WO2004087898A1 - 哺乳類胚への外来細胞の移植法 - Google Patents

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WO2004087898A1
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Takashi Kuwana
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Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
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    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for transplanting foreign cells into a mammalian embryo. Specifically, the present invention relates to a technique for producing a chimeric organ and a chimeric animal composed of a foreign cell and a host cell by introducing and engrafting a foreign cell into a target organ of a fetus by transplanting it into an embryo in the uterus.
  • a technique for producing a chimeric organ and a chimeric animal composed of a foreign cell and a host cell by introducing and engrafting a foreign cell into a target organ of a fetus by transplanting it into an embryo in the uterus.
  • Chimeric animals are applied in various fields such as gene function search, production of useful substances, regenerative medicine, disease model animal production, livestock breed improvement, and preservation of rare organisms.
  • ES cells embryonic stem cells
  • ES cells are blastocysts, fertilized eggs with advanced cleavage (in the case of mice, fertilization, day 3).
  • In vitro cells are cultured in vitro to dissociate and pass the cell mass.
  • a chimeric animal can be produced in which host embryos (cells derived from fertilized eggs) and cells derived from ES cells are mixed.
  • germline chimera can be obtained when ES cells differentiate into breeding line cells. Therefore, the cells were introduced by repeated mating based on this chimeric mouse.
  • ES cells differentiate into germline cells. It depends on the efficiency, and the efficiency depends on the origin and lineage of ES cells.
  • Another method for creating chimeric animals and organs is the conventional method of injecting organ cells into adults.
  • Typical examples include bone marrow transplantation, organ transplantation, and organ regeneration by introducing foreign cells derived from the same organs into the liver and knee.
  • spermatozoa derived from foreign mice have been successfully formed in the testis by injecting testis-derived cells into the vas deferens of another mouse testis (see Non-Patent Document 1).
  • germline stem cells contained in the foreign spermatogonia (Germline stem cel l) are generated as spermatogonia in the host testis to form sperm.
  • PGC primordial germ cells
  • progenitor cells progenitor cells
  • ova and sperm progenitor cells
  • PGCs are located away from the gonad area in the future, move to the gonad primordium just before the reproductive epithelium differentiates, move in the blood circulation, and eventually settle in the reproductive epithelium.
  • Into functional germ cells To achieve. In birds, embryos are laid off the mother's body as an egg, and embryo morphogenesis proceeds in the egg. Therefore, manipulation of the embryo at the early stage of embryogenesis (morphogenesis stage) can be easily performed.
  • circulating PGCs from early embryos can be collected together with blood cells, separated, and injected into the blood of another chicken embryo.
  • Mixed chimera gonads can be created.
  • Exogenous PGCs are engrafted on the germline without changing from host-derived PGCs, forming sperm and eggs, so that progeny derived from foreign cells can be obtained. With this method, foreign cells can be differentiated into target organs without causing an immune response in the host.
  • hematopoietic cells can be introduced into the embryo via the placenta (see Non-Patent Document 5), or neural crest cells can be injected into the amniotic cavity from the outside of the uterine wall using an injection pipette in the early stage of implantation.
  • a method of introducing cells into the dorsal side of the neural crest where the cells are being closed and the vicinity thereof has been reported.
  • the target organ especially the important organs (lung, heart, gastrointestinal tract) on the ventral side of the neural tube of the embryo.
  • the method of introducing cells into the liver, kidney, knee, gonad, etc. has not yet been reported.
  • Non-Patent Document 4
  • An object of the present invention is to provide a method for transplanting foreign cells into a mammalian embryo and a method for engrafting in a target organ, and engrafting as an organ-constituting cell to differentiate and develop, and specifically, a morphogenesis stage.
  • a method for fixing foreign cells in the fetal organ by transferring (injecting) the foreign cells into the space between the embryo (fetus) and the placenta, and a chimeric organ and a chimeric animal produced by the method To do.
  • mammals have As a result, we have found a method for transferring cells from the outside to the conceptus in the maternal body during pregnancy, introducing foreign cells into the target organ, and completing a system for creating a chimeric organ and thus a chimeric animal. More specifically, the mother animal is laparotomized under anesthesia, primordial germ cells are injected into the extraembryonic body cavity between the embryo (fetus) and the placenta, and the transferred cells are the developing gonads in the fetus. It was examined whether it was introduced into the group.
  • the present invention makes it possible to introduce the transferred cells into the target organ by utilizing the morphogenic activity associated with the progression of ontogeny in mammals. The details are as follows.
  • a method for transplanting foreign cells into a mammalian embryo comprising transferring the foreign cells into a space between a morphogenic embryo and a placenta in a mammalian body,
  • the morphogenesis period is the period from the time when the extraembryonic body cavity is formed to the time when the extraembryonic body cavity and the intraembryonic cavity are completely divided, and the transplantation of foreign cells into the mammalian embryo of [1] Method,
  • the cavity between the embryo and placenta is selected from the group consisting of extraembryonic body cavity, chorionic amniotic cavity, yolk sac, allantoic cavity, and blood vessels connecting fetus and placenta, [1] or [2] Transplanting foreign cells into mammalian embryos,
  • [4] A method for transplanting a foreign cell according to any one of [1] to [3], wherein the foreign cell is an embryonic or somatic stem cell or primordial germ cell,
  • [5] A method for producing a chimeric organ or a chimeric animal, including the development and growth of an embryo transplanted by a foreign cell transfer method into a mammalian embryo according to any one of [1] to [4],
  • a cell selected from the group consisting of an embryonic stem cell, a somatic stem cell, and a primordial germ cell is transplanted into a mammalian embryo in a mammalian body, the cell is introduced into the gonad, and is generated and grown in the mammalian body.
  • a method for producing a germline chimeric animal comprising:
  • a cell selected from the group consisting of embryonic stem cells, somatic stem cells and primordial germ cells is transplanted into a mammalian embryo in the mammalian body, the cells are introduced into the gonad, and are generated and grown in the mammalian body.
  • Fig. 1 is a schematic diagram of embryo development from the primary stage to the somite stage. From the early primordial stage (the upper part of the figure), the extraembryonic body cavity, chorionic amniotic cavity, yolk sac, and allantoic cavity can be clearly identified.
  • the chorionic amniotic cavity develops to envelop the embryo (upper left figure, middle left arrow), and yolk stalks are formed so that the intra-embryonic body cavity can be identified (middle figure).
  • the extra-embryonic and intra-embryonic cavities are completely separated and the umbilical cord is formed (bottom of the figure).
  • Fig. 2 is a diagram showing a method for transplanting foreign cells into a mammalian embryo.
  • the anesthetized maternal animal is opened, and a pipette is inserted into the extraembryonic body cavity from the outer wall of the uterus to inject foreign cells (primordial germ cells).
  • Upper row Pregnant parent and uterus.
  • a mouse is a prolific animal, and a conceptus (embryo, placenta, etc.) is formed in each uterus of the uterus shown in the enlarged view.
  • Middle of the figure Pregnancy 8. Shows the conception product (cross section) in the pupa on the fifth day.
  • the embryo is located in about two thirds of the decidua from the endometrium.
  • the embryo is usually positioned with the dorsal side facing the mesentery. Cells were injected into the extraembryonic body cavity as shown in the figure.
  • the present invention is a method for fixing foreign cells in a fetal organ by transferring (injecting) the foreign cells into a space between a morphogenic embryo (fetus) and a placenta in a mammalian body.
  • the present invention can be applied to any kind of animal as long as the target animal is a mammal in which embryo development occurs in an eclampsia. Examples include mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, goats, hidges, rabbits, pigs, dogs, cats, monkeys and the like.
  • the cavity that can be used as a place to transfer foreign cells can be a candidate anywhere between the fetus and the placenta, but the “extraembryonic body cavity” or “chorionic amniotic cavity” is preferred. Also,
  • Yocular sac”, “allantoic cavity”, and “blood vessels” that connect the fetus and the placenta can also be candidates.
  • any embryo that is in the morphogenesis stage can be used. Yes.
  • the morphogenesis phase refers to the time when a new morphological feature is formed in the process of development of the organism, and refers to the time when the growth and deformation of the constituent cells occur. Even during the morphogenesis stage, the blastocyst stage and beyond are desirable, and from the time when the extraembryonic body cavity is formed, the “intraembryonic body cavity” is formed from a part of the extraembryonic body cavity along with the formation of the yolk stalk.
  • the time of development until the external body cavity and the definitive body cavity are completely separated is desirable (see Figure 1).
  • embryonic day 6 the time when the embryo can be confirmed from outside the uterus after implantation
  • 13 days the time when the extraembryonic body cavity is completely separated from the intraembryonic body cavity: complete
  • the period when the umbilical cord is formed it may be at any time, but 8.0 to 8.5 days (the period when the extraembryonic body cavity is clearest) is the most desirable period.
  • any method can be used for introducing foreign cells as long as the cells can be injected into the cavity.
  • a normal injection needle may be used, or a glass microphone mouth pipette may be used.
  • injecting into the cavity it is not always necessary to pass through the wall of the uterus, and it can be injected freely from any direction as long as it can be injected into the cavity.
  • the exogenous cell transferred to the embryo refers to a cell derived from an individual other than the animal individual into which the cell is transferred, and the origin animal may be a mammal or an animal other than a mammal.
  • the origin animal may be a mammal or an animal other than a mammal.
  • foreign cells there are no particular limitations on foreign cells, and any cell can be used without distinction between the same and different types.
  • cells that contribute to the germ line are cell lines that inherit their genetic traits to future offspring, such as sperm and eggs.
  • differentiated cells cells with similar properties (eg, EG cells: embryonic germ cell), or stem cells and somatic cells such as ES cells, retain their traits by dedifferentiation or genetic modification Or the acquired cell.
  • EG cells embryonic germ cell
  • stem cells and somatic cells such as ES cells
  • Such cells that contribute to the germ line can be obtained by known techniques.
  • ES cells It can be obtained by culturing the inner cell mass of blastocysts in vitro during mammalian development (Evans, MJ et al., Nature, 292: 154-156, 1981; Thomson, JA, Sc ience, 282: 1145-1147, 1998), EG cells can be obtained by culturing mammalian primordial germ cells together with LIF, FG F2, etc. (Matus i, Y., et al., Cel, 70: 841-847, 1992).
  • the candidate is preferably a somatic (tissue) stem cell such as a hematopoietic stem cell, a neural stem cell, or a hepatic stem cell.
  • somatic stem cell such as a hematopoietic stem cell, a neural stem cell, or a hepatic stem cell.
  • mesenchymal stem cells originating from the mesoderm produce cells that can differentiate into various tissues and can therefore target various organs.
  • the foreign cells defined in the present invention include cells that have been genetically modified by genetic manipulation such as new gene introduction, knock-in, knock-in, etc. with respect to these candidate cells.
  • the genetic modification is a modification of a gene associated with a specific disease
  • a model animal for the specific disease can be obtained by transferring the genetically modified cells.
  • a chimeric organ or a chimeric animal capable of producing the useful protein can be obtained.
  • a chimeric organ is a cell having two or more different genetic traits, or an organ formed between groups of cells between different animals, expressing each genetic trait, and It is characterized by the formation of affected organs.
  • mosaic there is a similar term “mosaic”, but in a mosaic there is a single parent that is the origin of a cell, but a chimera is distinguished in that it has two or more parents.
  • the process of chimera organ formation if the transferred cells contributed to the organ formation, and their genetic traits If it affects the organ formation more strongly, the organ will acquire a trait / function closer to the animal species / strain of the transferred cell.
  • the created chimeric organ forms an organ that does not cause immune rejection to animals that originate in cells that have been transferred between different species, and that has the same function as the origin animal. It is possible.
  • the present invention provides techniques necessary for applying embryonic and somatic stem cells and primordial germ cells identified in mammals to fields such as regenerative medicine. That is, the present invention can be used in research on cell lineages such as the differentiation mechanism of these stem cells, and in technology development for actually creating organs and individuals from these cells.
  • the present invention includes a chimeric organ and a chimeric animal produced by the above-described method. Furthermore, when a foreign cell is introduced into the gonad and differentiated into a germ line cell in the chimeric animal, a germ line chimeric animal is formed. Individuals derived from foreign cells can be created by mating animals. The present invention also includes the progeny animals thus obtained.
  • Example 1 an isolated embryonic germ cell that had been pre-fluorescent-labeled was injected into the extraembryonic space of the embryonic organ embryo of the mouse embryo, and injected into the gonad primordium of the host embryo. Indicates that we were able to introduce
  • This example was performed as follows. Anesthetize the mother of ICR mice on the 8.5th day of pregnancy (the day of vaginal plug confirmation is day 0), and expose the pregnant uterus in the abdominal cavity by abdominal wall incision. Mouse embryos are implanted within about two thirds of the decidua from the endometrium, and the embryo is often located with the dorsal side facing the endometrium. In advance, the uterine wall near the implantation site was lightly scratched with a 27G needle, and then the primordial germ cells previously fluorescently labeled with PKH26 were injected with a glass micropipette (see Figure 2). Microphone A mouth pipette having a tip diameter of about ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ was used.
  • the volume of fluid injected is approximately 1.01, and the number of cells per embryo is approximately 380.
  • the embryos were removed and the gonad primordium of the embryos was observed in physiological saline with a fluorescence microscope to observe the distribution of the injected chicken primordial germ cells.
  • embryos with the presence of fluorescently labeled cells in the host gonad primordium are fixed to Rothman, and then the tissue cells are prepared and introduced into the chick primordial germ cell-specific PAS positive. It was confirmed.
  • the injection procedure was performed on 153 embryos, and 101 embryos survived. It was confirmed that the chicken primordial germ cells injected in one of the cases were established in the host mouse embryo gonad primordium.
  • murine embryonic embryos are injected into the extraembryonic space of the embryo through the outer wall of the uterus, and pollen particles (cassaki pollen) having a diameter similar to that of the primordial progenitor cells are injected. It shows that the injected particles could be introduced.
  • This example was performed as follows. 8.5 days and 9.5 days of pregnancy
  • the micropipette has a tip diameter of about 100
  • the injected volume is approximately 1.
  • O I and the number of cells per embryo is approximately 4
  • the present invention is a technique for transplanting cells into a mammalian goblet embryo and contributes to developmental engineering research and its practical application. According to the present invention, it is possible to clarify the life, death, growth, and differentiation of an exogenous cell during the ontogeny process, and to clarify the position in the cell lineage. The present invention also makes it possible to produce chimeric organs and chimeric animals, and to create organs and individuals with new characteristics. These can be used as transplantation research such as regenerative medicine, its means, and materials.
  • germline chimeras when cells that contribute to the germline are used, it is possible to efficiently produce germline chimeras, save species, rescue rare organisms, preserve species in industrial animals, create transgenic animals, Produces new genetic marker animals at the cellular level, creates disease model animals, synthesizes useful substances by genetic manipulation-production, provides applications for technology development such as assay methods for toxic effects on reproductive stem cells is there.

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Abstract

　外来の細胞を哺乳類胚に移植する方法および目的臓器に生着させ、臓器構成細胞として生着させ分化・発育させるための方法の提供。　哺乳類体内の形態形成期の胚と胎盤の間の腔に外来細胞を移入することを含む外来細胞の哺乳類胚への移植方法。

Description

哺乳類胚への外来細胞の移植法
技術分野
本願発明は、 外来細胞の哺乳類胚への移植方法に関する。 詳細には外来細胞を 子宮内の胚へ移植することによつて胎児の目的臓器に導入、 生着させることによ つて外来細胞と宿主細胞より成るキメラ臓器およびキメラ動物を作製する技術に 関する。 本願発明によって得られるキメラ臓器およびキメラ動物によって、 遺伝 子の機能探索や有用物質産生、 再生医療に必要な移植臓器および細胞の開発、 疾 患モデル動物、 家畜の品質改良、 遺伝子組換え動物の開発、 希少動物の保存など を可能ならしめるものである。
背景技術
宿主由来の細胞と宿主以外の細胞が混じり合って形態形成された動物をキメラ 動物という。 キメラ動物は、 遺伝子の機能探索や、 有用物質の産生、 再生医療、 疾患モデル動物の作製、 家畜の品種改良、 希少生物の保存など様々な分野へ応用 されている。
キメラ動物を作る手法として、 胚性幹細胞 （ES細胞と称する） を使う方法が主 に行われている。 ES細胞とは胚盤胞と呼ばれる卵割の進んだ受精卵（マウスの場 合受精 3. 5日目）の内部細胞塊の細胞を in vi t roで培養し、 細胞塊の解離と継代を 繰り返すことによって得られた多分化能（pluripotency)を保持し、 正常核型を維 持したまま無制限に増殖し続ける幹細胞のことで、 この細胞を胚盤胞の割腔中へ 注入することによって、 宿主胚 （受精卵由来の細胞） と ES細胞由来の細胞が混じ り合ったキメラ動物を作ることができる。 さらにマウスにおいては， ES細胞が生 殖系列の細胞へ分化した場合には生殖系列キメラ（germ l ine chimera)を得るこ とができることから、 このキメラマウスを元に交配を重ねることにより導入した
ES細胞由来のマウス個体を作ることが可能である。 しかし、 この方法では、 ES細 胞が目的臓器に含まれるかどうかは制御できず、 偶然を期待する他なかった。 導 入した ES細胞由来の動物個体を得る効率は、 ES細胞が生殖系列の細胞に分化する 効率に依存しており、 ES細胞の由来、 系列によってその効率は異なる。
キメラ動物、 臓器をつくる別の手法として、 従来から行われている成体に臓器 細胞を注入する方法がある。 例えば、 骨髄移植や臓器移植、 肝臓や膝臓へ同じ臓 器由来の外来細胞を導入することによる臓器再生が代表例である。 また、 マウス において精巣由来の細胞を別のマウス精巣の輸精管中に注入することによって精 巣内で外来マウス由来の精子形成に成功している （非特許文献 1を参照） 。 この 時、 外来精原細胞の中に含まれる生殖細胞系の幹細胞 （Germl ine s tem cel l) が 宿主精巣の中で精原細胞として発生し、 精子を形成している。 このことから、 こ のキメラ精巣を持ったマウスを元に交配することによって、 外来細胞由来の精子 から子孫を作製することが可能になった。 これらの方法は、 ES細胞を用いる方法 に比べて、 目的臓器に特異的に外来細胞を生着、 成熟させることができる。 しか し、 成体に外来細胞を注入して目的臓器で細胞を生着させる方法であるため、 外 来細胞に対する移植拒絶という免疫反応をいかに制御するかが問題となっている。 そのため、 免疫抑制剤を使用するか、 同種同系同士の動物間、 あるいは免疫不全 状態の動物を用いて行われるなどの制限が生じている。
これら 2つの方法とも、 外来から導入された細胞が生殖細胞系列の細胞に分化 することによって外来細胞の形質を子孫に伝達することができるので、 導入する 外来細胞に各種の遺伝子操作を加えることにより多彩な改変動物を作成すること が可能である。 このため、 前述した様々な用途に適した動物を作り出す手法とし て利用されている。 しかし、 ES細胞法の場合、 ES細胞が導入できる受精卵の時期 ( 8細胞期胚から胚盤胞） ではまだどの臓器に分化するか特定化できず、 成体に 臓器細胞を移入する方法では、 外来細胞を特定臓器へ分化させることは可能だが、 成体に導入するため拒絶反応など免疫反応に対処する必要があった。 このため、 免疫反応など成体の反応を起こさずに外来細胞を目的臓器特異的に分化させるた めの新たな方法が求められていた。
一方、 鳥類においては、 胚発生の初期に出現する始原生殖細胞 （P G Cと称す る） と呼ばれる将来卵子や精子に分化する祖細胞 （生殖幹細胞） を用いて子孫を 得る技術が確立されている （非特許文献 2を参照） 。 PGCは将来の生殖巣部域か ら離れた場所に存在しており、 生殖上皮が分化する直前に生殖巣原基に向かって 血液循環にのって移動し、 やがて生殖上皮内に定着し、 機能的な生殖細胞へと分 化を遂げる。 鳥類では、 胚は卵として母体外に産み落とされ、 卵の中で胚の形態 形成が進行することから、 胚発生初期 （形態形成期） の胚の操作が容易に実施可 能である。 例えば、 発生初期のニヮトリ胚より循環している PGCを血球とともに 採取し、 分離し、 それを別系統のニヮトリ胚の血液中に注入することが可能で、 効率的に外来細胞由来と宿主細胞の混じり合ったキメラ生殖巣を作製することが できる。 外来 PGCは宿主由来の PGCと何ら変わることなく生殖原基に生着し、 精子 や卵子を形成するため、 外来細胞由来の子孫を得ることができる。 この方法であ れば、 宿主に免疫反応を起こさずに、 外来細胞を目的臓器に分化させることがで きる。
しかし、 哺乳類では胚の発生及び形態形成が母体の子宮内で胎盤を介した物質 代謝を行いながら進行する。 このため形態形成途中の胚を体外に取り出すことは 胚へのダメージが大きく、 その後の個体形成も難しくなるため、 鳥類の場合のよ うな発生途中の胚を操作することは難しい。 そこで、 胚を母体外に取り出さずに 胚を操作しょうとした試みがいくつか知られている。 例えば、 哺乳類初期胚への ウィルス導入方法として、 胚に直接ウィルスを注入 (非特許文献 3を参照）または ウィルス産生細胞を注入（非特許文献 4を参照）することによって、 ウィルスを効 率良くすベての体細胞中に導入しょうとする報告がある。 更に造血系細胞を胎盤 経由で胚へと導入する方法 （非特許文献 5を参照） や、 神経冠細胞を着床初期に 羊膜腔内に子宮壁外よりインジェクションピぺットを用いて注入して、 細胞を閉 鎖しつつある神経冠背側部およびその近傍に導入する方法 （非特許文献 6を参 照） が報告されている。 しかしながら、 感染性のあるウィルスを胚へと導入する ことは可能であっても細胞を標的器官へと導入する方法、 特に胚の神経管より腹 側にある重要な臓器 （肺、 心臓、 消化管、 肝臓、 腎臓、 膝臓、 生殖巣等） への細 胞導入の方法は未だに報告されていない。
これらのことから、 哺乳類における胚操作は、 ES細胞の場合のように、 操作後 の胚を子宮内へ戻すことができる時期、 すなわち胚が形態形成を開始する以前の ごく限られた発生初期にしか実施することができないのが現状である。 従って、 生殖系列細胞を発生中の胚に直接導入して生殖系列キメラを効率良く作製する方 法は知られておらず、 鳥類の場合のように生殖幹細胞を他個体の胚へ移植して子 孫を得ることはできなかった。 非特許文献 1
Brinster, L, R. 2002 Germline Stem Cell Transplantation and Tr ansgenesis. Science 296: 2174-2176.
非特許文献 2
桑名 貴. 1994鳥類始原生殖細胞の胚間移植. 実験医学 12: P260-2
65.
非特許文献 3
Jaenisch, R. 1980. Retroviruses and embryogenesis: Mircoinject ion of Moloney leukemia virus into midgestation mouse embryos. Cell : 19: 181-188.
非特許文献 4'
Stuhliann, H.， R Cone, R. C. Mulligan, and R. Jaenisch. 1984. Introduction of a selectable gene into different animal tissue by a ret ro - virus recombinant vector. Proc. Nati. Acad. Sci. 81: 7151-7155.
非特許文献 5
Fleischman, R. and B. Mintz. 1979. Prevention of genetic anemi as in mice by microinjection of normal hematopoietic stem eel Is into the fetal placenta. Proc. Nati. Acad. Sci. 76: 5736-5740.
非特許文献 6
Jaenisch, R. 1985. Mammalian neural crest cells participate in normal embryonic development on microinjection into post-implantation m ouse embryos. Nature 318: 181-183.
発明の開示
本発明は、 外来の細胞を哺乳類胚に移植する方法および目的臓器に生着させ、 臓器構成細胞として生着させ分化 ·発育させるための方法の提供を目的とし、 具 体的には形態形成期の胚 （胎児） と胎盤の間の腔へ外来細胞を移入 （注入） する ことによって胎児の臓器内に外来細胞を定着させる方法および該方法により作出 されたキメラ臓器、 キメラ動物の提供を目的とする。
本発明者らは前述の問題点を解決すべく、 種々の検討を重ねた結果、 哺乳類に おいて、 妊娠中の母獣体内の受胎産物に外部より細胞を移入する方法を見出し、 外来細胞を目的臓器へ導入させ、 キメラ臓器ひいてはキメラ動物を作るシステム を完成させるに至った。 さらに詳細には、 母獣を麻酔下開腹し、 胚 （胎児） と胎 盤との間に存在する胚体外体腔内に始原生殖細胞を注入し、 移入細胞が胎児内の 発達中の生殖巣原基に導入されるかどうか検討した。 その結果、 注入された始原 生殖細胞は、 目的の生殖巣原基へ導入されることを見いだした。 つまり本発明は、 哺乳類において個体発生の進行に伴った形態形成活動を利用して移入細胞の目的 臓器への導入を可能ならしめるものであり、 詳細には以下の通りである。
[1] 哺乳類体内の形態形成期の胚と胎盤の間の腔に外来細胞を移入することを 含む外来細胞の哺乳類胚への移植方法、
[ 2 ] 形態形成期が、 胚外体腔が形成された時期から胚外体腔と胚体内腔とが完 全に分断されるまでの時期である、 [1]の外来細胞の哺乳類胚への移植方法、
[3] 胚と胎盤の間の腔が、 胚外体腔、 絨毛羊膜腔、 卵黄嚢、 尿膜腔、 胎児と胎 盤をつなぐ血管からなる群から選択される、 [1]または [2]の外来細胞の哺乳類 胚への移植方法、
[4] 外来細胞が、 胚性もしくは体性の幹細胞または始原生殖細胞である、 [1] から [3]のいずれかの外来細胞の哺乳類胚への移植方法、
[5] [1]から [4]のいずれかの外来細胞の哺乳類胚への移植方法により移植さ れた胚を哺乳類体内で発生 ·成長させることを含むキメラ臓器またはキメラ動物 を作出する方法、
[6] 胚性幹細胞、 体性幹細胞および始原生殖細胞からなる群から選択される細 胞を哺乳類体内の哺乳類胚へ移植し、 該細胞を生殖巣へ導入し、 前記哺乳類体内 で発生 ·成長させることを含む生殖系列キメラ動物を作出する方法、
[7] [ 1 ]から [4 ]のいずれかの外来細胞の哺乳類胚への移植方法を用いて作出 されたキメラ臓器またはキメラ動物、
[ 8 ] 胚性幹細胞、 体性幹細胞および始原生殖細胞からなる群から選択される細 胞を哺乳類体内の哺乳類胚へ移植し、 該細胞を生殖巣へ導入し、 前記哺乳類体内 で発生 ·成長させることにより作出された生殖系列キメラ動物、 および
[9] [8]の生殖系列キメラ動物を交配して得られる外来細胞由来の細胞からな る子孫動物。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願特願 2003- 096169号の明 細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 原条期から体節期にかけての胚の発生模式図である。 原条期初期 （図 上段） より、 胚外体腔、 絨毛羊膜腔、 卵黄嚢、 尿膜腔は明確に識別できる。
胚発生に伴って絨毛羊膜腔は胚子を包むように発育し （上段左図、 中段左図の矢 印） 、 卵黄茎が形成され胚内体腔が識別できるようになる （図中段） 。 更に発生 が進行することで胚外体腔と胚内体腔が完全に分断され、 臍帯が形成される （図 下段） 。
図 2は、 外来の細胞を哺乳類胚に移植する方法を示す図である。 麻酔下の母獣 を開腹し、 胚体外体腔に子宮外壁よりピペットを揷入し外来細胞 （始原生殖細 胞） を注入する。 図上段：妊娠親獣と妊娠子宮を示す。 マウスは多産性動物で拡 大図に示す子宮の各房毎に受胎産物 （胚子、 胎盤など） が形成される。 図中段： 妊娠 8. 5日目の子宫内の受胎産物 （断面図） を示す。 胚子は子宮間膜から約三分 の二の脱落膜内に位置する。 図下段：胚の拡大図。 胚子は通常背側を子宮間膜側 に向けて位置する。 細胞の注入は図に示す如く胚外体腔内に行った。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、 哺乳類体内の形態形成期の胚 （胎児） と胎盤の間の腔へ外来細胞を 移入 （注入） することによって胎児の臓器内に外来細胞を定着させる方法である。 対象動物としては、 子宫内で胚発生が生じる哺乳類であれば、 いかなる種類の 動物であっても本発明は適応可能である。 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター、 モルモット、 ゥサギ、 ャギ、 ヒッジ、 ゥシ、 ブタ、 ィヌ、 ネコ、 サル等が挙げら れる。
外来細胞の移入場所として利用可能な腔所は、 胎児と胎盤の間の腔所ならどこ でも候補となりうるが、 「胚外体腔」 もしくは 「絨毛羊膜腔」 が望ましい。 また、
「卵黄嚢」 「尿膜腔」 、 さらには胎児と胎盤をつなぐ 「血管」 も候補となり うる。 外来細胞の移入時期としては、 形態形成期の胚であればどの時期でも対象とな りうる。 ここで、 形態形成期とは生物の発生の過程で新しい形態的特徴が形成さ れる時期をいい、 構成細胞の増殖 '変形 .移動が生じている時期をいう。 形態形 成期の中でも、 胚盤胞期以降が望ましく、 さらに胚外体腔が形成された時期から、 卵黄茎の形成に伴って胚外体腔の一部から 「胚内体腔」 が形成されて胚外体腔と 胚体内腔とが完全に分断されるまでの発生時期が望ましい （図 1参照） 。 マウス の場合に例えるならば、 胎生 6日 （胚が着床後、 子宮外部より確認が可能となる 時期） から 1 3日 （胚外体腔が胚内体腔とが完全に分断される時期：完全な臍帯 が形成される時期 （図 1参照） ） の間ならいつでも構わないが、 8 . 0〜8 . 5 日 （原条期：胚外体腔が最も明瞭な時期） が最も望ましい時期である。 本発明の 方法によれば、 哺乳類体内から胚を取り出す必要がなく、 哺乳類体内に存在する 胚に外来細胞を移入すればよい。
外来細胞を導入する方法については腔所に細胞を注入できる方法であればいか なる方法も利用可能である。 通常の注射針を用いてもよいし、 ガラス製のマイク 口ピペットでもかまわない。 さらに、 腔所に注入する場合、 必ず子宮壁を通す必 要はなく、 腔所に注入できるのであれば、 いかなる方向からも自由に注入するこ とができる。 また、 例えば、 マウスの場合、 発生 1 0日以降では子宮壁を切開し て胚膜を露出してから注入することも可能である。
本発明において胚に移入する外来細胞は、 細胞が移入される動物個体以外の個 体由来の細胞をいい、 起源動物は哺乳類であってもよいし、 哺乳類以外の動物で あってもよい。 外来細胞に特段の限定はなく、 いかなる細胞であっても、 同種、 異種の区別なく利用可能である。 但し、 目的臓器に移入細胞を定着させるために は、 目的臓器を構成する細胞と同じ細胞系譜または、 同じ細胞系譜へ分化するよ うに運命づけられた細胞を用いる必要がある。 例えば、 生殖巣へ細胞を導入し、 生殖系列細胞へ分化、 発育させる場合は、 移入する細胞として生殖系列へ寄与す る細胞を用いることが重要である。 生殖系列に寄与する細胞とは、 将来精子や卵 子といった子孫にその遺伝形質が伝搬する細胞系列のことで始原生殖細胞 （PGC
) やこの細胞が分化した細胞、 同様の性質を持つ細胞 （例えば、 EG細胞： embryo nic germ cel l) 、 または E S細胞などの幹細胞や体細胞を分化、 脱分化または 遺伝子改変によりその形質を保持、 または獲得した細胞のことを示す。 このよう な生殖系列に寄与する細胞は公知の手法により得ることができ、 例えば ES細胞は 哺乳類の発生過程において胚盤胞の内部細胞塊を in vi t ro で培養することによ り得られるし（Evans, M. J. e t al. , Nature, 292 : 154-156, 1981 ; Thomson, J. A. , Sc ience, 282 : 1145-1147, 1998)、 EG細胞は哺乳類始原生殖細胞を LIF、 FG F2等のサイト力インと共に培養することにより得られる（Matus i, Y. , e t al. , C el l, 70 : 841-847, 1992)。
生殖巣以外の臓器をターゲッ卜にする場合も同様に、 その臓器に分化する能力 を持った細胞を移入することが望ましい。 その候補としては、 造血幹細胞、 神経 幹細胞、 肝幹細胞、 など体性 （組織） 幹細胞といわれる細胞の使用が望ましい。 これらの幹細胞は、 その肝細胞に特異的な表面抗原を指標にして、 FACS等を用い て得ることができる。 最近では、 これら体性幹細胞の中にも環境に応じて幅広い 分化能を持っていることが明らかとなっているので、 必ずしも目的臓器特異的な 幹細胞が必要とは限らない （J iang, Y. et al. , 2002. Plur ipotency of mesenc hyial s t em cel l s derived f rom adul t marrow. Nature 418 : p41-49. ) 。 例え ば、 中胚葉に起源する間葉系幹細胞は種々の組織へ分化し得る細胞を生み出すの で種々の臓器をターゲットとすることができる。
また、 本発明で定義する外来細胞の中には、 これらの候補細胞に対して例えば 新たな遺伝子導入やノックァゥト、 ノックインなどの遺伝子操作により遺伝的に 改変された細胞も含まれる。 遺伝的な改変が特定の疾患に関連する遺伝子の改変 である場合、 遺伝的に改変された細胞を移入することにより特定の疾患のモデル 動物を得ることができる。 また有用タンパク質をコードする遺伝子を外来細胞に 組込むことにより、 該有用タンパク質を産生し得るキメラ臓器、 キメラ動物を得 ることができる。 本発明の方法により、 外来細胞を移入した胚をそのまま哺乳類 体内で発生させ成長させることにより、 外来細胞由来の細胞と該細胞が移入され た動物個体由来の細胞を併せ持つキメラ臓器およびキメラ個体を得ることができ る。 ここで、 キメラ臓器とは、 2つ以上の異なる遺伝的形質をもつ細胞、 あるい は異種の動物間の細胞群間より形成される臓器のことで、 それぞれの遺伝的形質 を発現し、 また影響を受けた臓器が形成されていることを特徴とする。 類似して モザィクという用語があるが、 モザイクでは細胞の起源となる親は 1対であるが， キメラは親が 2対以上あった場合をいう点で両者は区別される。 キメラ臓器形成 過程で、 移入した細胞の臓器形成へ優位に寄与した場合や、 またその遺伝的形質 がより強く臓器形成に影響すれば、 臓器は移入した細胞の動物種 ·系統により近 い形質 ·機能を獲得することになる。 例えば、 作出されたキメラ臓器は、 異種間 においても移入した細胞に起源を持つ動物に対して、 免疫的な拒絶反応を引き起 こさない臓器、 また起源動物と同様な機能を持つ臓器を形成させることが可能で ある。
このような本発明の方法を使えば、 従来不可能であった形態形成期の胚の操作 が可能となり、 目的のキメラ臓器、 キメラ動物を簡便かつ効率的に作出すること ができる。 また、 本発明は、 哺乳類において同定された胚性及び体性の幹細胞な らびに始原生殖細胞を再生医療などの分野への応用するため必要な技術を提供す る。 すなわち、 本発明は、 これら幹細胞の分化メカニズム等め細胞系譜に関する 研究、 および実際にこれら細胞より臓器、 個体を作出する技術開発において利用 可能である。
本発明は上記方法により作出されたキメラ臓器およびキメラ動物を含み、 さら にキメラ動物において外来細胞が生殖巣へ導入され、 生殖系列細胞へ分化した場 合は生殖系列キメラ動物ができ、 生殖系列キメラ動物を交配することにより外来 細胞由来の個体を作成することができる。 本発明はこのようにして得られる子孫 動物をも包含する。
以下、 実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、 これら実施例は本発 明の範囲を限定するものではない。
〔実施例 1〕
実施例 1では、 マウス胚の器官形成期胚の胚体外腔に子宮外壁を通して、 予め 蛍光標識を施したニヮトリの単離始原生殖細胞を注入、 ホスト胚の生殖巣原基中 に注入始原生殖細胞を導入することができたことを示す。
本実施例は、 以下のようにして行った。 妊娠 8. 5日 （膣栓確認日を 0日とする） の ICRマウス母獣を麻酔し、 腹壁切開によって腹腔内にある妊娠子宮を露出させ る。 マウス胚の着床場所は、 子宮間膜から約三分の二の脱落膜内で、 胚は背側を 子宮間膜側に向けて位置していることが多い。 あらかじめ、 27Gの注射針で着床 部位付近の子宮壁に軽く傷をつけ、 その後ガラスマイクロピぺットで PKH26によ つて予め蛍光標識したニヮトリ始原生殖細胞を注入した （図面 2参照） 。 マイク 口ピペットは、 先端の直径は約 Ι ΟΟ ΠΙのものを用いた。 注入した液量は約 1. 0 1 で、 胚あたりの細胞数はおよそ 380個である。 ホスト胚に細胞を注入した後、 子宮を腹腔内に戻し、 腹筋を縫合、 皮膚を 9 醒ゥゥンドクリップ （オートクリツ プゥゥンドクリップアプライヤー #7630 (BECTON DICKINSON社製） 、 滅菌クリツ プ #7632) で塞いだ。 37°C保温器中で、 麻酔から覚醒させ後、 レシピエン母獣の 飼育を継続した。
妊娠 10. 5日に胚を摘出して、 胚の生殖巣原基を生理食塩水中で実態蛍光顕微鏡 により観察して、 注入したニヮトリ始原生殖細胞の分布を観察した。 更に、 ホス ト生殖巣原基内に蛍光標識された細胞の存在が確認された胚はロスマン固定の後、 組織切片を作製して導入された細胞がニヮトリ始原生殖細胞特異的な PAS陽性 であることを確認した。
153例の胚に注入操作を行い、 生存していた胚は 101例であった。 その内の 1例 で注入したニヮトリ始原生殖細胞がホストのマウス胚生殖巣原基内に定着してい たことが確認できた。
〔実施例 2〕
本実施例は、 マウス胚の器官形成期胚の胚体外腔に子宮外壁を通して、 始原生 殖細胞と直径が近い花粉粒子 （カジノキ花粉） を注入、 ホスト胚の胸腔および腹 腔にある種々の臓器中に注入粒子を導入することができたことを示す。
本実施例は、 以下のようにして行った。 妊娠 8. 5日および 9. 5日 （膣栓確認日を
0日とする） の ICRマウス母獣を麻酔し、 復壁切開によって復腔内にある妊娠子宮 を露出させる。 マウス胚の着床場所は、 子宮間膜から約三分の二の脱落膜内で、 胚は背側を子宮間膜側に向けて位置していることが多い。 あらかじめ、 27Gの注 射針で着床部位付近の子宮壁に軽く傷をつけ、 その後ガラスマイクロピぺットで 予め四酸化オスミウムで染色、 滅菌後に洗浄したカジノキ花粉 （Polysc iences,
Inc. , Warrington, PA) を注入した。 マイクロピペットは、 先端の直径は約 100
/ mのものを用いた。 注入した液量は約 1. O I で、 胚あたりの細胞数はおよそ 4
00個である。 ホスト胚に細胞を注入した後、 子宮を腹腔内に戻し、 腹筋を縫合、 皮膚を 9 mmゥゥンドクリップ （オートクリップゥゥンドクリップアプライヤー #
7630 (BECTON DICKINSON社製) 、 滅菌クリップ #7632) で塞いだ。 37で保温器中 で、 麻酔から覚醒させた後、 レシピエン母獣の飼育を継続した。 妊娠 15. 0日に胚 を摘出して、 胚をブアン固定してアルコール脱水、 パラフィン包埋の後に連続切 片として注入花粉粒子の胚体内分布を観察した。
妊娠 8. 5日および 9. 5日のマウス胚に花粉粒子を注入した結果、 胚体内に分布し ている全花粉粒子の 1. 81%が胸腔内に、 0. 82%のものが腹腔内 （臍帯内、 消化管内、 肝臓、 膝臓近傍） に分布していた。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明は哺乳類杯胚への細胞の移植技術であり、 発生工学の研究およびその実 用化に貢献するものである。 本発明により、 外来細胞の個体発生過程での生死、 発育、 分化を明らかにすることができ、 細胞系譜での位置づけを明確化できる。 また本発明は、 キメラ臓器、 キメラ動物を作出し、 新たな形質をもった臓器およ び個体作出を可能とする。 これらは再生医療等の移植研究やその手段、 材料とし て利用できる。 さらに生殖系列に寄与する細胞を用いる場合は、 効率的な生殖系 列キメラの作製が可能となり、 種の保存、 希少生物の救済、 産業動物における原 種等の保存、 トランスジエニック動物の作製、 細胞レベルでの新しい遺伝子マ一 カー動物の作出、 疾患モデル動物の作成、 遺伝子操作による有用物質の合成 -産 生、 生殖幹細胞に対する毒性作用の検定法等の技術開発への応用を提供するもの である。

Claims

請求の範囲
1 . 哺乳類体内の形態形成期の胚と胎盤の間の腔に外来細胞を移入すること を含む外来細胞の哺乳類胚への移植方法。
2 . 形態形成期が、 胚外体腔が形成された時期から胚外体腔と胚体内腔とが 完全に分断されるまでの時期である、 請求項 1に記載の外来細胞の哺乳類胚への 移植方法。
3 . 胚と胎盤の間の腔が、 胚外体腔、 絨毛羊膜腔、 卵黄嚢、 尿膜腔、 胎児と 胎盤をつなぐ血管からなる群から選択される、 請求項 1または請求項 2に記載の 外来細胞の哺乳類胚への移植方法。
4 . 外来細胞が、 胚性もしくは体性の幹細胞または始原生殖細胞である、 請 求項 1から請求項 3のいずれか 1項に記載の外来細胞の哺乳類胚への移植方法。
5 . 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載の外来細胞の哺乳類胚への移植方 法により移植された胚を哺乳類体内で発生 ·成長させることを含むキメラ臓器ま たはキメラ動物を作出する方法。
6 . 胚性幹細胞、 体性幹細胞および始原生殖細胞からなる群から選択される 細胞を哺乳類体内の哺乳類胚へ移植し、 該細胞を生殖巣へ導入し、 前記哺乳類体 内で発生 ·成長させることを含む生殖系列キメラ動物を作出する方法。
7 . 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載の外来細胞の哺乳類胚への移植方 法を用いて作出されたキメラ臓器またはキメラ動物。
8 . 胚性幹細胞、 体性幹細胞および始原生殖細胞からなる群から選択される 細胞を哺乳類体内の哺乳類胚へ移植し、 該細胞を生殖巣へ導入し、 前記哺乳類体 内で発生 ·成長させることにより作出された生殖系列キメラ動物。
9 . 請求項 8に記載の生殖系列キメラ動物を交配して得られる外来細胞由来 の細胞からなる子孫動物。
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