RU2611201C2

RU2611201C2 - Высокобезопасный способ получения очищенных фракций стволовых клеток

Info

Publication number: RU2611201C2
Application number: RU2013143852A
Authority: RU
Inventors: Джанни СОЛЬДАТИ; Тициано ТАЛЛОНЕ
Original assignee: Свисс Стем Селл Фаундейшн
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2017-02-21
Also published as: US20150218521A1; ES2525273T3; CN103842496B; BR112013028726A2; JP2015530100A; IL237978A0; RU2013143852A; HK1197920A1; CA2839800A1; HRP20141138T1; JP6062055B2; US20170015977A1; KR20150046274A; DK2726602T3; SMT201500018B; EP2726602B2; EP2726602A1; EP2726602B1; CN103842496A; WO2014048501A1

Abstract

Изобретение относится к биохимии. Описан способ получения фракций стволовых клеток, имеющих происхождение из липидной ткани, включающий стадии: (a) сбора или получения образца липидной ткани, содержащей стволовые клетки; (b) промывания образца со стадии (а) подходящим водным буфером; (c) инкубирования образца со стадии (b) с ферментом, способным перерабатывать липидную ткань и извлекать из нее стволовые клетки; (d) инактивирования фермента, использованного на стадии (с), и извлечения водной фазы из продукта со стадии (с); (e) очистки водной фазы, полученной на стадии (d); (f) титрования водной фазы, полученной на стадии (е), и, если необходимо, ее разбавления, чтобы получить конечную фракцию стволовых клеток с желаемой концентрацией и объемом, в котором материал, содержащий стволовые клетки, обрабатывают в шприце на всем протяжении по меньшей мере стадий: (а), (b) и (с), указанный шприц, выполняет функции собирающего устройства, фазового разделителя и технологического реактора. Изобретение обеспечивает высокобезопасный способ получения очищенных фракций стволовых клеток липидного происхождения, в котором предусматривается использование индивидуального собирающего устройства; снижение количества переносов и манипуляций, которым подвергается материал, содержащий стволовые клетки, понижая до минимума риски загрязнения, потери материала и случайный обмен образцами, и дальнейшее упрощение взаимодействия и сотрудничества между персоналом, извлекающим сырьевой материал, и экспертом по выделению стволовых клеток. 11 з.п. ф-лы, 1 пр.

Description

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Стволовые клетки приобретают возрастающий интерес в косметической и медицинской практике в связи с их способностью генерировать новые биологические ткани, применимые к пациентам, которые по разным причинам потеряли данные ткани или способность их регенерировать.

В частности, взрослые стволовые клетки, например те, которые имеют липидное или миелоидное происхождение, вызвали особый интерес благодаря своей более контролируемой эффективности, а также из-за привилегированности с точки зрения этических ограничений, которые применяют к эмбриональным стволовым клеткам.

Типичная область применения стволовых клеток липидного происхождения представляет собой такую из ткани, которая заполняется для косметических целей: в данном случае, пациент, нуждающийся в лечении, дает часть своей собственной липидной ткани (липоаспират); ее обрабатывают путем лабораторного восстановления очищенной клеточной фракции, после чего инъекционно вводят обратно в организм пациента в те области тела, которые требуют заполнения. Полученная клеточная фракция называется стромальной васкулярной фракцией (SVF) и представляет собой общее количество ядросодержащих клеток, извлеченных из жировой ткани. Как правило, от 10 до 20% данных клеток являются стволовыми клетками, называемыми также мезенхимальными стволовыми клетками. Они являются полипотенциальными и способными к восстановлению или регенерации нескольких типов тканей человека. Использование аутологической липидной ткани предупреждает риск иммунных реакций и отторжение ткани. Кроме того, данные извлеченные клетки затем могут храниться замороженными в течение длительного периода времени в жидком азоте в распоряжении донора для дальнейшего лечения, включая использование стволовых клеток в терапиях стволовыми клетками человека

Способы получения очищенных клеточных фракций ткани липидного происхождения известны в данной области с уровня техники.

Они обычно включают восстановление исходного липидного сырьевого материала, селективную экстракцию компонента стволовых клеток, удаление истощенной липидной матрицы, и окончательную промывку, очистку и получение фракции стволовых клеток в походящей концентрации и объеме. Данные процессы с использованием переноса материала, содержащего стволовые клетки, через несколько пипеток, пробирок, бекеров и т.д., предполагают значительный риск бактериального загрязнения и/или потерю материала, поэтому они требуют очень строгих процедур в отношении стерильности окружающей среды и различных используемых материалов, многократные промывания, чтобы восстановить, возможно, прилипший материал, все добавляя к общей стоимости процесса. Многоразовые контейнеры для перемещения также увеличивают риск случайного обмена образцами от разных пациентов, подвергая конечного получателя стволовых клеток риску неаутологичной трансфузии.

Описанная выше процедура также требует строгого сотрудничества и понимания между оператором, собирающим липидный сырьевой материал, и лабораторией, выделяющей стволовые клетки. Иногда сырьевой материал отправляют в неоптимальных контейнерах (например, слишком большие, неправильно запечатанные, неправильно упакованные, не в оптимальных количествах и т.д.): во всех этих случаях лаборатория вынуждена работать с условно оптимальным исходным образцом, что может повлиять на качество конечного продукта.

Целью изобретения является обеспечение улучшенного способа получения фракций стволовых клеток, которые имеют происхождение из липидной ткани, что является более безопасным для пациента и более упрощенным для оператора процесса.

Еще одной целью является упрощение/стандартизация области взаимодействия и сотрудничества между операторами, собирающими липидное сырье, и теми, кому вверено выделение стволовых клеток.

Еще одна цель состоит в уменьшении количества стадий и манипуляций, включенных в процессы получения очищенных клеточных фракций.

Еще одна цель состоит в том, чтобы сделать более быстрыми и эффективными те медицинские/косметические процедуры, которые предполагают использование стволовых клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Представленное изобретение касается способа получения фракций стволовых клеток липидного происхождения, главным образом, основанного на стадиях:

(a) сбора или получения образца липидной ткани, содержащей стволовые клетки;

(b) промывания образца, полученного на стадии (a) подходящим водным буфером;

(c) инкубирования образца, полученного на стадии (b) с ферментом, способным извлекать стволовые клетки из липидной ткани, содержащей их;

(d) извлечения водной фазы из продукта, полученного на стадии (c);

(e) очистки водной фазы, полученной на стадии (d);

(f) титрования водной фазы, полученной на стадии (e) и, необязательно, ее разбавления, чтобы получить конечную фракцию стволовых клеток с желаемой концентрацией и объемом.

Один существенный признак изобретения состоит в том, что материал, содержащий стволовые клетки, обрабатывают в пределах одного собирающего устройства (в данном документе упоминается как «индивидуальное собирающее устройство» или «SCD»), на всем протяжении, по крайней мере, стадий: (a), (b) и (c) способа, описанного в данном документе. Использование SCD не допускает контакта обработанного материала с внешней атмосферой, понижает до минимума риск загрязнения и потери активного материала, связанной с многократной передачей контейнера, и упрощает общие манипуляций, требуемые, чтобы получить очищенные фракции стволовых клеток.

SCD представляет собой стерильный контейнер, способный отбирать и выпускать жидкость, он, как правило, но не исключительно, представляет собой шприц. SCD может иметь большой объем заполнения (например, от 20 до 100 мл), чтобы позволить большие масштабные заборы стволовых клеток из соответствующего липидного материала. Предпочтительным является прозрачная или полупрозрачная, с одной отметкой, указывающей оптимальный объем заполнения, и/или областью, предназначенной для надписи или маркировки, чтобы идентифицировать источник образца.

Как будет очевидно из описания, SCD выполняет функции собирающего устройства (например, пипетки), фазового сепаратора и реактора процесса, в зависимости от конкретной предполагаемой стадии способа; все данные функции, таким образом, преимущественно проводят без перенесения образца из одного контейнера в другой, и/или его контактирования с внешней атмосферой.

SCD преимущественно используют на всем протяжении стадии (a), (b) и (c) способа: однако, если необходимо, SCD могут сохранять также на всем протяжении одной или более из стадий (d), (e), (f), с той же функцией и преимуществами, описанными выше.

Исходя из изложенных выше предпосылок, способ согласно изобретению включает следующие стадии:

(a) сбор или получение, в SCD, образца липидной ткани, содержащей стволовые клетки;

(b) в указанном SCD, промывание образца со стадии (a) подходящим водным буфером;

(c) в указанном SCD, инкубирование образца со стадии (b) с ферментом, способным перерабатывать липидную ткань и извлекать из нее стволовые клетки;

(d) извлечение водной фазы из продукта со стадии (c);

(e) очистка водной фазы, полученной на стадии (d);

(f) титрование водной фазы, полученной на стадии (e), и, если необходимо, ее разбавление, чтобы получить конечную фракцию стволовых клеток с желаемой концентрацией и объемом.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Стадия (a)

На данной стадии, образец липидной ткани, содержащей стволовые клетки, отбирают из подходящего источника в SCD.

Липоаспираты представляют собой типичные образцы липидной ткани. Образец должен быть жидкой или, по меньшей мере, текучей средой в соответствии с назначением представленного способа; недостаточно жидкие материалы могут быть переведены в таковые путем дополнительной гомогенизации и/или добавления жидких сред, например, буферных растворов.

На стадии (a) SCD приводят в контакт с образцом липидной ткани и управляют, чтобы отобрать соответствующий ее объем; отбор останавливают перед заполнением полностью доступного объема SCD, таким образом, давая возможность сделать дополнительный отбор (обычно одна половина объема SCD) буферов для промывки и других реагентов, как описано далее.

Выражение ʺсбор или получениеʺ на стадии (a) учитывает тот факт, что данная стадия может быть выполнена учреждением/оператором, которые являются одинаковыми или различными при выполнении других стадий (b)-(f): в первом выбранном варианте, на стадии (a) оператор «собирает» липидный образец и обрабатывает его непосредственно в соответствии со стадиями (b)-(f); во втором случае оператор ʺполучаетʺ липидный образец, собранные кем-то другим, и обрабатывает его в соответствии со стадиями (b)-(f); обычно стадия (a) может быть осуществлена в больнице или эстетическом центре; стадии (b)-(f) осуществляют в лаборатории, специализируемой на переработке стволовых клеток.

В данном втором варианте, представленный способ имеет особенное преимущество в том, что он устраняет первичную причину загрязнения, происходящую в известных процессах, где липоаспират собирают в первый контейнер, накапливают, отправляют во внешнюю лабораторию и затем переносят в подходящий реактор: все данные переносы/манипуляции, предполагающие контакт образца с внешней атмосферой, связанный с риском загрязнения, наряду с неизбежным процентом потери продукта. Такие недостатки и риски теперь минимизированы в соответствии с данным способом.

Использование SCD имеет еще одно преимущество в том, что оно обеспечивает первоначального оператора, то есть того, кто собирает липидный образец, со стандартизированным контейнером, соответствующим образом, адаптированным для дальнейшего процесса с точки зрения заполняющего объема, незаполненного объема, герметичности, упаковочного материала и т.д.

Следующие стадии могут быть выполнены непосредственно после стадии (a), альтернативно, частично заполненный SCD хранится в течение определенного времени, при условиях поддержания жизнеспособности стволовых клеток до момента дальнейшей обработки согласно стадиям (b)-(f).

Стадия (b)

На данной стадии отобранный липидный образец со стадии (a) промывают внутри SCD с водным буферным раствором.

Чтобы сделать это, частично заполненный SCD со стадии (a) приводится в действие, чтобы отобрать объем буферного раствора, который смешивают с образцом липидной ткани, присутствующей внутри SCD; гомогенное смешивание двух фаз может быть облегчено, например, применением вибрации/встряхивания SCD. Использованный буферный раствор является совместимым со стволовыми клетками, как правило, PBS буфер, дополненный солями кальция и/или магния, пригодными в качестве ферментных питательных веществ; объемное соотношение буфера к липидной ткани составляет, например, от приблизительно 0,5:1,5 до приблизительно 1,5:0,5, предпочтительно составляет приблизительно 1:1.

После указанного смешивания/гомогенизации SCD оставляют до тех пор, пока две фазы (липидная и водная) не разделятся. Тогда SCD затем приводится в действие, чтобы выпустить водную фазу, в то же время оставляя липидную фазу: в частности, когда SCD является шприцом, это может быть сделано путем ориентирования его в нисходящее положение (иглой книзу): это вызывает перемещение липидной фазы в верхнюю часть шприца, удаленную от иглы, в то время, как водная фаза сосредоточивается в противоположной части, ближайшей к игле: в данном положении давление на поршень шприца вызывает выпускание водной фазы из иглы; давление соответствующим образом сохраняется, пока раздел фаз вода/липид не достигнет иглы: в этой точке водная фаза (отбрасывается) в значительной степени удаляется, и шприц содержит только липидную фазу, с которой проводят следующую стадию.

Описанная выше стадия промывания может быть повторена больше раз, например один или два, пока не будет достигнута желаемая степень промывки липидной фазы.

Стадия (c)

На данной стадии промытую липидную фазу со стадии (b) инкубируют в SCD с ферментом, способным извлекать стволовые клетки из липидного материала, содержащего их.

Для выполнения данной стадии SCD приводится в действие для дальнейшего отбора аликвоты жидкой среды, содержащей указанный фермент. Ферментом, как правило, является либераза. Жидкой средой, как правило, является буфер, предпочтительно PBS буфер, оптимизированный для ферментативной активности, в частности дополненный солями кальция и/или магния; жидкая среда имеет известный ферментативный титр, что позволяет оператору отбирать необходимое и воспроизводимое количество фермента.

Таким образом, заполненный SCD, необязательно вставленный в запечатанный конверт, затем помещают в инкубатор, как правило, с контролируемой температурой печи, снабженный качающимся лотком. До инкубирования SCD, предпочтительно, перемешивают для гомогенизации содержимого; затем перемешивание продолжают в инкубаторе, с помощью колебательного движения лотка.

Инкубатор может работать при следующих не исчерпывающихся условиях: инкубационный период 20-80 минут, предпочтительно 30-60 минут, наиболее предпочтительно 45 минут, температура 30-45°C, предпочтительно при 37°C, перемешивание: 1-5 оборотов в минуту, предпочтительно 2 или 3 оборота в минуту.

Стадия (d)

На данной стадии ферментативная реакция блокируется, липидную фазу удаляют, и водную фазу (содержащую стволовые клетки, выделенные ферментом) используют для дальнейшей обработки на стадиях (e)-(f).

Для проведения данной стадии SCD удаляют из инкубатора и извлекают из (необязательно использованного) конверта; инкубированную суспензию смешивают с аликвотой раствора, который инактивирует фермент, например, буферированный раствор альбумина при соответствующей концентрации, например, 1% по массе.

Подходящий режим смешивания двух жидкостей состоит в добавлении инактивационного раствора к SCD, перемешивании SCD для получения полной гомогенизации, выдерживании SCD до тех пор, пока липидная и водная фазы разделятся, и восстановлении водной фазы.

Восстановление водной фазы может быть выполнено путем извлечения ее из SCD (режим извлечения) или, альтернативно, путем сохранения ее в SCD (режим сохранения).

ʺРежим извлеченияʺ может быть выполнен путем ориентации шприца в нисходящее положение (игла книзу): это вызывает перемещение липидной фазы в верхнюю часть шприца, удаленную от иглы, в то время, как водная фаза сосредоточивается в противоположной части, ближайшей к игле: в данном положении давление на поршень шприца вызывает выпускание водной фазы из иглы; давление соответствующим образом сохраняется, пока раздел фаз вода/липид не достигнет иглы: в этой точке водная фаза должна быть собрана для дальнейшего использования на стадии (e)-(f)), в значительной степени, извлекается из шприца, последний содержит обедненную на стволовые клетки липидную фазу, которые теперь могут быть отдельно извлечены и удалены.

Альтернативно к режиму извлечения ʺрежим сохраненияʺ может быть выполнен путем ориентации шприца в восходящем направлении (игла кверху): это вызывает перемещение липидной фазы в часть шприца, ближайшую к игле, в то время, как водная фаза сосредотачивается в противоположной части, удаленной от иглы: в данном положении, давление на поршень шприца вызывает выпускание липидной фазы из иглы, чтобы предотвратить дисперсию жидкости, извлекаемой из ориентированного вверх шприца, могут быть использованы подходящие средства, например, до извлечения, игла может быть вставлена через резиновую пробку в колбу, в которую затем собирается извлеченная жидкость. Давление соответственно удерживается до тех пор, пока раздел фаз вода/липид не достигнет иглы: в этой точке липидная фаза (отбрасываемая) в значительной степени извлекается из шприца, последний содержит водную фазу, предназначенную для дальнейшей обработки на стадиях (e)-(f).

В конце стадии (d) водную фазу извлекают из SCD и обрабатывают отдельно, за исключением случаев, когда SCD имеет форму и консистенцию, позволяющую ему быть центрифугированным: в этом случае последующие стадии способа также могут быть выполнены в SCD, добавляя дополнительную защиту/упрощение способа в целом.

Опорожненное SCD, если не приспособлено для центрифугирования, предпочтительно, промывают один или более раз соответствующим раствором (предпочтительно инактивационный раствор, описанный выше), чтобы вернуть обратно стволовые клетки, которые возможно прикрепились к его поверхности, и все полученные в результате водные фазы объединяли для дальнейшей обработки в соответствии со стадиями (e)-(f)).

Стадия (e)

На данной стадии (объединенные) водные фазы со стадии (d) очищают от возможных растворимых/нерастворимых примесей, полученных из исходного липидного образца. Очистку обычно достигают путем центрифугирования, удаления супернатанта, повторного суспендирования пеллеты, фильтрации. Центрифугирование, как правило, могут проводить: со скоростью 300-500 G, предпочтительно 350-450 G, более предпочтительно при 400 G, в течение периода времени 1-10 минут, предпочтительно 3-7 минут, более предпочтительно в течение 5 минут.

После удаления супернатанта повторное суспендирование пеллеты может быть осуществлено путем использования соответствующего буфера (например, PBS буфера) или инактивационного раствора, описанного выше.

Указанные выше центрифугирование и повторное суспендирование могут быть повторены один или более раз, чтобы повысить очистку твердой (стволовые клетки) фракции от водорастворимых примесей.

(Окончательно) повторно суспендированную пеллету затем отфильтровывают один или несколько раз, чтобы удалить твердые примеси, которые имеют больший размер по отношению к фракции стволовых клеток. Чтобы это сделать, суспендированную пеллету фильтруют через мембрану с соответствующим размером пор, например 80-120 мкм, предпочтительно приблизительно 100 мкм, удерживая надразмерный твердый материал, и позволяя (малоразмерным) стволовым клеткам проходить в фильтрат. Полученная в результате жидкость снова может быть профильтрована через прогрессивно мелкопористые фильтры, например 60-80 мкм, предпочтительно приблизительно 40 мкм, что позволяет более полное удаление надразмерных частиц. Окончательно отфильтрованную жидкость, содержащую очищенные стволовые клетки, подвергают дальнейшей обработке на стадии (f).

Стадия (f)

На данной стадии очищенную жидкость со стадии (e) титруют и затем разбавляют для получения конечной фракции стволовых клеток с желаемой концентрацией и объемом.

Титрование может быть выполнено путем отбора, точно определенного объема жидкости со стадии (e) (например, 50 мкл) и подвергая его подсчету количества стволовых клеток с помощью соответствующего подсчитывающего устройства, как правило, FACS с оптимизированными воротами, чтобы получить число мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, альтернативно, содержание стволовых клеток можно оценить косвенно с использованием других инструментов, например гемоцитометра: последний подсчитывает общее количество ядросодержащих клеток, которые на данной стадии способа, как обнаружено, являются на 10-20% стволовыми клетками. Предпочтительно, берут два или более показания и усредняют для более высокой точности.

Исходя из его известного титра, жидкость со стадии (e) может, при необходимости, быть разбавлена до соответствующей концентрации. Разбавление может быть выполнено с использованием подходящего буфера (например, PBS буфера) или инактивационного раствора, описанного выше. Окончательное значение концентрации выбирают в зависимости от желаемого уровня эффективности конечной фракции стволовых клеток; подходящие, но не ограничивающие, значения концентрации стволовых клеток (выраженные как общее число ядросодержащих клеток) составляют от 10⁸ до 10⁴ клеток/мл, предпочтительно от 10⁷ до 10⁵ клеток/мл, более предпочтительно приблизительно 10⁶ клеток/мл.

Конечная фракция стволовых клеток может быть упакована в подходящий контейнер (например, минишприц) как единицу с соответствующим объемом, например, 1 мл; конечный объем выбирают таким, чтобы он был совместимым и удобным с местом введения (например, заполнением морщин, реконструкции ткани и т.п.) конечной фракции стволовых клеток.

Конечную фракцию стволовых клеток предпочтительно используют в самые короткие сроки, или, альтернативно, ее хранят в подходящих условиях стерильности и температуры до момента использования.

Она может быть использована для какого-либо применения, в котором стволовые клетки липидного происхождения являются полезными. Неограничивающие примеры находятся в области эстетических или реконструктивных терапий, в частности заполнения тканей, заживления ран, реконструкции ткани или органа. Полученная таким образом фракция стволовых клеток и ее медицинские применения являются частью представленного изобретения.

Подходящая, не исчерпывающая методика в соответствии с представленным изобретением описывается следующим образом.

ПРИМЕР

1.1 Промывание PBS Ca/Mg буфером

100 мл шприц (SCD), содержащий 50 мл сырьевого материала липоаспирата, заполняли 50 мл стандартного Дульбекко (Dulbecco) PBS буфера, содержащего соли кальция и магния. Шприц (SCD) переворачивали 10 раз, чтобы гомогенизировать содержимое, и затем выдерживали еще в вертикальном положении (иглой книзу) в течение приблизительно 5 минут, давая водной и липидной фазам разделиться. Затем надавливали на поршень шприца, извлекая всю нижнюю (водную) фазу, сохраняя липидную фазу в шприце. Процедуру промывания повторяли, и извлеченные водные фазы отбрасывали.

1.2. Инкубирование с либеразой

Шприц (ВСС), полученный в результате со стадии 1.1, содержащий промытую липидную фазу, приводили в действие, чтобы отобрать ферментативный реагент для достижения концентрации 0,28 Wunsch единиц/мл. Ферментативный реагент готовили заранее из 0,028 Wunsch единиц/мкл маточного раствора либеразы (ʺMNP-Sʺ в разбавленном Дульбекко PBS, содержащем кальций и магний), разбавляли 1:500 об./об. в Ca/Mg PBS буфере, описанном выше.

Таким образом заполненный шприц (SCD) дополнительно приводили в действие, чтобы отобрать 20 мл стерильного воздуха, переворачивали 10 раз, чтобы гомогенизировать содержимое; запечатывали в конверт и помещали в инкубатор с колеблющимся лотком, предварительно нагрев до 37°C. Инкубирование проводили при 37°C в течение 45 минут, при колебаниях 3 оборота в минуту.

1.3. Инактивирование либеразы

После истечения времени инкубирования встряхивание прекращали, шприц (SCD) вынимали из инкубатора, освобождали из конверта и добавляли равный объем 1% по массе раствора альбумина в Дульбекко PBS. Таким образом заполненный шприц (SCD) затем приводили в действие, чтобы отобрать 5 мл стерильного воздуха, и переворачивали 10 раз, чтобы гомогенизировать содержимое, и потом выдерживали еще в вертикальном положении (иголка книзу) в течение приблизительно 5 минут, давая водной и липидной фазам разделиться.

1.4. Восстановление водной фазы

Нажимали поршень шприца (SCD), чтобы выпустить всю нижнюю фазу (водную фазу): данную фазу, содержащую стволовые клетки, возвращали в центрифужную пробирку (маркированную как ʺ1-е восстановлениеʺ). Липидную фазу, которая оставалась в шприце (SCD) выпускали отдельно и отбрасывали; пустой шприц (SCD), затем промывали 1% раствором альбумина, в соответствии с процедурой, описанной в пункте 1.3, и промывной раствор в дальнейшем собирали в центрифужную пробирку (маркированную как ʺ2-е восстановлениеʺ).

1.5. Первое центрифугирование и повторное суспендирование пеллеты

Две пробирки, полученные с пункта 1.4 (1-е и 2-е восстановление), центрифугировали при 400 G в течение 5 минут при 20°C. Все супернатанты были удалены, пеллеты с пробирок 2-го восстановления повторно суспендировали вручную с 20 мл 1% альбумина в PBS; полученную в результате суспензию добавляли в пробирки 1-го восстановления и использовали для повторного суспендирования пеллеты, присутствовавшей в нем.

1.6. Фильтрование, второе центрифугирование и повторное суспендирование пеллеты

Суспензию, полученную в конце цикла пункта 1.5, фильтровали через две последовательные стадии, с использованием фильтров с размером пор 100 и 40 мкм соответственно. Фильтры удаляли. Окончательно полученную жидкость, содержащую стволовые клетки, центрифугировали при 400 G в течение 5 минут при 20°C. Супернатант удаляли, и пеллету повторно суспендировали в 5 мл 1% раствора альбумина в PBS.

1.7. Титрование

Используя 1 мл пипетку, два образца по 50 мкл отбирали из отфильтрованной суспензии, полученной в пункте 1.6 (стромальная васкулярная фракция, SVF), и вводили для считывания в гемоцитометр. Два считывания (выраженные в виде общего числа ядросодержащих клеток, т.е. WBC/мл) усредняли, чтобы получить точный титр раствора.

Прямой подсчет стволовых клеток, кроме того, проводили на 1 мл образца раствора, полученного в пункте 1.6: пробу центрифугировали при 1300 G в течение 5 минут, супернатант удаляли, и пеллеты повторно суспендировали с 0,440 мкл FACS буфера (PBS+1% сыворотки человека); раствор, инкубированный в течение 20 минут с подходящими антителами и добавленный с VersaLyse и раствором с подсчитанным числом стволовых клеток затем считывали на цитофлюориметр Navios, оценивая количество стволовых клеток, присутствующих в образце, и на основании этого, соответствующую концентрацию стволовых клеток.

1.8. Разбавление до стандартных концентраций и упаковка

На основе титра, измеренного в пункте 1.7, остаток раствора, полученного в пункте 1.6, разбавляли 5% раствором альбумина в PBS до концентраций и объемов, удобных для практического применения в лечении стволовыми клетками. Полезный диапазон концентраций составляет от 0,5 до 3×10 WBC/мл. Полученный раствор был окончательно подразделен в 1 мл стерильные шприцы, которые затем были упакованы и закрыты для отправки и доставки конечному пользователю.

Claims

1. Способ получения фракций стволовых клеток, имеющих происхождение из липидной ткани, включающий стадии:

(b) промывания образца со стадии (а) подходящим водным буфером;

(c) инкубирования образца со стадии (b) с ферментом, способным перерабатывать липидную ткань и извлекать из нее стволовые клетки;

(d) инактивирования фермента, использованного на стадии (с), и извлечения водной фазы из продукта со стадии (с);

(f) титрования водной фазы, полученной на стадии (е), и, если необходимо, ее разбавления, чтобы получить конечную фракцию стволовых клеток с желаемой концентрацией и объемом, в котором материал, содержащий стволовые клетки, обрабатывают в шприце на всем протяжении по меньшей мере стадий: (а), (b) и (с), указанный шприц выполняет функции собирающего устройства, фазового разделителя и технологического реактора.

2. Способ по п. 1, в котором шприц имеет объем заполнения, составляющий от 20 до 100 мл.

3. Способ по п. 1, в котором шприц снабжен одной или более отметками, чтобы показать оптимальный(ые) объем(ы) заполнения, и/или с местами для записи или маркировки.

4. Способ по п. 1, в котором липидным материалом является липоаспират.

5. Способ по п. 1, в котором стадии (а) и (b-d) соответственно выполняются двумя разными операторами в местах, удаленных друг от друга.

6. Способ по п. 1, в котором на стадии (b) буфер представляет собой PBS буфер, дополненный ферментными питательными веществами.

7. Способ по п. 1, в котором стадии (b) и/или (с) включают нисходящее ориентирование шприца (иглой книзу) или восходящее (иглой кверху), с последующим выпусканием фазы, ближайшей к игле.

8. Способ по п. 1, в котором на стадии (с) фермент представляет собой либеразу и инкубирование проводят в течение от 20 до 80 минут при температуре от 30 до 45°C.

9. Способ по п. 1, в котором на стадии (d) инкубируемую смесь смешивают с раствором, содержащим альбумин, затем липидную фазу отбрасывают и водную фазу возвращают для последующих стадий способа.

10. Способ по п. 1, в котором материал, содержащий стволовые клетки, дополнительно сохраняется в середине указанного шприца на протяжении одной или больше стадий (d)-(e).

11. Способ по п. 1, в котором очистку на стадии (е) выполняют путем центрифугирования(ий) и/или фильтрации(ий).

12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором конечную фракцию стволовых клеток формулируют в виде одной или более единиц по 1-5 мл с общей концентрацией ядросодержащих клеток, которая составляет от 10⁸ до 10⁴ клеток/мл.