生仔が好ましい。
キメラ腎臓構築において、外来細胞としては、マウス(同種)、ラット(異種)の胎仔腎細胞、マウスES細胞から誘導したNPCs、ヒトiPS細胞から誘導したNPCsが挙げられる。ホストマウスは、胎仔又は新生仔が好ましい。
本発明の非ヒト動物は、薬剤投与モデルであることが好ましい。係る非ヒト動物は、ヒトとのキメラ臓器を有することが好ましく、新薬開発時の前臨床試験モデルとして好適に用いられる。
キメラ臓器における外来細胞の割合が低い場合であっても、キメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得し、単一細胞を評価することにより、動物実験における薬剤投与後のヒト臓器への影響を評価することができる。
また、キメラ臓器における外来細胞の割合を高めるために、調節的にプログラム細胞死を誘導可能な宿主動物等、コンディショナルに、ホストの対象臓器の少なくとも一部を除去するシステムを備えている遺伝子改変非ヒト動物を用いてもよい。
係るシステムとしては、例えば、Creリコンビナーゼ活性依存的にジフテリア毒素A(diphteria toxin A,DTA)を発現するDTA非ヒト動物と、Six2のプロモーターの下流にCreERT2遺伝子を導入したSix2-CreERT2非ヒト動物とを交配し、得られた子孫の対象臓器にタモキシフェンを接触させるシステムが挙げられる(Fujimoto T, Yamanaka S. Generation of Human Renal Vesicles in Mouse Organ Niche Using Nephron Progenitor Cell Replacement System. 2020;32(11):108130. 参照)。
DTA非ヒト動物は、ジフテリア毒素Aをコードする遺伝子の上流に2つのloxP配列で挟まれた転写停止配列を有している。このため、そのままではジフテリア毒素Aを発現しない。しかしながら、Creリコンビナーゼにより、2つのloxP配列で挟まれた転写停止配列が除去されると、ジフテリア毒素Aを発現するようになる。
CreERT2は通常細胞質に限定されており、タモキシフェンに暴露された後でのみ核内に移行し、活性を持つことができる。上記の例ではこの現象を利用している。
例えば、DTA非ヒト動物と後腎間葉特異的にCreERT2を発現するSix2-CreERT2非ヒト動物とを交配すると、得られた子孫の中に後腎組織で組織特異的にジフテリア毒素Aを発現する非ヒト動物が出現する。なお、Six2は、後腎間葉で特異的に発現する転写因子である。係る非ヒト動物を用いることで、後腎組織における外来細胞の割合を高めることができる。
このシステムの大きな利点としては、DTAとCreERT2が非ヒト動物の後腎間葉特異的に発現するため、ヒト細胞を含む外来細胞に対する毒性の懸念がないことが挙げられる。
このシステムの大きな利点としては、DTAとCreERT2が非ヒト動物の後腎間葉特異的に発現するため、ヒト細胞を含む外来細胞に対する毒性の懸念がないことが挙げられる。
次いで、作製したキメラ腎臓に対して、薬剤の短期間投与や反復投与を行い、毒性を評価する。詳細には、シングルセルRNAシークエンス、免疫染色、レーザーマイクロダイセクションと定量PCR法といった手法で、薬剤を暴露されたキメラ腎臓由来の外来細胞における反応を定量評価する。また、定量評価は、転写解析(トランスクリプトミクス)に限られず、ゲノム解析(ゲノミクス)・蛋白質解析(プロテオミクス)・代謝物解析(メタボロミクス)等を含めたマルチオミックス解析も利用可能である。
齧歯類を用いた前臨床試験において、例えばヒトとマウスとのキメラ腎臓を有するマウスを用いることにより、ヒト腎臓とはトランスポーターの発現の異なるマウス腎臓で解析する場合よりも臨床試験に近い状況での評価が可能となる。
また、移植する細胞に遺伝子改変を加えることで、遺伝子改変キメラ臓器を有する非ヒト動物を作製することができる。遺伝子改変された外来細胞としては、ゲノム編集された細胞が挙げられる。ゲノム編集によりトランスポーターをノックアウトした外来細胞を含むキメラ臓器の薬剤への反応性の違いを検討して創薬に繋げることができる。
また、移植する細胞に遺伝子改変を加えることで、遺伝子改変キメラ臓器を有する非ヒト動物を作製することができる。遺伝子改変された外来細胞としては、ゲノム編集された細胞が挙げられる。ゲノム編集によりトランスポーターをノックアウトした外来細胞を含むキメラ臓器の薬剤への反応性の違いを検討して創薬に繋げることができる。
また、外来細胞として、疾患特異的細胞を用いて作製したキメラ臓器を有する非ヒト動物を用いることにより、病態解明や治療法開発に繋げることができる。
また、in vitroヒト腎細胞培養系において、成熟尿細管細胞の二次元培養では、細胞のトランスポーターの発現が消失するなどの形質変化が起こる(Jenkinson SE, Chung GW. The limitations of renal epithelial cell line HK-2 as a model of drug transporter expression and function in the proximal tubule. 2012;464(6):601-11.参照)。幹細胞から腎オルガノイドを作製する三次元培養においても、十分に成熟した腎臓を作製することができておらず、腎障害を評価するために必要なトランスポーターの発現が不十分である(Wu H, Uchimura K. Comparative Analysis and Refinement of Human PSC-Derived Kidney Organoid Differentiation with Single-Cell Transcriptomics. 2018;23(6):869-881.e8.参照)。
これらの培養系は、いずれも薬剤を培地に添加して腎障害を検証する際に、尿細管の管腔側及び基底膜側のいずれもが区別なく薬剤に暴露されてしまい、生体内での薬物動態を再現することができない。
これらの培養系は、いずれも薬剤を培地に添加して腎障害を検証する際に、尿細管の管腔側及び基底膜側のいずれもが区別なく薬剤に暴露されてしまい、生体内での薬物動態を再現することができない。
この問題を解消するために、マイクロ流体デバイスを用いて、尿細管細胞を管腔状に配置して薬剤に暴露させる試みはなされているが、やはり薬剤が血管内を通って糸球体で濾過されて、尿細管においても排泄・再吸収されているという生理的な挙動を正確に再現することは困難である。さらに、培養においては長期間腎臓を維持することができず、慢性評価モデルとしては不適切である。
本発明は、これらの問題点をクリアしている。
本発明は、これらの問題点をクリアしている。
また、ヒト腎オルガノイドのin vivo移植において、オルガノイドを齧歯類に移植すると、ホスト血管を引き込んで成熟することが知られている(van den Berg CW, Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. 2018;10(3):751-765.参照)。しかしながら、移植されたヒト腎オルガノイドは、ホストの尿排泄経路に接続されていないために産生した尿によって拡張してしまい、2ヶ月以上の長期間は生存させることはできず廃絶してしまう。
また、オルガノイドに栄養を供給する血管は、静脈系が主体であることもあり、移植したオルガノイドは本来の腎臓と同程度まで成熟させることはできない(Ryan AR, England AR. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. 2021;477:98-116.)。
本発明は、外来細胞が成熟ネフロンに分化すること、ホストの尿路に接続されて4ヶ月以上の長期に渡って生着することが確認されており、その点でオルガノイド移植よりも優れている。
また、オルガノイドに栄養を供給する血管は、静脈系が主体であることもあり、移植したオルガノイドは本来の腎臓と同程度まで成熟させることはできない(Ryan AR, England AR. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. 2021;477:98-116.)。
本発明は、外来細胞が成熟ネフロンに分化すること、ホストの尿路に接続されて4ヶ月以上の長期に渡って生着することが確認されており、その点でオルガノイド移植よりも優れている。
また、マウス胚に外来のマウス・ラット幹細胞を注入することでキメラ腎臓を作製できることが報告されている。しかし、ヒトiPS細胞を用いた場合のキメラ形成率は極めて低い(Gafni O, Weinberger L. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. 2013;504(7479):282-6.参照)。さらに、ヒトiPS細胞が神経・生殖系に分化する懸念があるため、ヒトキメラ腎臓を作製するには技術的・倫理的ハードルが高い。それに対して、本発明では、腎系譜細胞に分化したヒト細胞を用いることができるため、そのような倫理的問題の懸念はない。
また、遺伝子改変マウスの作製には1年以上要し、複数の遺伝子改変にはさらに時間がかかり、費用も高額となる。本発明においては、キメラ腎臓を作製する際の外来細胞に遺伝子改変を加えることで、早期に、低コストで、遺伝子改変キメラ臓器を有するマウスを作製することができる。
また、標的遺伝子を組み込んだウイルス等を全身・局所投与することでin vivo遺伝子編集を行う試みは報告されているが、腎臓は糸球体濾過バリアのためウイルスが到達しづらく、ノックイン効率が悪い(Rubin JD, Barry MA. Improving Molecular Therapy in the Kidney. Mol Diagn Ther. 2020;24(4):375-96.参照。)。本発明において、予めゲノム編集を加えた幹細胞を選別・拡大培養した上で移植してキメラ腎臓を作製する方が効率的に遺伝子改変を行うことができる。
非ヒト動物の生体内で機能するヒト腎臓を、前臨床試験段階で運用する技術はこれまでなかったが、iPS細胞技術やゲノム編集技術の向上から研究は加速しており、キメラ技術を利用した研究開発は大きなインパクトを有する。
非ヒト動物の生体内で機能するヒト腎臓を、前臨床試験段階で運用する技術はこれまでなかったが、iPS細胞技術やゲノム編集技術の向上から研究は加速しており、キメラ技術を利用した研究開発は大きなインパクトを有する。
本発明の非ヒト動物は、病態モデルであることが好ましい。例えば、疾患特異的ヒトiPS細胞から所望の前駆細胞に分化させた細胞を外来細胞として用いることにより、病態モデルを作製することができる。また、ゲノム編集により、所定の疾患細胞を外来細胞として用いてもよく、ヒト細胞を外来細胞として用い、薬剤処理により、病態モデルを作製してもよい。
係る病態モデルを用いることにより、薬剤性腎障害及び遺伝性腎臓病等のアンメットメディカルニーズの高い疾患の病態解明や治療法開発を行うことができる。
係る病態モデルを用いることにより、薬剤性腎障害及び遺伝性腎臓病等のアンメットメディカルニーズの高い疾患の病態解明や治療法開発を行うことができる。
≪非ヒト動物の製造方法≫
本発明は、1実施形態において、上述した非ヒト動物の製造方法であって、胎仔又は新生仔の腎臓に外来細胞を注入する工程を有する、製造方法を提供する。
本発明は、1実施形態において、上述した非ヒト動物の製造方法であって、胎仔又は新生仔の腎臓に外来細胞を注入する工程を有する、製造方法を提供する。
本発明者は、以前母体内の胎仔マウスの後腹膜領域に、直接外来腎前駆細胞を注入して、キメラ腎臓を持つマウス個体を産出させて生存させる胎仔移植法を発明した(Yamanaka S, Saito Y, Fujimoto T, Takamura T, Tajiri S, Matsumoto K, et al. Kidney Regeneration in Later-Stage Mouse Embryos via Transplanted Renal Progenitor Cells. J Am Soc Nephrol. 2019;30(12):2293-305.)。
この方法は、細胞注入場所の正確性、及びホスト胎仔の生存率が低く、評価モデルとして確立する上ではより簡便な方法が求められた。そこで、マウスは出生後3日程度まではネフロン前駆細胞が残存し、腎発生が継続していることを活用して、本発明者は、出生後0-1日の新生仔マウスの腎被膜下に、外来細胞を直接注入する新生児移植法を発明した。
この方法は、細胞注入場所の正確性、及びホスト胎仔の生存率が低く、評価モデルとして確立する上ではより簡便な方法が求められた。そこで、マウスは出生後3日程度まではネフロン前駆細胞が残存し、腎発生が継続していることを活用して、本発明者は、出生後0-1日の新生仔マウスの腎被膜下に、外来細胞を直接注入する新生児移植法を発明した。
ホスト新生仔の腎臓に注入する外来細胞としては、≪非ヒト動物≫で挙げたものと同様の細胞が挙げられる。病態モデルを作製する場合には、遺伝性疾患患者由来の多能性幹細胞を分化させてなる前駆細胞、又はゲノム編集により少なくとも1種の標的遺伝子が編集された前駆細胞を用いることが好ましい。
係る前駆細胞を用いることにより、2~3週間でキメラ臓器を作製することができ、臓器の表現型を容易変更できる。本発明によれば、ノックアウトマウスの作製等、遺伝子改変非ヒト動物の作製に依存せず、簡便にキメラ臓器を有する非ヒト動物を製造できる。また、オルガノイドでは、生体内での維持は2か月程度であるところ、本発明により製造された非ヒト動物内のキメラ臓器は、長期間維持される。従って、本発明の非ヒト動物は、反復投与試験に耐えることができる。
係る前駆細胞を用いることにより、2~3週間でキメラ臓器を作製することができ、臓器の表現型を容易変更できる。本発明によれば、ノックアウトマウスの作製等、遺伝子改変非ヒト動物の作製に依存せず、簡便にキメラ臓器を有する非ヒト動物を製造できる。また、オルガノイドでは、生体内での維持は2か月程度であるところ、本発明により製造された非ヒト動物内のキメラ臓器は、長期間維持される。従って、本発明の非ヒト動物は、反復投与試験に耐えることができる。
また、外来細胞は、編集された標的遺伝子と紐づけられた標識タンパク質を有する細胞であることが好ましい。図1に示す様に、例えば、薬剤性腎障害の原因遺伝子である複数種の尿細管トランスポーターの機能を改変する複数種類のCRISPR-Casシステム等のゲノム編集システムを外来細胞に導入する。その際、CRISPR-Casシステムを搭載するベクター(例えば、アデノ随伴ウイルスベクター:AAV)に標的遺伝子と紐づけられた標識タンパク質をコードする遺伝子も搭載しておく。例えば、3種類の標的遺伝子A、B、Cそれぞれを改変するCRISPR-Casシステムを搭載するウイルスベクターに、それぞれ赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、黄色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を搭載し、係るウイルスベクターをA、B、C、A+B、A+C、B+C、A+B+Cの組み合わせで外来細胞としての前駆細胞に感染させる。これら外来細胞のそれぞれを用いて製造されるキメラ臓器を有する非ヒト動物を用いて、腎毒性が軽減するような遺伝子改変の組み合わせを探索する。最適な組み合わせの詳細は、標識した蛍光の種類から容易に認識することができる。これを創薬にも応用して、核酸医薬や低分子化合物を用い薬剤性腎障害に対する特異的治療法の開発につなげることができる。
一方、ゲノム編集動物においては、3種以上の遺伝子の編集による表現型の変更は多大な労力と時間を要し、組み合わせの探索には不適である。
一方、ゲノム編集動物においては、3種以上の遺伝子の編集による表現型の変更は多大な労力と時間を要し、組み合わせの探索には不適である。
≪薬剤評価方法≫
本発明は、1実施形態において、上述した非ヒト動物に薬剤を投与する工程、薬剤投与後のキメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得し、前記単一細胞を評価する工程を有する、薬剤評価方法を提供する。
本発明は、1実施形態において、上述した非ヒト動物に薬剤を投与する工程、薬剤投与後のキメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得し、前記単一細胞を評価する工程を有する、薬剤評価方法を提供する。
非ヒト動物に薬剤を投与する工程において、投与方法は特に限定されず、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的方法が挙げられ、薬剤開発において想定される投与方法によって決定されることが好ましい。
次いで、薬剤投与後の薬剤を暴露されたキメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得し、単一細胞を評価する。評価方法としては、特に限定されず、シングルセルRNAシークエンス、免疫染色、レーザーマイクロダイセクションと定量PCR法といった手法が挙げられる。キメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得して評価するため、キメラ臓器中の外来細胞の占有率は低くてもよい。また、外来細胞とホスト由来の細胞における薬剤に対する感受性の違いを同時に評価することができる。例えば、図2に示す様に、キメラ腎臓を有するマウスにシスプラチン(CDDP)を投与し、尿細管でのホスト由来の細胞(native cell)と 外来細胞(Neo-cell)それぞれにおける薬剤有り無しを単一細胞で評価できる。
また、外来細胞として患者由来のiPS細胞を用いて、作製した非ヒト動物を用いて薬剤の有効性や安全性を評価することにより、テーラーメード医療に役立てることができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
[実験例1]
本発明者らは、以前母体内の胎仔マウスの後腹膜領域に、直接外来腎前駆細胞を注入して、キメラ腎臓を持つマウス個体を産出させて生存させることに成功した(Yamanaka S, Saito Y, Fujimoto T, Takamura T, Tajiri S, Matsumoto K, et al. Kidney Regeneration in Later-Stage Mouse Embryos via Transplanted Renal Progenitor Cells. J Am Soc Nephrol. 2019;30(12):2293-305.)。
この方法は、細胞注入場所の正確性、及びホスト胎仔の生存率が低く、評価モデルとして確立する上ではより簡便な方法が求められた。そこで、マウスは出生後3日程度まではネフロン前駆細胞が残存し、腎発生が継続していることを活用して(Hartman HA, Lai HL. Cessation of renal morphogenesis in mice. 2007;310(2):379-87.参照)、出生後0-1日の新生仔マウスの腎被膜下に、EGFPマウス胎仔E14腎臓由来から採取した細胞を直接注入した(図3参照。)。
本発明者らは、以前母体内の胎仔マウスの後腹膜領域に、直接外来腎前駆細胞を注入して、キメラ腎臓を持つマウス個体を産出させて生存させることに成功した(Yamanaka S, Saito Y, Fujimoto T, Takamura T, Tajiri S, Matsumoto K, et al. Kidney Regeneration in Later-Stage Mouse Embryos via Transplanted Renal Progenitor Cells. J Am Soc Nephrol. 2019;30(12):2293-305.)。
この方法は、細胞注入場所の正確性、及びホスト胎仔の生存率が低く、評価モデルとして確立する上ではより簡便な方法が求められた。そこで、マウスは出生後3日程度まではネフロン前駆細胞が残存し、腎発生が継続していることを活用して(Hartman HA, Lai HL. Cessation of renal morphogenesis in mice. 2007;310(2):379-87.参照)、出生後0-1日の新生仔マウスの腎被膜下に、EGFPマウス胎仔E14腎臓由来から採取した細胞を直接注入した(図3参照。)。
新生仔マウスの腎被膜下に移植した前駆細胞から形成されたキメラネフロンに対してシングルセル解析を行った(図4参照)。図4に示す様に、外来細胞が成熟尿細管に分化していることが確認された。
更に、移植2週間後の細胞注入領域における外来ネフロンの割合を、免疫染色にて調べた(図5参照)。図5に示す様に、キメラ状の糸球体、近位~遠位尿細管の形成が確認された。外来細胞は成熟尿細管のマーカーを発現していることが確認された。
更に、移植2週間後の細胞注入領域における外来ネフロンの割合を、免疫染色にて調べた(図5参照)。図5に示す様に、キメラ状の糸球体、近位~遠位尿細管の形成が確認された。外来細胞は成熟尿細管のマーカーを発現していることが確認された。
[実験例2]
実験例1で作製した、移植2週間後のキメラ腎臓を持つマウス個体に、シスプラチンを腹腔内投与し、48時間後に再生ネフロンを回収して蛍光免疫染色で評価した。図6に示す様に、シスプラチン投与により外来性の近位尿細管細胞に用量依存性のKim-1発現が確認された。
また、回収したサンプルに対して、シングルセルRNAシークエンスを行った。図7に示す様に、Kim-1以外の障害関連遺伝子の発現の増強も確認された。
実験例1で作製した、移植2週間後のキメラ腎臓を持つマウス個体に、シスプラチンを腹腔内投与し、48時間後に再生ネフロンを回収して蛍光免疫染色で評価した。図6に示す様に、シスプラチン投与により外来性の近位尿細管細胞に用量依存性のKim-1発現が確認された。
また、回収したサンプルに対して、シングルセルRNAシークエンスを行った。図7に示す様に、Kim-1以外の障害関連遺伝子の発現の増強も確認された。
実験例1で作製した、キメラ腎臓を持つマウス個体において、移植4か月後の再生ネフロンを回収して蛍光免疫染色で評価した。図8に示す様に、移植4か月後も再生ネフロンが残存していた。このことから、キメラ腎臓を持つマウス個体が、長期間生存することを活かし、慢性反復投与試験も可能であることが確認された。
[実験例3]
実験例1において、EGFPマウス胎仔E14腎臓由来から採取した細胞に代えて、GFP発現ヒトネフロン前駆細胞を、出生後0-1日の新生仔マウスの腎被膜下に直接注入した。移植2週間後の細胞注入領域における外来ネフロンを、免疫染色にて調べた(図9(A)参照)。図9(A)に示す様に、GFP発現ヒトネフロン前駆細胞由来の糸球体、及び尿細管の形成が確認された。
実験例1において、EGFPマウス胎仔E14腎臓由来から採取した細胞に代えて、GFP発現ヒトネフロン前駆細胞を、出生後0-1日の新生仔マウスの腎被膜下に直接注入した。移植2週間後の細胞注入領域における外来ネフロンを、免疫染色にて調べた(図9(A)参照)。図9(A)に示す様に、GFP発現ヒトネフロン前駆細胞由来の糸球体、及び尿細管の形成が確認された。
また、GFP発現ヒトネフロン前駆細胞移植2週間後のキメラ腎臓を持つマウス個体に、シスプラチンを腹腔内投与し、48時間後に再生ネフロンを回収して蛍光免疫染色で評価した。図9(B)に示す様に、シスプラチン投与により外来性の近位尿細管細胞にヒトKim-1発現が確認された。
本発明によれば、新規薬剤開発、及び疾患に対する特異的な治療法開発に好適に用いられる非ヒト動物、非ヒト動物の製造方法、及び薬剤評価方法を提供することができる。
Claims (9)
- 外来細胞を含むキメラ臓器を体内に有する、非ヒト動物。
- 前記外来細胞は、齧歯類細胞、ヒト細胞、個別の患者由来の細胞、標識細胞、若しくはゲノム編集された細胞、又はこれらを組み合わせた細胞である、請求項1に記載の非ヒト動物。
- 病態モデルである、請求項1に記載の非ヒト動物。
- 薬剤投与モデルである、請求項1に記載の非ヒト動物。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の非ヒト動物の製造方法であって、
胎仔又は新生仔の腎臓に外来細胞を注入する工程を有する、製造方法。 - 前記外来細胞は、遺伝性疾患患者由来の多能性幹細胞を分化させてなる前駆細胞である、請求項5に記載の製造方法。
- 前記外来細胞は、少なくとも1種の標的遺伝子が編集された細胞である、請求項5に記載の製造方法。
- 前記外来細胞は、編集された標的遺伝子と紐づけられた標識タンパク質を有する細胞である、請求項7に記載の製造方法。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の非ヒト動物に薬剤を投与する工程、
薬剤投与後のキメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得し、前記単一細胞を評価する工程を有する、薬剤評価方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022063993 | 2022-04-07 | ||
JP2022-063993 | 2022-04-07 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2023195429A1 true WO2023195429A1 (ja) | 2023-10-12 |
Family
ID=88242955
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2023/013642 WO2023195429A1 (ja) | 2022-04-07 | 2023-03-31 | 非ヒト動物、及びその利用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
WO (1) | WO2023195429A1 (ja) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004087898A1 (ja) * | 2003-03-31 | 2004-10-14 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 哺乳類胚への外来細胞の移植法 |
WO2018003452A1 (ja) * | 2016-06-29 | 2018-01-04 | 隆 横尾 | 腎臓の製造方法 |
WO2018003451A1 (ja) * | 2016-06-29 | 2018-01-04 | 隆 横尾 | 腎臓の製造方法 |
WO2018003450A1 (ja) * | 2016-06-29 | 2018-01-04 | 隆 横尾 | 臓器の製造方法 |
-
2023
- 2023-03-31 WO PCT/JP2023/013642 patent/WO2023195429A1/ja unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004087898A1 (ja) * | 2003-03-31 | 2004-10-14 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 哺乳類胚への外来細胞の移植法 |
WO2018003452A1 (ja) * | 2016-06-29 | 2018-01-04 | 隆 横尾 | 腎臓の製造方法 |
WO2018003451A1 (ja) * | 2016-06-29 | 2018-01-04 | 隆 横尾 | 腎臓の製造方法 |
WO2018003450A1 (ja) * | 2016-06-29 | 2018-01-04 | 隆 横尾 | 臓器の製造方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
INAGE, YUKA ET AL.: "Current status of kidney regeneration and its application to pediatric medicine", JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE, BIOMEDICAL DRUGS PUBLICATION, JP, vol. 279, no. 7, 13 November 2021 (2021-11-13), JP , pages 715 - 719, XP009549294, ISSN: 0039-2359 * |
MATSUI, KENJI : "Induction of drug-induced renal dysfunction using regenerated nephrons by method for implantation in neonatal rats", JAPANESE JOURNAL OF NEPHROLOGY, vol. 63, no. 4, 1 January 2021 (2021-01-01), pages 519, XP009549292 * |
TSUYOSHI TAKAMURA, TOSHINARI FUJIMOTO, SUSUMU TAJIRI, KEI MATSUMOTO, EIJI KOBAYASHI, TAKASHI YOKOO: "PO0638 Generation of Chimeric Nephrons in Newborn Mice for Testing Drug-Induced Nephrotoxicity", JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF NEPHROLOGY, WILLIAMS AND WILKINS, BALTIMORE, MD., US, vol. 32, no. Suppl., 1 January 2021 (2021-01-01) - 7 November 2021 (2021-11-07), US , pages 234 - 235, XP009549293, ISSN: 1046-6673 * |
YAMANAKA SHUICHIRO, SAITO YATSUMU, FUJIMOTO TOSHINARI, TAKAMURA TSUYOSHI, TAJIRI SUSUMU, MATSUMOTO KEI, YOKOO TAKASHI: "Kidney Regeneration in Later-Stage Mouse Embryos via Transplanted Renal Progenitor Cells", JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF NEPHROLOGY, WILLIAMS AND WILKINS, BALTIMORE, MD., US, vol. 30, no. 12, 1 December 2019 (2019-12-01), US , pages 2293 - 2305, XP093097308, ISSN: 1046-6673, DOI: 10.1681/ASN.2019020148 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5073836B2 (ja) | ヒト肝細胞が移植されたマウス | |
AU2010200016B2 (en) | Growth of foreign cells in fetal animals facilitated by conditional and selective destruction of native host cells | |
JP7488177B2 (ja) | 腎臓の製造方法 | |
WO2008001614A1 (fr) | Modèle animalier de stéatohépatite non alcoolique et modèle animalier de stéatose hépatique | |
JP2021045168A (ja) | 腎臓の製造方法 | |
Yamanaka et al. | Kidney regeneration in later-stage mouse embryos via transplanted renal progenitor cells | |
WO2023195429A1 (ja) | 非ヒト動物、及びその利用 | |
Fordjour et al. | Exomap1 mouse: a transgenic model for in vivo studies of exosome biology | |
US10123517B2 (en) | Immune competent models of human disease | |
KR20050004263A (ko) | 독물학 및 투여량 예측을 위한 동물 모델 | |
CN114317604B (zh) | 一种自发性肺动脉高压模型及构建方法 | |
JPWO2018003450A1 (ja) | 臓器の製造方法 | |
Hua et al. | Xenograft model of human brain tumor | |
US20070250942A1 (en) | Non-human transgenic mammals useful for identifying and assessing neural stem/progenitor cells | |
JP6436669B2 (ja) | 子宮肉腫転移モデル動物 | |
KR102174851B1 (ko) | Cep41 유전자 결손 제프라피쉬 모델, 이의 용도 및 이를 이용한 치료제 스크리닝 방법 | |
JP6208673B2 (ja) | 尋常性乾癬モデルマウス及びその製造方法 | |
WO2004006663A1 (ja) | 肝硬変モデル動物およびその作製方法 | |
KR20210048776A (ko) | epcam 유전자 변이 제브라피쉬 및 이의 용도 | |
McCauley | Requirement of Osr1 in second heart field (SHF) for proper outflow tract (OFT) alignment | |
JPWO2005090561A1 (ja) | マクロファージ系細胞の活性化制御物質のスクリーニング方法 | |
CN116814701A (zh) | 一种模拟免疫缺陷病单碱基基因编辑非人灵长类动物模型及其制作方法与应用 | |
Wilmut | Methods for genetic modification in farm animals and humans: present procedures and future opportunities | |
Iwamoto et al. | P-1 CARD Mouse Breeding Service | |
Braun | Cell biology of hepatic repopulation in diseased liver |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 23784716 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |