JP6062055B2 - 精製幹細胞分画を調製する安全性の高い方法 - Google Patents
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Description
(a)幹細胞を含有する脂質組織の試料を回収または受け取るステップと、
(b)ステップ(a)において得られた試料を、好適な水性緩衝液により洗浄するステップと、
(c)ステップ(b)において得られた試料を、幹細胞を含有する脂質組織から幹細胞を抽出し得る酵素とインキュベートするステップと、
(d)ステップ(c)において得られた生成物から水相を回収するステップと、
(e)ステップ(d)において得られた水相を精製するステップと、
(f)ステップ(e)において得られた水相を力価測定し、任意選択的に、それを希釈して所望の濃度および容量を有する最終幹細胞分画を得るステップと
に基づく方法に関する。
(a)幹細胞を含有する脂質組織の試料をSCD中で回収または受け取るステップと、
(b)前記SCD中で、ステップ(a)の試料を、好適な水性緩衝液により洗浄するステップと、
(c)前記SCD中で、ステップ(b)の試料を、脂質組織を消化し、その組織から幹細胞を抽出し得る酵素とインキュベートするステップと、
(d)ステップ(c)の生成物から水相を回収するステップと、
(e)ステップ(d)において得られた水相を精製するステップと、
(f)ステップ(e)において得られた水相を力価測定し、必要な場合は、それを所望の濃度および容量を有する最終幹細胞分画に希釈するステップと
を含む。
このステップにおいて、幹細胞を含有する脂質組織の試料を好適な資源からSCD中に抜き取る。
このステップにおいて、ステップ(a)からの抜き取られた脂質試料を、SCD内部で水性緩衝溶液により洗浄する。
このステップにおいて、ステップ(b)からの洗浄された脂質相を、SCD中で、幹細胞を含有する脂質材料から幹細胞を抽出し得る酵素とインキュベートする。
このステップにおいて、酵素反応を遮断し、脂質相を排除し、水相(酵素により遊離された幹細胞を含有)を、ステップ(e)〜(f)によるさらなる処理のために回収する。
このステップにおいて、ステップ(d)からの(プールされた)水相を、元となる脂質試料に由来すると見込まれる可溶性/不溶性不純物から精製する。精製は、一般に、遠心分離、上清の排除、ペレットの再懸濁、ろ過により得る。遠心分離は、一般に、300〜500Gの速度、好ましくは、350〜450G、より好ましくは、400Gにおいて、1〜10分間、好ましくは、3〜7分間、より好ましくは、5分間の時間実施することができる。
このステップにおいて、ステップ(e)からの精製された液体を力価測定し、次いで希釈して所望の濃度および容量を有する最終幹細胞分画を得る。
1.1 PBS Ca/Mg緩衝液による洗浄
50mLの吸引脂肪組織原料を含有する100mLのシリンジ(SCD)に、カルシウムおよびマグネシウム塩を含有する50mlの標準ダルベッコPBS緩衝液を充填した。シリンジ(SCD)を10回反転させて含有物を均質化し、次いで垂直位置(針が下方)で約5分間静置し、水相および脂質相を分離させた。次いで、シリンジプランジャを押圧して下(水)相全体を排出し、脂質相をシリンジ中で滞留させた。洗浄手順を繰り返し、排出された水相を廃棄した。
洗浄された脂質相を含有するステップ1.1から得たシリンジ(SCD)を、酵素試薬を抜き取るように操作して0.28Wunschユニット/mlの濃度に到達させた。酵素試薬を、リベラーゼ(登録商標)の0.028Wunschユニット/μLの母液(カルシウムおよびマグネシウムを含有するダルベッコPBS中で希釈された「MNP−S」)から、上記のPBS Ca/Mg緩衝液により1:500v/vに希釈して予め調製した。
インキュベーション時間の終了後、振動を中断し、シリンジ(SCD)をインキュベータから取り出し、外被から解放し、それにダルベッコPBS中の等容量の1重量%アルブミン溶液を添加した。こうして充填されたシリンジ(SCD)を、5mlの無菌空気を抜き取るようにさらに操作し、10回反転させて含有物を均質化した。次いで垂直位置(針が下方)に約5分間静置し、水相および脂質相を分離させた。
シリンジ(SCD)のプランジャを押圧して下相(水相)全体を排出した。この相は、幹細胞を含有し、遠心分離チューブ(「第1の回収」と標識)中に回収した。シリンジ(SCD)中で残留する脂質相を別々に排出し、廃棄した。次いで、空のシリンジ(SCD)を、1.3項に記載の手順に従って1%アルブミン溶液により洗浄し、洗浄溶液をさらなる遠心分離チューブ(「第2の回収」と標識)中で回収した。
1.4項において得られた2つのチューブ(第1および第2の回収)を、400Gにおいて20℃において5分間遠心分離した。全ての上清を除去し、第2の回収チューブ中のペレットを、20mLのPBS中1%アルブミンにより手動で再懸濁させ、得られた懸濁液を第1の回収チューブに添加し、それを使用してそこに存在するペレットを再懸濁させた。
1.5項の終了時に得られた懸濁液を、それぞれ100および40μmの細孔サイズを有するフィルタを使用する2つの後続のステップを介してろ過した。フィルタを排除した。最終的に得られた液体は、幹細胞を含有し、400Gにおいて20℃で5分間遠心分離した。上清を排除し、ペレットを5mlのPBS中1%アルブミン溶液により再懸濁させた。
1mLのピペットを使用し、50μLの2つの試料を、1.6項において得られたろ過懸濁液から回収し(間質血管分画、SVF)、血球計数器中に読取りのために挿入した。2回の読取り(総有核細胞、すなわち、WBC/mLとして表現)を平均化して溶液の正確な力価を得た。
1.7項において計測された力価に基づき、1.6項において得られた溶液の残部を、PBS中5%アルブミン溶液により、実際の幹細胞治療に都合の良い(convenient)な濃度および容量に希釈した。有用な濃度範囲は、0.5〜3×106個のWBC/mLである。得られた溶液を、最終的に1mLの無菌シリンジ中にさらに分割し、次いでそれらを最終使用者への発送および送達のため包装および密封した。
Claims (11)
- 脂質組織起源の幹細胞分画を調製する方法であって、
(b)シリンジ内に回収された又は受け取られた、幹細胞を含有する脂質組織の試料を、好適な水性緩衝液により洗浄するステップと、
(c)ステップ(b)の試料を、前記脂質組織を消化し、その組織から前記幹細胞を抽出し得る酵素とインキュベートするステップと、
(d)ステップ(c)の生成物から水相を回収するステップと、
(e)ステップ(d)において得られた水相を精製するステップと、
(f)ステップ(e)において得られた水相を力価測定し、必要な場合は、それを希釈して所望の濃度および容量を有する最終幹細胞分画を得るステップと
を含み、
前記幹細胞含有試料を、少なくとも前記ステップすなわち(b)および(c)全体にわたりシリンジ内で処理し、前記シリンジは、回収装置、相分離器およびプロセス反応器の機能を実施する、方法。 - 前記シリンジが、20〜100mLに含まれる充填容量を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記シリンジに、最適な充填容量を示すための1つ以上の標識、および/または記載もしくはラベリングのための領域が備わっている、請求項1または2に記載の方法。
- 前記脂質試料が、吸引脂肪組織である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)において、前記緩衝液が、酵素栄養素が補給されたPBS緩衝液である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(b)および/または(c)において、前記シリンジを下向き(針を下方)または上向き(針を上方)に配向し、次いで前記針に近位の相を排出することを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)において、前記酵素がリベラーゼ(登録商標)であり、インキュベーションを30〜45℃の温度において20〜80分間実施する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)において、インキュベートされた混合物を、アルブミン含有溶液と混合し、次いで脂質相を廃棄し、前記水相を後続のプロセスステップのために回収する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記幹細胞含有試料を、前記ステップ(d)〜(e)の1つ以上の間、前記シリンジ内でさらに維持する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)における精製を、遠心分離および/またはろ過により実施する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記最終幹細胞分画を、1〜5mLの1つ以上の単位として配合し、総有核細胞濃度が、108〜104個細胞/mLに含まれる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
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