CN116656594A - 用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂及方法，属于宫内膜干细胞高纯外泌体制剂技术领域，通过采用卫生棉条进行宫内膜采集，宫内膜样本的采集对象是健康适龄女性，在月经期第2天采集经血，采集量为2根卫生棉条，采集完后放置在准备好的保存液重，其中15mlPBS+双抗，存放在50ml离心管*2，48h内处理，取2支注射器并拔出橡胶塞，用无菌镊子或者止血钳夹出采集好的卫生棉条，塞入注射器针管中，塞上橡胶塞，挤压生棉条里面的血液至无菌50ml离心管内。
Description
技术领域
本发明涉及一种宫内膜干细胞高纯外泌体制剂，特别是涉及用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂，本发明还涉及一种宫内膜干细胞高纯外泌体制剂制备方法，特别涉及用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂的制备方法，属于宫内膜干细胞高纯外泌体制剂技术领域。
背景技术
子宫内膜干细胞可能来源于胎儿干细胞或骨髓干细胞，包括造血干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞。
EnSCs是用于再生治疗的有吸引力的干细胞来源，因为它们易于获得且易于在培养中扩增，已被证明可安全用于临床使用。
已经证明EnSC能够在体内重新整合到组织中，在再生医学应用方面，EnSC更适合软组织工程，例如膀胱重建。
人类子宫内膜包括功能层和基底层，功能性肌因激素变化而产生的月经血每月脱落，月经后迅速重建，最初认为子宫内膜干细胞仅位于基底层，在月经期，子宫内膜干细胞以基质细胞衍生因子-1(SDF-1)/CXCR4轴依赖性方式迁移到功能区，有助于子宫内膜的重建，子宫内膜干细胞可以无创地从经血中获得，被称为经血干细胞(EnSCs)，EnSCs具有极高的增殖能力，可以通过40代保持相对稳定的核型，EnSCs的倍增时间约为20小时，是骨髓干细胞的两倍。
与骨髓来源的干细胞相似，EnSCs表达间充质样表面标志物，如CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，但不表达STRO-1，它们还表达胚胎干细胞标志物SSEA-4和OCT-4，此外，EnSCs表达MHC-I，表明它们能够进行免疫调节，EnSCs被证明可以抑制肢体缺血动物模型中的混合淋巴细胞反应(MLR)，它们可以以剂量依赖性方式减少IFN-γ和TNF-α的产生。EnSCs的低免疫原性可能使它们对细胞移植治疗具有吸引力。
EnSCs可以被诱导成多种细胞谱系，包括软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和肝细胞，通过多种机制促进组织修复和重建。
研究表明，MSC分泌的胞外囊泡，包括微泡(MVS；0.1-1毫米直径)和外泌体(直径40-100纳米)，可能通过介导细胞在血管生成，组织再生和免疫调节过程中有助于MSC的治疗。
MSC来源的外泌体的生理功能尚未定义，它们可以充当细胞间通讯媒介，以调节或介导细胞过程，MSC衍生的外泌体可能与邻近和较远的多种细胞类型相互作用，以引发适当的细胞反应，它们通过维持动态和稳态组织微环境而影响MSC的基质支持功能。
MSC衍生的外泌体成分复杂，包括核酸，蛋白质和脂质，通过质谱，抗体阵列和微阵列分析，已在MSC衍生的外泌体中鉴定出超过850种独特基因产物和超过150种miRNA，这些外泌体的蛋白质和miRNA在功能上是复杂的，并且在许多不同的生物化学和细胞过程发挥重要作用，例如通信，免疫调节，生物能，组织修复和再生以及代谢，因此，源自MSC的外泌体显示出引起多种细胞应答并与多种细胞类型相互作用的潜力。
MSC衍生的外泌体在介导MSC充当基质支持细胞以维持组织内稳态并响应外部刺激的能力中起关键作用，当组织微环境的稳态被疾病或损伤破坏时，这一作用尤为重要，MSC衍生的外泌体高度富含生物活性分子(例如蛋白质和RNA)，因此可以很好地发挥这种作用。
而在现有技术中在进行宫内膜干细胞分离培养的过程中其存活率低以及外泌体产量低纯化水平低，为此设计一种用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂及方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的主要目的是为了提供用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂及方法，通过采用卫生棉条进行宫内膜采集，宫内膜样本的采集对象是健康适龄女性，在月经期第2天采集经血，采集量为2根卫生棉条，采集完后放置在准备好的保存液重，其中15mlPBS+双抗，存放在50ml离心管*2，48h内处理，取2支注射器并拔出橡胶塞，用无菌镊子或者止血钳夹出采集好的卫生棉条，塞入注射器针管中，塞上橡胶塞，挤压生棉条里面的血液至无菌50ml离心管内，混均步骤一中保存棉条的保存液和步骤二中获得的血液，离心管1和离心管2就是步骤二中得到的2支离心管，即挤压棉条得到的血液和保存液，并吸取离心管1和离心管2取得的宫内膜血液，滤除其中的凝块及粘液，将其过滤到离心管中，该离心管是新的50ml离心管，将离心管1和离心管2中溶液过滤后得到的，在4℃、800g的条件下将滤液离心10分钟，取离心后滤液上清4ml到采血管中，其中选用的采血管的规格是5ml，贴好条形码，用于送检，吸弃离心管中其余上清，用电动移液器加入离心管剩余液体体积2倍的生理盐水，细胞沉淀体积和管内液体的体积之比为1：3，用电动移液器加淋巴细胞分离液至新的50mL离心管中15ml，再分别加入之前混匀的细胞沉淀液；注意加入细胞沉淀液的时候一定要匀速贴壁打入，刚开始打入速度要慢，保证不要冲破界面，在4℃、400g的条件下离心14min，离心完毕后，小心取出离心管，吸弃最上层上清，取中间层细胞至新的50mL离心管中，加入生理盐水至步骤七中的离心管，补足到45ml，将细胞与生理盐水吹打混匀，电动移液器用10ml移液管吹打混匀，在4℃、800g离心8min，离心完毕后，吸弃上清，用电动移液器吸取20mL培养基加至离心管中，将细胞与培养基吹打混匀，电动移液器用10ml移液管吹打混匀，转移至2个75cm2的培养瓶内，并在培养瓶上注明样品名称、细胞代数、日期、操作人，将培养瓶放置于培养箱内，保持培养箱37℃，CO2浓度5％的状态进行培养。
本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：
用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂及方法，由如下成分组成：1ml宫内膜干细胞外泌体和2ml生理盐水。
优选的，包括如下步骤：
步骤一：通过采用卫生棉条进行宫内膜采集；
宫内膜样本的采集对象是健康适龄女性，在月经期第2天采集经血，采集量为2根卫生棉条，采集完后放置在准备好的保存液重；
其中15ml PBS+双抗，存放在50ml离心管*2，48h内处理；
步骤二：取2支注射器并拔出橡胶塞，用无菌镊子或者止血钳夹出采集好的卫生棉条，塞入注射器针管中，塞上橡胶塞，挤压生棉条里面的血液至无菌50ml离心管内；
步骤三：混均步骤一中保存棉条的保存液和步骤二中获得的血液，离心管1和离心管2就是步骤二中得到的2支离心管，即挤压棉条得到的血液和保存液，并吸取离心管1和离心管2取得的宫内膜血液，滤除其中的凝块及粘液，将其过滤到离心管中；
该离心管是新的50ml离心管，将离心管1和离心管2中溶液过滤后得到的；
步骤四：在4℃、800g的条件下将滤液离心10分钟，取离心后滤液上清4ml到采血管中，其中选用的采血管的规格是5ml，贴好条形码，用于送检；
步骤五：吸弃离心管中其余上清，用电动移液器加入离心管剩余液体体积2倍的生理盐水，细胞沉淀体积和管内液体的体积之比为1：3；
步骤六：用电动移液器加淋巴细胞分离液至新的50mL离心管中15ml，再分别加入之前混匀的细胞沉淀液；注意加入细胞沉淀液的时候一定要匀速贴壁打入，刚开始打入速度要慢，保证不要冲破界面。
步骤七：在4℃、400g的条件下离心14min，离心完毕后，小心取出离心管，吸弃最上层上清，取中间层细胞至新的50mL离心管中。
步骤八：加入生理盐水至步骤七中的离心管，补足到45ml，将细胞与生理盐水吹打混匀，电动移液器用10ml移液管吹打混匀，在4℃、800g离心8min，
步骤九：离心完毕后，吸弃上清，用电动移液器吸取20mL培养基加至离心管中，将细胞与培养基吹打混匀，电动移液器用10ml移液管吹打混匀，转移至2个75cm2的培养瓶内，并在培养瓶上注明样品名称、细胞代数、日期、操作人；
步骤十：将培养瓶放置于培养箱内，保持培养箱37℃，CO2浓度5％的状态进行培养。
优选的，在步骤一中将卫生棉条塞入注射器针管中，其卫生棉条不接触管壁。
优选的，在步骤七将培养瓶放置于培养箱内培养过程中进行换液和传代处理。
优选的，其中换液包括将原代细胞种瓶后的48小时内静置培养瓶，之后定时观察细胞，一个星期后开始出现原代细胞，细胞开始贴壁，培养液颜色由鲜红色变为暗红色，非原代细胞3-4天后即可换液。
优选的，换液时将旧的培养液用移液管吸出弃掉，加入适量生理盐水75cm2培养瓶加入10mL，175cm2培养瓶加入20mL，平放培养瓶，轻轻晃动两次，冲洗贴壁细胞表面，用移液管吸出弃掉，可视具体冲洗情况重复以上操作一次。
向75cm2培养瓶中加入新鲜的培养液10mL，175cm2培养瓶加入20mL，第一次换液后应每天观察细胞的生长情况，每3-4天全量换液，加培养液10mL，一次，换液方法同上。
优选的，其中传代包括细胞生长呈旋涡状，达到80％融合时，进行胰酶消化传代，将培养液用移液管吸出弃掉，用8mL左右生理盐水冲洗细胞，平放培养瓶并轻轻摇动，用移液管吸弃；
加入1mL生理盐水，再在75cm2培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶1mL，175cm2培养瓶各加入2mL，平放培养瓶并轻轻摇动，使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部；
作用1-2分钟后，拍打瓶身，在倒置显微镜下观察，待大部分细胞形态变圆，部分细胞开始脱壁时，添加10ml生理盐水，175cm2培养瓶加入20mL，稀释胰酶，使其低于最低作用浓度；
用移液管吹打培养瓶有细胞贴壁的一面，注意防止产生大量气泡，然后移入50mL离心管内，用少量生理盐水洗涤培养瓶后一并移入离心管内，用400g,离心6min。
优选的，换代后再进行离心后弃去上清，先加入少量培养液，将细胞混匀，然后再按1：4的比例加至所需体积，将细胞混匀，分装至175cm2培养瓶进行传代接种，并标明样品名称、细胞代数、日期、操作人，每次观察细胞和换液传代均应进行记录。
优选的，冻存：细胞收集：胰酶消化：细胞铺满培养瓶底部约80～90％面积时，进行胰酶消化冻存。将培养液收集到离心管内，用生理盐水轻轻冲洗细胞后，加入生理盐水和0.25％胰蛋白酶各1.0ml，175cm2培养瓶各加入2mL，，平放培养瓶并轻轻摇动，使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部；
在倒置显微镜下观察，同时轻轻拍打瓶壁，待大部分细胞开始脱壁时加盐水终止消化，消化后细胞悬液移入50ml离心管内，用少量生理盐水洗涤培养瓶后一并移入离心管内；
去上清，重悬细胞，定容支50ml，取样计数，然后再次用400g，离心6分钟，去上清，加入适量培养基，在加入适量细胞冻存液含10％DMSO，重悬细胞，分装到2ml冻存管中；
放入程序降温盒中，-80℃冰箱4小时后转入液氮罐中储存。
本发明的有益技术效果：
本发明提供的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂及方法，通过采用卫生棉条进行宫内膜采集，宫内膜样本的采集对象是健康适龄女性，在月经期第2天采集经血，采集量为2根卫生棉条，采集完后放置在准备好的保存液重，其中15ml PBS+双抗，存放在50ml离心管*2，48h内处理，取2支注射器并拔出橡胶塞，用无菌镊子或者止血钳夹出采集好的卫生棉条，塞入注射器针管中，塞上橡胶塞，挤压生棉条里面的血液至无菌50ml离心管内，混均步骤一中保存棉条的保存液和步骤二中获得的血液，离心管1和离心管2就是步骤二中得到的2支离心管，即挤压棉条得到的血液和保存液，并吸取离心管1和离心管2取得的宫内膜血液，滤除其中的凝块及粘液，将其过滤到离心管中，该离心管是新的50ml离心管，将离心管1和离心管2中溶液过滤后得到的，在4℃、800g的条件下将滤液离心10分钟，取离心后滤液上清4ml到采血管中，其中选用的采血管的规格是5ml，贴好条形码，用于送检，吸弃离心管中其余上清，用电动移液器加入离心管剩余液体体积2倍的生理盐水，细胞沉淀体积和管内液体的体积之比为1：3，用电动移液器加淋巴细胞分离液至新的50mL离心管中15ml，再分别加入之前混匀的细胞沉淀液；注意加入细胞沉淀液的时候一定要匀速贴壁打入，刚开始打入速度要慢，保证不要冲破界面，在4℃、400g的条件下离心14min，离心完毕后，小心取出离心管，吸弃最上层上清，取中间层细胞至新的50mL离心管中，加入生理盐水至步骤七中的离心管，补足到45ml，将细胞与生理盐水吹打混匀，电动移液器用10ml移液管吹打混匀，在4℃、800g离心8min，离心完毕后，吸弃上清，用电动移液器吸取20mL培养基加至离心管中，将细胞与培养基吹打混匀，电动移液器用10ml移液管吹打混匀，转移至2个75cm2的培养瓶内，并在培养瓶上注明样品名称、细胞代数、日期、操作人，将培养瓶放置于培养箱内，保持培养箱37℃，CO2浓度5％的状态进行培养。
附图说明
图1为按照本发明的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂及方法的一优选实施例的为分离提取的P1代宫内膜干细胞，4x镜下观察拍摄图；
图2为按照本发明的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂及方法的一优选实施例的为分离提取的P2代宫内膜干细胞，4x镜下观察拍摄图；
图3为按照本发明的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂及方法的一优选实施例的为分离提取的P3代宫内膜干细胞，4x镜下观察拍摄图；
图4为按照本发明的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂及方法的一优选实施例的为分离提取的P4代宫内膜干细胞，4x镜下观察拍摄图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
如图1-图4所示，本实施例提供的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂及方法，由如下成分组成：1ml宫内膜干细胞外泌体和2ml生理盐水。
在本实施例中，包括如下步骤：
步骤一：通过采用卫生棉条进行宫内膜采集；
宫内膜样本的采集对象是健康适龄女性，在月经期第2天采集经血，采集量为2根卫生棉条，采集完后放置在准备好的保存液重；
其中15ml PBS+双抗，存放在50ml离心管*2，48h内处理；
步骤二：取2支注射器并拔出橡胶塞，用无菌镊子或者止血钳夹出采集好的卫生棉条，塞入注射器针管中，塞上橡胶塞，挤压生棉条里面的血液至无菌50ml离心管内；
步骤三：混均步骤一中保存棉条的保存液和步骤二中获得的血液，离心管1和离心管2就是步骤二中得到的2支离心管，即挤压棉条得到的血液和保存液，并吸取离心管1和离心管2取得的宫内膜血液，滤除其中的凝块及粘液，将其过滤到离心管中；
该离心管是新的50ml离心管，将离心管1和离心管2中溶液过滤后得到的；
步骤四：在4℃、800g的条件下将滤液离心10分钟，取离心后滤液上清4ml到采血管中，其中选用的采血管的规格是5ml，贴好条形码，用于送检；
步骤五：吸弃离心管中其余上清，用电动移液器加入离心管剩余液体体积2倍的生理盐水，细胞沉淀体积和管内液体的体积之比为1：3；
步骤六：用电动移液器加淋巴细胞分离液至新的50mL离心管中15ml，再分别加入之前混匀的细胞沉淀液；注意加入细胞沉淀液的时候一定要匀速贴壁打入，刚开始打入速度要慢，保证不要冲破界面。
步骤七：在4℃、400g的条件下离心14min，离心完毕后，小心取出离心管，吸弃最上层上清，取中间层细胞至新的50mL离心管中。
步骤八：加入生理盐水至步骤七中的离心管，补足到45ml，将细胞与生理盐水吹打混匀，电动移液器用10ml移液管吹打混匀，在4℃、800g离心8min，
步骤九：离心完毕后，吸弃上清，用电动移液器吸取20mL培养基加至离心管中，将细胞与培养基吹打混匀，电动移液器用10ml移液管吹打混匀，转移至2个75cm2的培养瓶内，并在培养瓶上注明样品名称、细胞代数、日期、操作人；
步骤十：将培养瓶放置于培养箱内，保持培养箱37℃，CO2浓度5％的状态进行培养。
在本实施例中，在步骤一中将卫生棉条塞入注射器针管中，其卫生棉条不接触管壁。
在本实施例中，在步骤七将培养瓶放置于培养箱内培养过程中进行换液和传代处理。
在本实施例中，其中换液包括将原代细胞种瓶后的48小时内静置培养瓶，之后定时观察细胞，一个星期后开始出现原代细胞，细胞开始贴壁，培养液颜色由鲜红色变为暗红色，非原代细胞3-4天后即可换液。
在本实施例中，换液时将旧的培养液用移液管吸出弃掉，加入适量生理盐水75cm2培养瓶加入10mL，175cm2培养瓶加入20mL，平放培养瓶，轻轻晃动两次，冲洗贴壁细胞表面，用移液管吸出弃掉，可视具体冲洗情况重复以上操作一次。
向75cm2培养瓶中加入新鲜的培养液10mL，175cm2培养瓶加入20mL，第一次换液后应每天观察细胞的生长情况，每3-4天全量换液，加培养液10mL，一次，换液方法同上。
在本实施例中，其中传代包括细胞生长呈旋涡状，达到80％融合时，进行胰酶消化传代，将培养液用移液管吸出弃掉，用8mL左右生理盐水冲洗细胞，平放培养瓶并轻轻摇动，用移液管吸弃；
加入1mL生理盐水，再在75cm2培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶1mL，175cm2培养瓶各加入2mL，平放培养瓶并轻轻摇动，使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部；
作用1-2分钟后，拍打瓶身，在倒置显微镜下观察，待大部分细胞形态变圆，部分细胞开始脱壁时，添加10ml生理盐水，175cm2培养瓶加入20mL，稀释胰酶，使其低于最低作用浓度；
用移液管吹打培养瓶有细胞贴壁的一面，注意防止产生大量气泡，然后移入50mL离心管内，用少量生理盐水洗涤培养瓶后一并移入离心管内，用400g,离心6min。
在本实施例中，换代后再进行离心后弃去上清，先加入少量培养液，将细胞混匀，然后再按1：4的比例加至所需体积，将细胞混匀，分装至175cm2培养瓶进行传代接种，并标明样品名称、细胞代数、日期、操作人，每次观察细胞和换液传代均应进行记录。
在本实施例中，冻存：细胞收集：胰酶消化：细胞铺满培养瓶底部约80～90％面积时，进行胰酶消化冻存。将培养液收集到离心管内，用生理盐水轻轻冲洗细胞后，加入生理盐水和0.25％胰蛋白酶各1.0ml，175cm2培养瓶各加入2mL，，平放培养瓶并轻轻摇动，使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部；
在倒置显微镜下观察，同时轻轻拍打瓶壁，待大部分细胞开始脱壁时加盐水终止消化，消化后细胞悬液移入50ml离心管内，用少量生理盐水洗涤培养瓶后一并移入离心管内；
去上清，重悬细胞，定容支50ml，取样计数，然后再次用400g，离心6分钟，去上清，加入适量培养基，在加入适量细胞冻存液含10％DMSO，重悬细胞，分装到2ml冻存管中；
放入程序降温盒中，-80℃冰箱4小时后转入液氮罐中储存。
以上，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂，其特征在于，由如下成分组成：宫内膜干细胞外泌体与生理盐水的配比为1:2。
2.根据权利要求1所述的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂的制备方法，其特征在于：
步骤一：冻存、细胞收集、胰酶消化、细胞铺满培养瓶底部约80～90％面积时，进行胰酶消化冻存；
步骤二：将培养液收集到离心管内，用生理盐水轻轻冲洗细胞后，加入生理盐水和0.25％胰蛋白酶各1.0ml，175cm2培养瓶各加入2mL，平放培养瓶并轻轻摇动，使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部；
步骤三：在倒置显微镜下观察，同时轻轻拍打瓶壁，待大部分细胞开始脱壁时加盐水终止消化，消化后细胞悬液移入50ml离心管内，用少量生理盐水洗涤培养瓶后一并移入离心管内；
步骤四：去上清，重悬细胞，定容支50ml，取样计数，然后再次用400g，离心6分钟，去上清，加入适量培养基，在加入适量细胞冻存液含10％DMSO，重悬细胞，分装到2ml冻存管中；
步骤五：放入程序降温盒中，-80℃冰箱4小时后转入液氮罐中储存；
步骤六：宫内膜干细胞培养至P4-P10代次，P4-P10代每次传代取旧的培养液200ml，保存于-80℃条件下用于宫内膜外泌体的提取；
步骤七：旧的培养液移入50ml离心管中，1000g，离心10分钟，保留上清移入新的50ml离心管中；
步骤八：使用10KD超滤管，每支超滤管加入15ml离心后的上清，4000g，离心20分钟，保留超滤管内超滤膜上的浓缩液200ul，即为外泌体原液,置于新的15ml离心管内；
步骤九：重复3的操作，获得大量的外泌体原液，保存于-80℃条件下。
3.根据权利要求1所述的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：通过采用卫生棉条进行宫内膜采集；
宫内膜样本的采集对象是健康适龄女性，在月经期第2天采集经血，采集量为2根卫生棉条，采集完后放置在准备好的保存液重；
其中15mlPBS+双抗，存放在50ml离心管*2，48h内处理；
步骤二：取2支注射器并拔出橡胶塞，用无菌镊子或者止血钳夹出采集好的卫生棉条，塞入注射器针管中，塞上橡胶塞，挤压生棉条里面的血液至无菌50ml离心管内；
步骤三：混均步骤一中保存棉条的保存液和步骤二中获得的血液，离心管1和离心管2就是步骤二中得到的2支离心管，即挤压棉条得到的血液和保存液，并吸取离心管1和离心管2取得的宫内膜血液，滤除其中的凝块及粘液，将其过滤到离心管中；
该离心管是新的50ml离心管，将离心管1和离心管2中溶液过滤后得到的；
步骤四：在4℃、800g的条件下将滤液离心10分钟，取离心后滤液上清4ml到采血管中，其中选用的采血管的规格是5ml，贴好条形码，用于送检；
步骤五：吸弃离心管中其余上清，用电动移液器加入离心管剩余液体体积2倍的生理盐水，细胞沉淀体积和管内液体的体积之比为1：3；
步骤六：用电动移液器加淋巴细胞分离液至新的50mL离心管中15ml，再分别加入之前混匀的细胞沉淀液；注意加入细胞沉淀液的时候一定要匀速贴壁打入，刚开始打入速度要慢，保证不要冲破界面。
步骤七：在4℃、400g的条件下离心14min，离心完毕后，小心取出离心管，吸弃最上层上清，取中间层细胞至新的50mL离心管中。
步骤八：加入生理盐水至步骤七中的离心管，补足到45ml，将细胞与生理盐水吹打混匀，电动移液器用10ml移液管吹打混匀，在4℃、800g离心8min，
步骤九：离心完毕后，吸弃上清，用电动移液器吸取20mL培养基加至离心管中，将细胞与培养基吹打混匀，电动移液器用10ml移液管吹打混匀，转移至2个75cm2的培养瓶内，并在培养瓶上注明样品名称、细胞代数、日期、操作人；
步骤十：将培养瓶放置于培养箱内，保持培养箱37℃，CO2浓度5％的状态进行培养。
4.根据权利要求2所述的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂的制备方法，其特征在于：在步骤一中将卫生棉条塞入注射器针管中，其卫生棉条不接触管壁。
5.根据权利要求3所述的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂的制备方法，其特征在于：在步骤七将培养瓶放置于培养箱内培养过程中进行换液和传代处理。
6.根据权利要求4所述的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂的制备方法，其特征在于：其中换液包括将原代细胞种瓶后的48小时内静置培养瓶，之后定时观察细胞，一个星期后开始出现原代细胞，细胞开始贴壁，培养液颜色由鲜红色变为暗红色，非原代细胞3-4天后即可换液。
7.根据权利要求5所述的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂的制备方法，其特征在于：换液时将旧的培养液用移液管吸出弃掉，加入适量生理盐水75cm2培养瓶加入10mL，175cm2培养瓶加入20mL，平放培养瓶，轻轻晃动两次，冲洗贴壁细胞表面，用移液管吸出弃掉，可视具体冲洗情况重复以上操作一次。
向75cm2培养瓶中加入新鲜的培养液10mL，175cm2培养瓶加入20mL，第一次换液后应每天观察细胞的生长情况，每3-4天全量换液，加培养液10mL，一次，换液方法同上。
8.根据权利要求6所述的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂的制备方法，其特征在于：其中传代包括细胞生长呈旋涡状，达到80％融合时，进行胰酶消化传代，将培养液用移液管吸出弃掉，用8mL左右生理盐水冲洗细胞，平放培养瓶并轻轻摇动，用移液管吸弃；
加入1mL生理盐水，再在75cm2培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶1mL，175cm2培养瓶各加入2mL，平放培养瓶并轻轻摇动，使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部；
作用1-2分钟后，拍打瓶身，在倒置显微镜下观察，待大部分细胞形态变圆，部分细胞开始脱壁时，添加10ml生理盐水，175cm2培养瓶加入20mL，稀释胰酶，使其低于最低作用浓度；
用移液管吹打培养瓶有细胞贴壁的一面，注意防止产生大量气泡，然后移入50mL离心管内，采用生理盐水洗涤培养瓶后一并移入离心管内，用400g,离心6min。
9.根据权利要求7所述的用于组织修复的宫内膜干细胞高纯外泌体制剂的制备方法，其特征在于：换代后再进行离心后弃去上清，先加入少量培养液，将细胞混匀，然后再按1：4的比例加至所需体积，将细胞混匀，分装至175cm2培养瓶进行传代接种，并标明样品名称、细胞代数、日期、操作人，每次观察细胞和换液传代均应进行记录。
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