WO2023195429A1 - 非ヒト動物、及びその利用 - Google Patents

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WO2023195429A1
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cells
foreign
human
drug
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Inventor
修一郎 山中
賢治 松井
隆 横尾
Original Assignee
学校法人慈恵大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility

Definitions

  • the present invention relates to non-human animals and their uses.
  • Acute kidney injury accounts for approximately 15% of all hospitalized patients (see, for example, Non-Patent Document 1), and even in Stage 1 AKI, the mortality rate, hospitalization period, and medical costs significantly increase. (For example, see Non-Patent Document 2.)
  • Non-Patent Document 3 drug-induced kidney injury accounts for approximately 20% of AKI (see, for example, Non-Patent Document 3), and is a serious disease that necessitates refraining from using anticancer drugs, antibiotics, etc. that can cause kidney damage. It also influences treatment choices for diseases. Furthermore, since the cause of onset is iatrogenic, it also poses a problem from a medical safety perspective. However, the treatment is limited to reducing or discontinuing the suspected drug, replacing fluids with physiological saline, and administering steroids, and no progress has been made in the development of specific treatments (see, for example, Non-Patent Document 3).
  • Non-Patent Document 4 There is also a report that 19% of new drugs fail due to nephrotoxicity during clinical trials (see, for example, Non-Patent Document 5).
  • Troth SP Simutis F
  • Friedman GS Friedman GS
  • Todd S Sistare FD
  • Kidney Safety Assessment Current Practices in Drug Development. Seminars in Nephrology. 2019;39(2):120-31.
  • Tiong HY Huang P
  • Xiong S Li Y
  • Vathsala A Zink D.
  • Drug-induced nephrotoxicity clinical impact and preclinical in vitro models. Mol Pharm. 2014;11(7):1933-48.
  • an object of the present invention is to provide a non-human animal, a method for producing a non-human animal, and a method for evaluating a drug, which are suitably used for the development of new drugs and specific treatments for diseases.
  • the present invention includes the following aspects.
  • [1] A non-human animal that has a chimeric organ containing foreign cells in its body.
  • [2] The non-human cell according to [1], wherein the foreign cell is a rodent cell, a human cell, a cell derived from an individual patient, a labeled cell, a genome-edited cell, or a combination thereof. animal.
  • [5] The method for producing a non-human animal according to any one of [1] to [4], A manufacturing method comprising the step of injecting foreign cells into the kidney of a newborn baby.
  • a non-human animal a method for producing a non-human animal, and a method for producing a non-human animal, which is suitably used for the development of new drugs using human-specific safety evaluation and drug efficacy evaluation, and for the development of specific treatments for diseases.
  • a drug evaluation method can be provided.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of a drug evaluation method according to the present embodiment.
  • 1 is a diagram showing a series of steps of a newborn transplantation method in Experimental Example 1.
  • FIG. These are the results of single cell analysis performed on chimeric nephrons formed from progenitor cells transplanted under the kidney capsule of newborn mice in Experimental Example 1. These are the results of immunostaining of the proportion of foreign nephrons in the cell injection area two weeks after transplantation in Experimental Example 1.
  • Non-human animals In one embodiment, the present invention provides a non-human animal having a chimeric organ containing foreign cells in its body.
  • non-human animals examples include cats, dogs, horses, monkeys, cows, sheep, pigs, goats, rabbits, hamsters, guinea pigs, rats, mice, and the like.
  • rodents are preferred from the viewpoint of drug evaluation results.
  • examples of rodents include hamsters, guinea pigs, rats, mice, etc., with rats and mice being preferred.
  • Chimeric organs include, but are not limited to, the liver, cornea, skin, large intestine, small intestine, pancreas, stomach, muscle tissue, heart, lungs, esophagus, bone marrow, kidney, spleen, testis, ovary, etc. Organs that are subject to evaluation are preferred.
  • kidney organoids When kidney organoids are transplanted into rodents, they draw in host blood vessels and mature, but because they are not connected to the host's urine excretion pathway, they expand with the urine they produce, making them unable to survive for long periods of time.
  • the foreign cells contained in the chimeric organ are not particularly limited, and include rodent cells, human cells, cells derived from individual patients, labeled cells, genome-edited cells, or cells that are a combination of these.
  • the present invention involves, for example, injecting foreign nephron progenitor cells into the nephrogenic region of a mouse to construct a foreign kidney that integrates into the host kidney (chimeric kidney).
  • foreign cells include mouse (same species), rat (xenogeneic) fetal kidney cells, NPCs derived from mouse ES cells, and NPCs derived from human iPS cells.
  • the host mouse is preferably a fetus or a newborn.
  • the non-human animal of the present invention is preferably a drug administration model.
  • Such non-human animals preferably have chimeric organs with humans and are suitably used as preclinical test models during new drug development.
  • genetically modified host animals equipped with a system that conditionally removes at least a portion of the target organ of the host, such as a host animal that can induce programmed cell death in a regulated manner.
  • Non-human animals may also be used.
  • Such systems include, for example, a DTA non-human animal that expresses diphtheria toxin A (DTA) in a Cre recombinase activity-dependent manner, and a Six2-CreERT2 non-human animal in which the CreERT2 gene is introduced downstream of the Six2 promoter.
  • DTA diphtheria toxin A
  • Six2-CreERT2 non-human animal in which the CreERT2 gene is introduced downstream of the Six2 promoter.
  • tamoxifen is contacted with the target organs of the resulting offspring (Fujimoto T, Yamanaka S. Generation of Human Renal Vesicles in Mouse Organ Niche Using Nephron Progenitor Cell Replacement System. 2020;32(11): 108130.
  • DTA non-human animals have a transcription termination sequence sandwiched between two loxP sequences upstream of the gene encoding diphtheria toxin A. Therefore, diphtheria toxin A is not expressed as it is. However, when the transcription termination sequence sandwiched between two loxP sequences is removed by Cre recombinase, diphtheria toxin A is expressed.
  • CreERT2 is normally restricted to the cytoplasm and can only translocate into the nucleus and become active after exposure to tamoxifen. The above example takes advantage of this phenomenon.
  • the created chimeric kidney will be administered the drug for a short period of time or repeatedly, and its toxicity will be evaluated.
  • the reaction in foreign cells derived from the chimeric kidney exposed to the drug will be quantitatively evaluated using methods such as single cell RNA sequencing, immunostaining, laser microdissection, and quantitative PCR.
  • quantitative evaluation is not limited to transcriptional analysis (transcriptomics), and multi-omics analysis including genome analysis (genomics), protein analysis (proteomics), metabolite analysis (metabolomics), etc. can also be used.
  • mice with human-mouse chimeric kidneys In preclinical studies using rodents, for example, by using mice with human-mouse chimeric kidneys, the situation is closer to clinical studies than when analyzing mouse kidneys, which have different expression of transporters than human kidneys. It becomes possible to evaluate the Furthermore, by genetically modifying cells to be transplanted, non-human animals having genetically modified chimeric organs can be produced. Genetically modified foreign cells include genome-edited cells. It is possible to study the differences in reactivity to drugs in chimeric organs containing foreign cells whose transporters have been knocked out by genome editing, which can lead to drug discovery.
  • the blood vessels that supply nutrients to organoids are mainly venous, and transplanted organoids cannot mature to the same level as the original kidney (Ryan AR, England AR. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. 2021;477:98-116.).
  • the present invention is superior to organoid transplantation in that it has been confirmed that foreign cells differentiate into mature nephrons, are connected to the host's urinary tract, and remain engrafted for a long period of 4 months or more. .
  • chimeric kidneys can be created by injecting foreign mouse/rat stem cells into mouse embryos.
  • the chimera formation rate when using human iPS cells is extremely low (see Gafni O, Weinberger L. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. 2013;504(7479):282-6.).
  • human iPS cells may differentiate into neural or reproductive systems, so creating a human chimeric kidney poses high technical and ethical hurdles.
  • human cells differentiated into renal lineage cells can be used, so there is no concern about such ethical issues.
  • mice having genetically modified chimeric organs can be produced quickly and at low cost by genetically modifying foreign cells used to produce chimeric kidneys.
  • the non-human animal of the present invention is preferably a disease model.
  • a pathological model can be created by using cells differentiated into desired progenitor cells from disease-specific human iPS cells as foreign cells.
  • cells with a predetermined disease may be used as foreign cells by genome editing, or human cells may be used as foreign cells and a pathological model may be created by treatment with a drug.
  • the present invention provides a method for producing the above-mentioned non-human animal, which comprises a step of injecting foreign cells into the kidney of a fetus or newborn.
  • the present inventor previously invented a fetal transplantation method in which foreign renal progenitor cells are directly injected into the retroperitoneal region of a fetal mouse inside the mother's body to produce and survive mice with chimeric kidneys (Yamanaka S, Saito Y, Fujimoto T, Takamura T, Tajiri S, Matsumoto K, et al. Kidney Regeneration in Later-Stage Mouse Embryos via Transplanted Renal Progenitor Cells. J Am Soc Nephrol. 2019;30(12):2293-305.).
  • This method has low accuracy in cell injection locations and low survival rate of host fetuses, and a simpler method was required to establish it as an evaluation model.
  • the present inventors developed a method to detect the nephron progenitor cells under the renal capsule of newborn mice at 0-1 days after birth. He invented a neonatal transplantation method that involves direct injection of foreign cells.
  • Examples of the foreign cells injected into the kidney of the newborn host include cells similar to those listed under ⁇ Non-human animals>>.
  • progenitor cells obtained by differentiating pluripotent stem cells derived from a patient with a genetic disease, or progenitor cells in which at least one target gene has been edited by genome editing.
  • progenitor cells By using such progenitor cells, chimeric organs can be produced in 2 to 3 weeks, and the phenotype of the organ can be easily changed.
  • a non-human animal having chimeric organs can be easily produced without relying on the production of genetically modified non-human animals such as the production of knockout mice.
  • organoids are maintained in vivo for about two months, chimeric organs produced in non-human animals according to the present invention are maintained for a long period of time. Therefore, the non-human animals of the invention can withstand repeated dose studies.
  • the foreign cell is preferably a cell having a labeled protein linked to the edited target gene.
  • multiple types of genome editing systems such as the CRISPR-Cas system that modify the functions of multiple types of renal tubular transporters, which are genes responsible for drug-induced renal damage, are introduced into foreign cells.
  • a gene encoding a marker protein linked to the target gene is also loaded onto a vector (eg, adeno-associated virus vector: AAV) equipped with the CRISPR-Cas system.
  • a vector eg, adeno-associated virus vector: AAV
  • a virus vector equipped with a CRISPR-Cas system that modifies each of the three target genes A, B, and C is encoded with a gene encoding a red fluorescent protein, a gene encoding a yellow fluorescent protein, and a gene encoding a green fluorescent protein, respectively.
  • the virus vector loaded with the gene is used to infect progenitor cells as foreign cells in combinations of A, B, C, A+B, A+C, B+C, and A+B+C.
  • non-human animals with chimeric organs produced using each of these foreign cells we will explore combinations of genetic modifications that reduce nephrotoxicity. The details of the optimal combination can be easily recognized from the type of labeled fluorescence.
  • the present invention includes the steps of administering a drug to the non-human animal described above, obtaining a single cell derived from a foreign cell from a chimeric organ after administering the drug, and evaluating the single cell. Provides a drug evaluation method.
  • the method of administration is not particularly limited, and may include intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., as well as intranasal, transbronchial, intramuscular, percutaneous, or Oral methods are mentioned, and it is preferable that the method of administration is determined by the method of administration envisaged in drug development.
  • single cells derived from foreign cells are obtained from the chimeric organ exposed to the drug after drug administration, and the single cells are evaluated. Evaluation methods are not particularly limited, and include techniques such as single cell RNA sequencing, immunostaining, laser microdissection, and quantitative PCR. Since single cells derived from foreign cells are obtained from the chimeric organ and evaluated, the occupancy rate of foreign cells in the chimeric organ may be low. Furthermore, differences in drug sensitivity between foreign cells and host-derived cells can be evaluated simultaneously. For example, as shown in Figure 2, cisplatin (CDDP) was administered to mice with chimeric kidneys, and the presence or absence of the drug was determined in both host-derived cells (native cells) and foreign cells (neo-cells) in the renal tubules. Can be evaluated using a single cell.
  • CDDP cisplatin
  • iPS cells derived from patients as foreign cells and evaluating the effectiveness and safety of drugs using non-human animals produced, it can be useful for tailored medical care.
  • Example 1 The present inventors previously succeeded in producing and surviving mice with chimeric kidneys by directly injecting foreign renal progenitor cells into the retroperitoneal region of fetal mice within their mothers (Yamanaka S, Saito Y , Fujimoto T, Takamura T, Tajiri S, Matsumoto K, et al. Kidney Regeneration in Later-Stage Mouse Embryos via Transplanted Renal Progenitor Cells. J Am Soc Nephrol. 2019;30(12):2293-305.). This method has low accuracy in cell injection locations and low survival rate of host fetuses, and a simpler method was required to establish it as an evaluation model.
  • Cisplatin was intraperitoneally administered to the mouse individual having the chimeric kidney produced in Experimental Example 1 two weeks after transplantation, and the regenerated nephrons were collected 48 hours later and evaluated by fluorescent immunostaining.
  • dose-dependent Kim-1 expression was confirmed in exogenous proximal tubular cells upon administration of cisplatin.
  • single cell RNA sequencing was performed on the collected samples.
  • enhanced expression of disorder-related genes other than Kim-1 was also confirmed.
  • Regenerated nephrons from the individual mice with chimeric kidneys produced in Experimental Example 1 were collected 4 months after transplantation and evaluated by fluorescent immunostaining. As shown in FIG. 8, regenerated nephrons remained even 4 months after transplantation. From this, it was confirmed that chronic repeated administration tests are also possible by taking advantage of the long-term survival of mice with chimeric kidneys.
  • Example 3 In Experimental Example 1, GFP-expressing human nephron progenitor cells were directly injected under the renal capsule of a newborn mouse 0-1 day after birth, instead of cells collected from the kidney of an EGFP mouse embryo. Two weeks after transplantation, foreign nephrons in the cell injection area were examined by immunostaining (see FIG. 9(A)). As shown in FIG. 9(A), the formation of glomeruli and renal tubules derived from GFP-expressing human nephron progenitor cells was confirmed.
  • cisplatin was intraperitoneally administered to individual mice with chimeric kidneys two weeks after transplantation of GFP-expressing human nephron progenitor cells, and regenerated nephrons were collected 48 hours later and evaluated by fluorescent immunostaining. As shown in FIG. 9(B), human Kim-1 expression was confirmed in exogenous proximal tubular cells upon administration of cisplatin.
  • a non-human animal a method for producing a non-human animal, and a method for evaluating a drug, which are suitably used for the development of new drugs and specific treatments for diseases.

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Abstract

外来細胞を含むキメラ臓器を体内に有する、非ヒト動物。

Description

非ヒト動物、及びその利用
　本発明は、非ヒト動物、及びその利用に関する。
　急性腎障害（ＡＫＩともいう。）は、全入院患者の約１５％を占め（例えば、非特許文献１参照。）、Ｓｔａｇｅ１のＡＫＩであっても死亡率、入院期間、医療費ともに有意に上昇させる（例えば、非特許文献２参照。）。
　その中で、薬剤性腎障害はＡＫＩの約２０％を占めており（例えば、非特許文献３参照。）、腎障害をきたしうる抗癌剤、抗菌薬などの使用を控えざるをえないなど、重症疾患の治療選択にも影響を与える。
　また発症原因が医原性であるため医療安全の観点からも問題となる。しかし、その治療は被疑薬の減量・中止や生理食塩水の補液、ステロイド投与といった程度で、特異的な治療法の開発は進んでいない（例えば、非特許文献３参照。）。
　創薬に際しては、齧歯類を用いた前臨床試験によって有害事象、及び治療効果を確認した後に、人体を用いた臨床試験が行われる。しかし、齧歯類における反応は人体での反応と完全には一致しておらず、前臨床試験では確認できなかった腎毒性が臨床試験で初めて指摘され、薬剤開発に頓挫する例も多く、その経済的・時間的損失は甚大である（例えば、非特許文献４参照。）。１９％の新薬が、臨床試験の段階で腎毒性によって頓挫するという報告もある（例えば、非特許文献５参照。）。
Iwagami M, Moriya H, Doi K, Yasunaga H, Isshiki R, Sato I, et al. Seasonality of acute kidney injury incidence and mortality among hospitalized patients. Nephrology Dialysis Transplantation. 2018;33(8):1354-62. Collister D, Pannu N, Ye F, James M, Hemmelgarn B, Chui B, et al. Health Care Costs Associated with AKI. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 2017;12(11):1733-43. Awdishu L, Mehta RL. The 6R’s of drug induced nephrotoxicity. BMC Nephrology. 2017;18(1). Troth SP, Simutis F, Friedman GS, Todd S, Sistare FD. Kidney Safety Assessment: Current Practices in Drug Development. Seminars in Nephrology. 2019;39(2):120-31. Tiong HY, Huang P, Xiong S, Li Y, Vathsala A, Zink D. Drug-induced nephrotoxicity: clinical impact and preclinical in vitro models. Mol Pharm. 2014;11(7):1933-48.
　このような背景から、新規薬剤開発において前臨床試験の段階で腎毒性を正確に検出すること、及び薬剤性腎障害等の腎障害に対する特異的な治療法を開発することの必要性は高く、ヒト腎臓を搭載したキメラマウス、キメララット等の齧歯類動物を用いたヒト腎毒性評価モデルがそのニーズに対処できると考える。
　そこで、本発明は、新規薬剤開発、及び疾患に対する特異的な治療法開発に好適に用いられる非ヒト動物、非ヒト動物の製造方法、及び薬剤評価方法を提供することを目的とする。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］外来細胞を含むキメラ臓器を体内に有する、非ヒト動物。
［２］前記外来細胞は、齧歯類細胞、ヒト細胞、個別の患者由来の細胞、標識細胞、若しくはゲノム編集された細胞、又はこれらを組み合わせた細胞である、［１］に記載の非ヒト動物。
［３］病態モデルである、［１］に記載の非ヒト動物。
［４］薬剤投与モデルである、［１］に記載の非ヒト動物。
［５］［１］～［４］のいずれか一つに記載の非ヒト動物の製造方法であって、
新生仔の腎臓に外来細胞を注入する工程を有する、製造方法。
［６］前記外来細胞は、遺伝性疾患患者由来の多能性幹細胞を分化させてなる前駆細胞である、［５］に記載の製造方法。
［７］前記外来細胞は、少なくとも１種の標的遺伝子が編集された細胞である、［５］に記載の製造方法。
［８］前記外来細胞は、編集された標的遺伝子と紐づけられた標識タンパク質を有する細胞である、［７］に記載の製造方法。
［９］［１］～［４］のいずれか一つに記載の非ヒト動物に薬剤を投与する工程、
薬剤投与後のキメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得し、前記単一細胞を評価する工程を有する、薬剤評価方法。
　本発明によれば、ヒトに特化した安全性評価、薬効評価を利用した新規薬剤開発、及び疾患に対する特異的な治療法開発に好適に用いられる非ヒト動物、非ヒト動物の製造方法、及び薬剤評価方法を提供することができる。
本実施形態の非ヒト動物の製造方法の一例を示す図である。 本実施形態の薬剤評価方法の一例を示す図である。 実験例１における新生仔移植法の一連の工程を示す図である。 実験例１における新生仔マウスの腎被膜下に移植した前駆細胞から形成されたキメラネフロンに対してシングルセル解析を行った結果である。 実験例１における移植２週間後の細胞注入領域における外来ネフロンの割合を、免疫染色にて調べた結果である。 実験例２における移植２週間後のキメラ腎臓を持つマウス個体に、シスプラチンを腹腔内投与し、４８時間後に再生ネフロンを回収して蛍光免疫染色で評価した結果である。 実験例２における移植２週間後のキメラ腎臓を持つマウス個体に、シスプラチンを腹腔内投与し、４８時間後に再生ネフロンを回収してシングルセルRNAシークエンスを行った結果である。 実験例２におけるキメラ腎臓を持つマウス個体において、移植４か月後の再生ネフロンを回収して蛍光免疫染色で評価した結果である。 （Ａ）実験例３におけるＧＦＰ発現ヒトネフロン前駆細胞移植２週間後の細胞注入領域における外来ネフロンを、免疫染色にて調べた結果である。（Ｂ）ＧＦＰ発現ヒトネフロン前駆細胞移植２週間後のキメラ腎臓を持つマウス個体に、シスプラチンを腹腔内投与し、４８時間後に再生ネフロンを回収して蛍光免疫染色で評価した結果である。
≪非ヒト動物≫
　本発明は、１実施形態において、外来細胞を含むキメラ臓器を体内に有する、非ヒト動物を提供する。
　非ヒト動物としては、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。中でも、薬剤評価の実績という観点からは、齧歯類が好ましい。齧歯類としては、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられ、ラット、マウスが好ましい。
　キメラ臓器としては、特に限定されず、肝臓、角膜、皮膚、大腸、小腸、膵臓、胃、筋組織、心臓、肺、食道、骨髄、腎臓、脾臓、精巣、卵巣等が挙げられ、動物実験での評価対象となる臓器が好ましい。
　例えば、薬剤性腎障害の主座となる近位尿細管上皮細胞において、細胞表面のトランスポーターの発現は、ヒトと齧歯類では異なることが知られている。この種差は、創薬における動物実験（前臨床試験）と臨床試験の結果の不一致として以前より指摘されており、実際に動物実験における安全性試験の約３０％が偽陰性であったとの報告がある（種差による限界）。
　また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系で最も一般的な不死化したヒト尿細管上皮細胞の単層培養による毒素添加実験では、トランスポーターのＯＡＴ１及びＯＡＴ３の発現を失っているなど、形質の変化が問題である。近年３Ｄ培養による腎オルガノイドや、流体デバイスを用いて尿細管細胞の極性を保ったまま薬剤毒性を評価するモデルなどが提唱されてはいるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは血流や尿流がないため薬剤の生理的な投与は再現できず、また長期間培養することができないため慢性毒性評価は不可能であるといった問題がある（ｉｎ ｖｉｔｒｏの限界）。
　腎オルガノイドを齧歯類に移植すると、ホスト血管を引き込んで成熟するが、ホストの尿排泄経路に接続されていないために産生した尿によって拡張してしまい、やはり長期間生存させることはできない。
　キメラ臓器が含有する外来細胞としては、特に限定されず、齧歯類細胞、ヒト細胞、個別の患者由来の細胞、標識細胞、若しくはゲノム編集された細胞、又はこれらを組み合わせた細胞が挙げられる。
　本発明は、例えば、マウスの腎発生領域に外来ネフロン前駆細胞を注入して、ホストの腎臓に組み込まれた外来腎臓（キメラ腎臓）を構築するものである。
　キメラ腎臓構築において、外来細胞としては、マウス（同種）、ラット（異種）の胎仔腎細胞、マウスＥＳ細胞から誘導したＮＰＣｓ、ヒトｉＰＳ細胞から誘導したＮＰＣｓが挙げられる。ホストマウスは、胎仔又は新生仔が好ましい。
　本発明の非ヒト動物は、薬剤投与モデルであることが好ましい。係る非ヒト動物は、ヒトとのキメラ臓器を有することが好ましく、新薬開発時の前臨床試験モデルとして好適に用いられる。
　キメラ臓器における外来細胞の割合が低い場合であっても、キメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得し、単一細胞を評価することにより、動物実験における薬剤投与後のヒト臓器への影響を評価することができる。
　また、キメラ臓器における外来細胞の割合を高めるために、調節的にプログラム細胞死を誘導可能な宿主動物等、コンディショナルに、ホストの対象臓器の少なくとも一部を除去するシステムを備えている遺伝子改変非ヒト動物を用いてもよい。
　係るシステムとしては、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性依存的にジフテリア毒素A（ｄｉｐｈｔｅｒｉａ　ｔｏｘｉｎ　Ａ，ＤＴＡ）を発現するＤＴＡ非ヒト動物と、Ｓｉｘ２のプロモーターの下流にＣｒｅＥＲＴ２遺伝子を導入したＳｉｘ２－ＣｒｅＥＲＴ２非ヒト動物とを交配し、得られた子孫の対象臓器にタモキシフェンを接触させるシステムが挙げられる（Fujimoto T, Yamanaka S. Generation of Human Renal Vesicles in Mouse Organ Niche Using Nephron Progenitor Cell Replacement System. 2020;32(11):108130. 参照）。
　ＤＴＡ非ヒト動物は、ジフテリア毒素Ａをコードする遺伝子の上流に２つのｌｏｘＰ配列で挟まれた転写停止配列を有している。このため、そのままではジフテリア毒素Ａを発現しない。しかしながら、Ｃｒｅリコンビナーゼにより、２つのｌｏｘＰ配列で挟まれた転写停止配列が除去されると、ジフテリア毒素Ａを発現するようになる。
　ＣｒｅＥＲＴ２は通常細胞質に限定されており、タモキシフェンに暴露された後でのみ核内に移行し、活性を持つことができる。上記の例ではこの現象を利用している。
　例えば、ＤＴＡ非ヒト動物と後腎間葉特異的にＣｒｅＥＲＴ２を発現するＳｉｘ２－ＣｒｅＥＲＴ２非ヒト動物とを交配すると、得られた子孫の中に後腎組織で組織特異的にジフテリア毒素Ａを発現する非ヒト動物が出現する。なお、Ｓｉｘ２は、後腎間葉で特異的に発現する転写因子である。係る非ヒト動物を用いることで、後腎組織における外来細胞の割合を高めることができる。
　このシステムの大きな利点としては、ＤＴＡとＣｒｅＥＲＴ２が非ヒト動物の後腎間葉特異的に発現するため、ヒト細胞を含む外来細胞に対する毒性の懸念がないことが挙げられる。
　次いで、作製したキメラ腎臓に対して、薬剤の短期間投与や反復投与を行い、毒性を評価する。詳細には、シングルセルＲＮＡシークエンス、免疫染色、レーザーマイクロダイセクションと定量ＰＣＲ法といった手法で、薬剤を暴露されたキメラ腎臓由来の外来細胞における反応を定量評価する。また、定量評価は、転写解析（トランスクリプトミクス）に限られず、ゲノム解析（ゲノミクス）・蛋白質解析（プロテオミクス）・代謝物解析（メタボロミクス）等を含めたマルチオミックス解析も利用可能である。
　齧歯類を用いた前臨床試験において、例えばヒトとマウスとのキメラ腎臓を有するマウスを用いることにより、ヒト腎臓とはトランスポーターの発現の異なるマウス腎臓で解析する場合よりも臨床試験に近い状況での評価が可能となる。
　また、移植する細胞に遺伝子改変を加えることで、遺伝子改変キメラ臓器を有する非ヒト動物を作製することができる。遺伝子改変された外来細胞としては、ゲノム編集された細胞が挙げられる。ゲノム編集によりトランスポーターをノックアウトした外来細胞を含むキメラ臓器の薬剤への反応性の違いを検討して創薬に繋げることができる。
　また、外来細胞として、疾患特異的細胞を用いて作製したキメラ臓器を有する非ヒト動物を用いることにより、病態解明や治療法開発に繋げることができる。
　また、ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト腎細胞培養系において、成熟尿細管細胞の二次元培養では、細胞のトランスポーターの発現が消失するなどの形質変化が起こる（Jenkinson SE,　Chung GW. The limitations of renal epithelial cell line HK-2 as a model of drug transporter expression and function in the proximal tubule. 2012;464(6):601-11.参照）。幹細胞から腎オルガノイドを作製する三次元培養においても、十分に成熟した腎臓を作製することができておらず、腎障害を評価するために必要なトランスポーターの発現が不十分である（Wu H, Uchimura K. Comparative Analysis and Refinement of Human PSC-Derived Kidney Organoid Differentiation with Single-Cell Transcriptomics. 2018;23(6):869-881.e8.参照）。
　これらの培養系は、いずれも薬剤を培地に添加して腎障害を検証する際に、尿細管の管腔側及び基底膜側のいずれもが区別なく薬剤に暴露されてしまい、生体内での薬物動態を再現することができない。
　この問題を解消するために、マイクロ流体デバイスを用いて、尿細管細胞を管腔状に配置して薬剤に暴露させる試みはなされているが、やはり薬剤が血管内を通って糸球体で濾過されて、尿細管においても排泄・再吸収されているという生理的な挙動を正確に再現することは困難である。さらに、培養においては長期間腎臓を維持することができず、慢性評価モデルとしては不適切である。
　本発明は、これらの問題点をクリアしている。
　また、ヒト腎オルガノイドのｉｎ ｖｉｖｏ移植において、オルガノイドを齧歯類に移植すると、ホスト血管を引き込んで成熟することが知られている（van den Berg CW, Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. 2018;10(3):751-765.参照）。しかしながら、移植されたヒト腎オルガノイドは、ホストの尿排泄経路に接続されていないために産生した尿によって拡張してしまい、２ヶ月以上の長期間は生存させることはできず廃絶してしまう。
　また、オルガノイドに栄養を供給する血管は、静脈系が主体であることもあり、移植したオルガノイドは本来の腎臓と同程度まで成熟させることはできない（Ryan AR, England AR. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. 2021;477:98-116.）。
　本発明は、外来細胞が成熟ネフロンに分化すること、ホストの尿路に接続されて４ヶ月以上の長期に渡って生着することが確認されており、その点でオルガノイド移植よりも優れている。
　また、マウス胚に外来のマウス・ラット幹細胞を注入することでキメラ腎臓を作製できることが報告されている。しかし、ヒトｉＰＳ細胞を用いた場合のキメラ形成率は極めて低い（Gafni O, Weinberger L. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. 2013;504(7479):282-6.参照）。さらに、ヒトｉＰＳ細胞が神経・生殖系に分化する懸念があるため、ヒトキメラ腎臓を作製するには技術的・倫理的ハードルが高い。それに対して、本発明では、腎系譜細胞に分化したヒト細胞を用いることができるため、そのような倫理的問題の懸念はない。
　また、遺伝子改変マウスの作製には１年以上要し、複数の遺伝子改変にはさらに時間がかかり、費用も高額となる。本発明においては、キメラ腎臓を作製する際の外来細胞に遺伝子改変を加えることで、早期に、低コストで、遺伝子改変キメラ臓器を有するマウスを作製することができる。
　また、標的遺伝子を組み込んだウイルス等を全身・局所投与することでｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集を行う試みは報告されているが、腎臓は糸球体濾過バリアのためウイルスが到達しづらく、ノックイン効率が悪い（Rubin JD, Barry MA. Improving Molecular Therapy in the Kidney. Mol Diagn Ther. 2020;24(4):375-96.参照。）。本発明において、予めゲノム編集を加えた幹細胞を選別・拡大培養した上で移植してキメラ腎臓を作製する方が効率的に遺伝子改変を行うことができる。
　非ヒト動物の生体内で機能するヒト腎臓を、前臨床試験段階で運用する技術はこれまでなかったが、ｉＰＳ細胞技術やゲノム編集技術の向上から研究は加速しており、キメラ技術を利用した研究開発は大きなインパクトを有する。
　本発明の非ヒト動物は、病態モデルであることが好ましい。例えば、疾患特異的ヒトｉＰＳ細胞から所望の前駆細胞に分化させた細胞を外来細胞として用いることにより、病態モデルを作製することができる。また、ゲノム編集により、所定の疾患細胞を外来細胞として用いてもよく、ヒト細胞を外来細胞として用い、薬剤処理により、病態モデルを作製してもよい。
　係る病態モデルを用いることにより、薬剤性腎障害及び遺伝性腎臓病等のアンメットメディカルニーズの高い疾患の病態解明や治療法開発を行うことができる。
≪非ヒト動物の製造方法≫
　本発明は、１実施形態において、上述した非ヒト動物の製造方法であって、胎仔又は新生仔の腎臓に外来細胞を注入する工程を有する、製造方法を提供する。
　本発明者は、以前母体内の胎仔マウスの後腹膜領域に、直接外来腎前駆細胞を注入して、キメラ腎臓を持つマウス個体を産出させて生存させる胎仔移植法を発明した(Yamanaka S, Saito Y, Fujimoto T, Takamura T, Tajiri S, Matsumoto K, et al. Kidney Regeneration in Later-Stage Mouse Embryos via Transplanted Renal Progenitor Cells. J Am Soc Nephrol. 2019;30(12):2293-305.)。
　この方法は、細胞注入場所の正確性、及びホスト胎仔の生存率が低く、評価モデルとして確立する上ではより簡便な方法が求められた。そこで、マウスは出生後３日程度まではネフロン前駆細胞が残存し、腎発生が継続していることを活用して、本発明者は、出生後０－１日の新生仔マウスの腎被膜下に、外来細胞を直接注入する新生児移植法を発明した。
　ホスト新生仔の腎臓に注入する外来細胞としては、≪非ヒト動物≫で挙げたものと同様の細胞が挙げられる。病態モデルを作製する場合には、遺伝性疾患患者由来の多能性幹細胞を分化させてなる前駆細胞、又はゲノム編集により少なくとも１種の標的遺伝子が編集された前駆細胞を用いることが好ましい。
　係る前駆細胞を用いることにより、２～３週間でキメラ臓器を作製することができ、臓器の表現型を容易変更できる。本発明によれば、ノックアウトマウスの作製等、遺伝子改変非ヒト動物の作製に依存せず、簡便にキメラ臓器を有する非ヒト動物を製造できる。また、オルガノイドでは、生体内での維持は２か月程度であるところ、本発明により製造された非ヒト動物内のキメラ臓器は、長期間維持される。従って、本発明の非ヒト動物は、反復投与試験に耐えることができる。
　また、外来細胞は、編集された標的遺伝子と紐づけられた標識タンパク質を有する細胞であることが好ましい。図１に示す様に、例えば、薬剤性腎障害の原因遺伝子である複数種の尿細管トランスポーターの機能を改変する複数種類のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム等のゲノム編集システムを外来細胞に導入する。その際、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを搭載するベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター：ＡＡＶ）に標的遺伝子と紐づけられた標識タンパク質をコードする遺伝子も搭載しておく。例えば、３種類の標的遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれを改変するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを搭載するウイルスベクターに、それぞれ赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、黄色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を搭載し、係るウイルスベクターをＡ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、Ａ＋Ｂ＋Ｃの組み合わせで外来細胞としての前駆細胞に感染させる。これら外来細胞のそれぞれを用いて製造されるキメラ臓器を有する非ヒト動物を用いて、腎毒性が軽減するような遺伝子改変の組み合わせを探索する。最適な組み合わせの詳細は、標識した蛍光の種類から容易に認識することができる。これを創薬にも応用して、核酸医薬や低分子化合物を用い薬剤性腎障害に対する特異的治療法の開発につなげることができる。
　一方、ゲノム編集動物においては、３種以上の遺伝子の編集による表現型の変更は多大な労力と時間を要し、組み合わせの探索には不適である。
≪薬剤評価方法≫
　本発明は、１実施形態において、上述した非ヒト動物に薬剤を投与する工程、薬剤投与後のキメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得し、前記単一細胞を評価する工程を有する、薬剤評価方法を提供する。
　非ヒト動物に薬剤を投与する工程において、投与方法は特に限定されず、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的方法が挙げられ、薬剤開発において想定される投与方法によって決定されることが好ましい。
　次いで、薬剤投与後の薬剤を暴露されたキメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得し、単一細胞を評価する。評価方法としては、特に限定されず、シングルセルＲＮＡシークエンス、免疫染色、レーザーマイクロダイセクションと定量ＰＣＲ法といった手法が挙げられる。キメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得して評価するため、キメラ臓器中の外来細胞の占有率は低くてもよい。また、外来細胞とホスト由来の細胞における薬剤に対する感受性の違いを同時に評価することができる。例えば、図２に示す様に、キメラ腎臓を有するマウスにシスプラチン（ＣＤＤＰ）を投与し、尿細管でのホスト由来の細胞（ｎａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）と 外来細胞（Ｎｅｏ－ｃｅｌｌ）それぞれにおける薬剤有り無しを単一細胞で評価できる。
　また、外来細胞として患者由来のｉＰＳ細胞を用いて、作製した非ヒト動物を用いて薬剤の有効性や安全性を評価することにより、テーラーメード医療に役立てることができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
　本発明者らは、以前母体内の胎仔マウスの後腹膜領域に、直接外来腎前駆細胞を注入して、キメラ腎臓を持つマウス個体を産出させて生存させることに成功した(Yamanaka S, Saito Y, Fujimoto T, Takamura T, Tajiri S, Matsumoto K, et al. Kidney Regeneration in Later-Stage Mouse Embryos via Transplanted Renal Progenitor Cells. J Am Soc Nephrol. 2019;30(12):2293-305.)。
　この方法は、細胞注入場所の正確性、及びホスト胎仔の生存率が低く、評価モデルとして確立する上ではより簡便な方法が求められた。そこで、マウスは出生後３日程度まではネフロン前駆細胞が残存し、腎発生が継続していることを活用して(Hartman HA, Lai HL. Cessation of renal morphogenesis in mice. 2007;310(2):379-87.参照)、出生後０－１日の新生仔マウスの腎被膜下に、ＥＧＦＰマウス胎仔Ｅ１４腎臓由来から採取した細胞を直接注入した（図３参照。）。
　新生仔マウスの腎被膜下に移植した前駆細胞から形成されたキメラネフロンに対してシングルセル解析を行った（図４参照）。図４に示す様に、外来細胞が成熟尿細管に分化していることが確認された。
　更に、移植２週間後の細胞注入領域における外来ネフロンの割合を、免疫染色にて調べた（図５参照）。図５に示す様に、キメラ状の糸球体、近位～遠位尿細管の形成が確認された。外来細胞は成熟尿細管のマーカーを発現していることが確認された。
［実験例２］
　実験例１で作製した、移植２週間後のキメラ腎臓を持つマウス個体に、シスプラチンを腹腔内投与し、４８時間後に再生ネフロンを回収して蛍光免疫染色で評価した。図６に示す様に、シスプラチン投与により外来性の近位尿細管細胞に用量依存性のＫｉｍ－１発現が確認された。
　また、回収したサンプルに対して、シングルセルRNAシークエンスを行った。図７に示す様に、Ｋｉｍ－１以外の障害関連遺伝子の発現の増強も確認された。
　実験例１で作製した、キメラ腎臓を持つマウス個体において、移植４か月後の再生ネフロンを回収して蛍光免疫染色で評価した。図８に示す様に、移植４か月後も再生ネフロンが残存していた。このことから、キメラ腎臓を持つマウス個体が、長期間生存することを活かし、慢性反復投与試験も可能であることが確認された。
［実験例３］
　実験例１において、ＥＧＦＰマウス胎仔Ｅ１４腎臓由来から採取した細胞に代えて、ＧＦＰ発現ヒトネフロン前駆細胞を、出生後０－１日の新生仔マウスの腎被膜下に直接注入した。移植２週間後の細胞注入領域における外来ネフロンを、免疫染色にて調べた（図９（Ａ）参照）。図９（Ａ）に示す様に、ＧＦＰ発現ヒトネフロン前駆細胞由来の糸球体、及び尿細管の形成が確認された。
　また、ＧＦＰ発現ヒトネフロン前駆細胞移植２週間後のキメラ腎臓を持つマウス個体に、シスプラチンを腹腔内投与し、４８時間後に再生ネフロンを回収して蛍光免疫染色で評価した。図９（Ｂ）に示す様に、シスプラチン投与により外来性の近位尿細管細胞にヒトＫｉｍ－１発現が確認された。
　本発明によれば、新規薬剤開発、及び疾患に対する特異的な治療法開発に好適に用いられる非ヒト動物、非ヒト動物の製造方法、及び薬剤評価方法を提供することができる。

Claims (9)

  1. 　外来細胞を含むキメラ臓器を体内に有する、非ヒト動物。
  2. 　前記外来細胞は、齧歯類細胞、ヒト細胞、個別の患者由来の細胞、標識細胞、若しくはゲノム編集された細胞、又はこれらを組み合わせた細胞である、請求項１に記載の非ヒト動物。
  3. 　病態モデルである、請求項１に記載の非ヒト動物。
  4. 　薬剤投与モデルである、請求項１に記載の非ヒト動物。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の非ヒト動物の製造方法であって、
    　胎仔又は新生仔の腎臓に外来細胞を注入する工程を有する、製造方法。
  6. 　前記外来細胞は、遺伝性疾患患者由来の多能性幹細胞を分化させてなる前駆細胞である、請求項５に記載の製造方法。
  7. 　前記外来細胞は、少なくとも１種の標的遺伝子が編集された細胞である、請求項５に記載の製造方法。
  8. 　前記外来細胞は、編集された標的遺伝子と紐づけられた標識タンパク質を有する細胞である、請求項７に記載の製造方法。
  9. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の非ヒト動物に薬剤を投与する工程、
    　薬剤投与後のキメラ臓器から外来細胞由来の単一細胞を取得し、前記単一細胞を評価する工程を有する、薬剤評価方法。
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