CN104887714A - 肠道微生物紊乱精神分裂症动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肠道微生物紊乱精神分裂症动物模型的构建方法。本发明通过人粪便灌胃的方式，将精神分裂症患者紊乱的肠道微生物移植至无菌小鼠，行为学分析发现移植精神分裂症患者肠道微生物的无菌小鼠表现出典型的精神分裂症样行为，即精神运动性兴奋症状。该模型的成功构建为研究肠道微生物在精神分裂症发生中的作用机制提供了新的研究载体。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型构建领域，具体是一种通过人肠道微生物移植方式构建精神分裂症动物模型的方法。
背景技术
精神分裂症是一种高患病率、高复发率、高致残率的慢性迁延性疾病，多起病于青壮年，表现为情感、思维、意志行为等多方面障碍及精神活动与周围环境不协调。据世界卫生组织统计，全球精神分裂症患病率约为3.8‰-8.4‰，我国约有780万的患者正在遭受精神分裂症的折磨。精神分裂症不仅严重损害患者的生活质量及社会功能，且给个人、家庭以及社会带来巨大压力和沉重的精神及经济负担。我国卫生部调查显示，未来20年，包括精神分裂症在内的精神疾病将造成约100万亿元人民币的经济损失，这将给全球经济带来巨大冲击。现今，我国精神疾患占疾病总负担的20%，预计到2020年，这一比率将升至25%。因此，加强精神分裂症的防治已成为亟待解决的重大公共健康问题。但迄今为止，精神分裂症的发病机制不清，严重制约了该病的有效防治。肠道微生物是人体最大、最直接的外环境，对维持人体健康发挥着重要作用。研究表明，肠道微生物可通过“微生物-肠-脑”轴影响脑功能与行为，成为现今解析神经精神疾病机制新的热点与前沿。临床研究发现，精神分裂症患者伴有肠道微生物紊乱。因此，发明一种新的精神分裂症动物模型来研究肠道微生物在精神分裂症发生中的作用及其分子机制十分必要。
发明内容
本发明的目的主要是通过人粪便灌胃移植方法，将精神分裂症患者肠道微生物植入无菌小鼠，并采用多种精神分裂症相关的行为评价方法评价所构建的模型。
为了实现上述目的本发明采用的技术方案，肠道微生物紊乱精神分裂症动物模型的构建方法步骤如下：
（1）分别采集n例精神分裂症患者与n例健康人的中段粪便，液氮速冻，-80℃冰箱保存，n为正整数；
（2）分别将步骤（1）处理后的粪便于4℃复融，然后分别称取0.1g分别溶于1.5mL无菌PBS溶液，震荡5min，静置5min后取上层悬浮液；
（3）将步骤（2）得到的n例精神分裂症患者的粪便悬浮液，分别取等量混合，取200uL混合后的精神分裂症患者粪便悬浮液通过灌胃针注入无菌小鼠胃内；同理，取等量的n例健康人粪便悬浮液混合，取200uL混合后的健康人粪便悬浮液通过灌胃针注入无菌小鼠胃内；
（4）将步骤（3）粪便灌胃操作2周后的小鼠进行行为学评价。
通过采用以上方法构建动物模型本发明具有如下的有益效果：无菌鼠是采用无菌繁殖、无菌饲养培育出新型模式动物，其体内不带有任何的微生物，是目前研究菌群与疾病相互关系的最理想模式动物。通过粪便灌胃方式，可将精神分裂症患者及健康对照人群的肠道微生物分别植入无菌鼠体内，可明确肠道微生物在精神分裂症发生中的作用及其分子机制。
附图说明
图1为本发明的实施流程图；
图2为本发明的行为学结果统计图。
具体实施方式
纳入精神分裂症患者及健康对照；
诊断标准：由两名主治级别以上的精神科医师独立诊断，所有候选者均需符合DSM-Ⅳ精神分裂症发作的诊断标准。
实验动物：实验动物选用4-6周龄无菌昆明小鼠。
主要试剂：磷酸盐缓冲液（PBS）。
主要仪器：12号灌胃针，振荡器。
实验流程参见图1。
1 精神分裂症患者与健康对照的纳入标准与排除标准
精神分裂症患者纳入与排除标准
纳入标准：所有纳入的精神分裂症患者均需符合DSM-Ⅳ精神分裂症发作的诊断标准。年龄大于18岁，小于60岁。近期未服用抗生素、益生菌、泻剂等药物。
排除标准：现伴有其它精神疾病或既往有其它精神疾病病史者。合并躯体性疾病者。实验室常规检查（如肝功能、血常规、尿常规、大便常规）异常者。处于妊娠、哺乳、月经期的女性研究对象。药物及物质滥用史。
健康对照纳入与排除标准：无神经精神疾病病史，无药物滥用史或依赖史，无躯体疾病；常规实验室检测无明显异常。近期未服用抗生素、益生菌、泻剂等药物。
2 粪便采集方法与储存方法
采集方法：在避免与尿液混合的情况下取中段粪便，置于15mL无菌离心管内。液氮速冻。
储存方法：储存于-80℃冰箱内。
3 粪便处理以及灌胃移植方法
粪便处理：粪便于4℃复融，每个供体的粪便称取0.1g分别溶于1.5mL无菌PBS溶液，震荡5min，静置5min后取悬浮液。
灌胃移植：每例精神分裂症患者的粪便悬浮液取等量混合，将200uL混合后的精神分裂症患者粪便PBS悬浮液通过灌胃针注入无菌小鼠胃内。同样，每例健康对照人群的粪便悬浮液取等量混合，取200uL混合后的健康对照粪便PBS悬浮液以同样方式注入对照无菌小鼠胃内。
4 行为学评价方法
情绪异常及精神运动紊乱是精神分裂症的核心特征。为评估该模型是否成功复制了精神分裂症患者的行为表型，对植入精神分裂症患者或健康对照人群粪便的无菌小鼠进行旷野实验（反映运动能力及焦虑情绪）及强迫游泳实验(反映抑郁情绪)。所有行为学均在灌胃2周后进行，并采用视频监控系统（SMART）记录。
旷野实验：记录小鼠在旷场（45cm*45cm）中30min的运动总距离，中心区域（旷场内25%区域）运动距离百分比和中心区域（旷场内25%区域）运动时间百分比。其中，运动总距离反映小鼠的运动能力，该值越大，说明运动能力越强；中心区域运动距离百分比和中心区域运动时间百分比反映小鼠的焦虑情绪，该值越大，说明焦虑情绪越弱。
旷野实验数据如下：
| 分组 | 运动总距离（m） | 中心区域运动距离（%） | 中心区域运动时间（%） |
| 对照小鼠 | 114.80±9.49 | 7.83±1.23 | 5.2±0.96 |
| 精分小鼠 | 149.17±9.76 | 15.02±0.82 | 9.11±0.74 |
| P值 | 0.015 | 0.000 | 0.002 |
强迫游泳：将小鼠置于水（游泳容器15cm*20cm）中适应1min，继续记录并分析小鼠后5min内累计不动时间。强迫游泳的累计不动时间反映小鼠的抑郁情绪，该值越大，说明抑郁情绪越重。
强迫游泳（FST）实验数据如下：
| 分组 | FST 不动时间（s） | FST 不动时间% |
| 对照小鼠 | 160.08±3.31 | 53.35±1.10 |
| 精分小鼠 | 70.42±3.73 | 23.47±1.24 |
| P值 | 0.000 | 0.000 |
注：以上行为学数据均以均值±标准误表示。
参见图2，本发明的行为学结果：与对照组（CON）小鼠相比，精分组（SCZ）小鼠运动能力增强（图中A）、焦虑行为减少（图中B-C）、抑郁行为减少（图中D）。
Claims (5)
1. 肠道微生物紊乱精神分裂症动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）分别采集n例精神分裂症患者与n例健康人的中段粪便，液氮速冻，-80℃冰箱保存，n为正整数；
（2）分别将步骤（1）处理后的粪便于4℃复融，然后分别称取0.1g分别溶于1.5mL无菌PBS溶液，震荡5min，静置5min后取上层悬浮液；
（3）将步骤（2）得到的n例精神分裂症患者的粪便悬浮液，分别取等量混合，取200uL混合后的精神分裂症患者粪便悬浮液通过灌胃针注入无菌小鼠胃内；同理，取等量的n例健康人粪便悬浮液混合，取200uL混合后的健康人粪便悬浮液通过灌胃针注入无菌小鼠胃内；
（4）将步骤（3）粪便灌胃操作2周后的小鼠进行行为学评价。
2.根据权利要求1所述肠道微生物紊乱精神分裂症动物模型的构建方法，其特征在于：所述行为学评价包括，对小鼠进行旷野实验和强迫游泳实验。
3.根据权利要求1或2所述肠道微生物紊乱精神分裂症动物模型的构建方法，其特征在于：所述小鼠为4-6周龄无菌昆明小鼠。
4.根据权利要求2所述肠道微生物紊乱精神分裂症动物模型的构建方法，其特征在于：所述旷野实验为记录小鼠在旷场中，30min内运动总距离，中心区域运动距离百分比和中心区域运动时间百分比。
5.根据权利要求2所述肠道微生物紊乱精神分裂症动物模型的构建方法，其特征在于：所述强迫游泳实验为将小鼠置于水中适应1min，继续记录并分析小鼠后5min内累计不动时间。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110178787A (zh) * | 2019-05-08 | 2019-08-30 | 河南中医药大学 | 一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103430903A (zh) * | 2013-09-11 | 2013-12-11 | 桂林医学院 | 制备机会性感染和慢性消耗性疾病非人动物模型的方法及利用该模型筛选的药物 |
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| CN110178787A (zh) * | 2019-05-08 | 2019-08-30 | 河南中医药大学 | 一种运用粪菌移植法建立自闭症大鼠模型的方法 |
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