CN103589683B - 一种脐带间充质干细胞的分离方法和培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脐带间充质干细胞的分离方法和培养方法。该分离方法包括：用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎；用MSCs培养基重悬剪碎的华通氏胶，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。上述培养方法包括：对培养皿进行包被处理，弃去明胶，用PBS缓冲液进行洗涤；将分离获得的组织块和细胞重悬液接种于培养皿中；待细胞生长融合至80%‑90%时进行消化传代。
Description
技术领域
本发明涉及一种脐带间充质干细胞的分离方法和培养方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是广泛存在于结缔组织和器官间质中的多能干细胞，具有良好增殖能力和多向分化潜能，在特定条件下可向成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、造血细胞、肝细胞等功能性细胞分化。因为MSCs来源方便，易于分离、体外扩增和纯化，且在传代扩增后仍可保持干性，因此是组织工程、基因工程和细胞治疗的理想种子细胞来源。此外，MSCs具有强大的免疫调节功能，在移植中具有低免疫原性的特点，在终末期肝病等终末期疾病以及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病治疗中具有广阔的应用前景。
目前已经进行的临床试验研究证实，在终末期肝病治疗中，MSCs移植能够明显改善患者的肝功能；而将皮肤角质细胞与MSCs混合后进行移植，可有效延长移植皮肤的存活时间并减少异体移植物抗免疫疾病（graft versus host disease，GVHD）。对于MSCs免疫调节机制的研究认为，MSCs主要通过旁分泌作用，产生多种免疫调节因子，作用于免疫细胞后，诱导免疫耐受，从而发挥调控机体的免疫的作用。
此外，通过将MSCs进行基因修饰，把IFNβ、EPO等基因导入其基因组中，可获得能够在体内长时间稳定表达该蛋白或细胞因子的功能性细胞。吴祖泽等人把HGF的基因导入MSCs中，体内外实验证实HGF基因转染的人骨髓MSC仍维持原有的增殖和分化能力，而对体外细胞免疫反应具有更强的抑制效果，因此在组织器官移植中存在更大的潜在应用价值(边莉，郭子宽，艾辉胜，王华，孟二红，吴祖泽，王立生；HGF基因修饰增强间充质干细胞的免疫抑制作用；军事医学科学院院刊；2006，30(4)：323-328)。正因如此，目前各国均投入大量人力物力经费进行广泛和深入的研究。但所有的研究或治疗方案都必须建立在足够量MSCs获取的基础上，因此建立稳定有效快速的MSCs分离、扩增、质量控制的技术体系具有重要的意义。
在人体组织中，骨髓中存在大量的MSCs，然而随着年龄老化，自体骨髓中的MSCs的数目会显著降低、且增殖能力也会大幅衰退。同时，为保证自体或供体安全，对骨髓MSCs的采集技术要求严格，配套仪器精密、成本高，不宜应用推广。因此，对于骨髓以外来源的研究越来越被重视。目前，不同的研究已经从围产期的胎盘、脐带、脐带血，抽脂术来源的脂肪以及流产胎儿中分离获得增殖能力好、低免疫原性的MSCs。而这些组织中，脐带属于医疗废弃物，具有易于获得、来源稳定可控、无伦理争议问题的特点，具有良好的研究价值和应用前景。
目前对于脐带间充质干细胞分离的方法主要有贴壁法和酶消化法两种。其中贴壁法操作简便，对实验条件要求最低，是最易于推广的方式。然而，获得原代细胞周期长、不可避免混杂部分内皮细胞，需后期通过酶消化法进一步进行筛选，因此仍有待于进一步改进。而酶消化法获得较高纯度的MSCs，但获取的效率较低、单细胞贴壁能力弱、生长速度较慢。
除了分离培养方法，MSCs培养基同样对细胞获得效率以及细胞质量至关重要。在目前已知来源中，MSCs含量极低，因此为获得足够数量的MSCs，不但需要对分离方法进行优化，增加细胞得率，同时需要对获得的MSCs进行体外培养和传代扩增。含血清培养基虽然可以在较短时间内大量扩增MSCs，但动物血清所带来的异源性污染可为临床MSCs的应用带来风险。因此，无血清培养基越来越受到关注。相比起来，无血清培养基成分确定，批次稳定，更容易实现细胞应用中的安全性和可控性。但目前无血清培养基存在的普遍问题在于对原代细胞的贴壁和生长支持能力不足。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞（Umbilicalcord mesenchymal stem cells，MSCs）的高效分离方法和培养方法，具有简单易行、易于推广实践等优点，可在最短的时间内获得足够基础和临床研究用的脐带间充质干细胞。
为达到上述目的，本发明提供了一种脐带间充质干细胞的分离方法，其是在贴壁法的基础上结合MSCs培养基的培养，其包括以下步骤：
用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；
将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎，得到华通氏胶组织块；
用MSCs培养基重悬剪碎的华通氏胶组织块，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。
根据本发明的具体实施方案，优选地，上述脐带间充质干细胞的分离方法可以是在贴壁法的基础上结合酶消化法和MSCs培养基的培养，包括以下具体步骤：
（1）用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；
（2）将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎，加入胶原酶A或者胶原酶A与中性蛋白酶的混合液，置于CO2培养箱中消化处理；
（3）消化处理之后，进行离心处理并收集细胞和残余组织，利用PBS缓冲液洗去残留酶，再次进行离心分离，弃去上层清液；
（4）加入胰酶，置于CO2培养箱中消化处理，加入PBS缓冲液混匀，离心分离，弃去上层清液；
（5）用MSCs培养基重悬组织和细胞，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。
在上述分离方法中，优选地，在含青霉素和链霉素的PBS缓冲液中，青霉素和链霉素的总质量百分比浓度为2-5%。
在上述分离方法中，优选地，在含青霉素和链霉素的PBS缓冲液中，青霉素的含量为100U/mL，链霉素的含量为0.01g/100mL。
在上述分离方法中，优选地，在步骤（2）中，胶原酶A的浓度为1mg/mL-3mg/mL，胶原酶A的添加量为每根10-15cm脐带添加15mL，消化处理的时间为2-4小时。
在上述分离方法中，优选地，在步骤（2）中，胶原酶A与中性蛋白酶的混合液是由浓度为1mg/mL的胶原酶A和浓度为1mg/mL的中性蛋白酶混合得到的，胶原酶A与中性蛋白酶的体积比为1：2-1：4。
在上述分离方法中，优选地，在步骤（4）中，胰酶的浓度为0.05%-0.25%，添加量为每10-15cm脐带添加15mL，消化时间为10-15分钟。
在上述分离方法中，优选地，胰酶中添加有0.02wt%的EDTA，以胰酶的总量计。
在上述分离方法中，优选地，各个步骤中，离心分离的转速为1300rpm-2000rpm，时间为5-10分钟。
在上述分离方法中，优选地，各个步骤中，CO2培养箱的条件为37℃、5%CO2。
在上述分离方法中，优选地，在步骤（5）中，MSCs培养基为用于培养间充质干细胞的无血清培养基（BPS-SFM培养基），以该无血清培养基的体积计，其包括以下成分组成：
α-MEM10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L-谷氨酰胺1-5mM、泊洛沙姆18850-300mg/L、重组人白蛋白2-8g/L、重组人转铁蛋白10-20mg/L、重组人胰岛素2-10mg/L、Hepes1-5mM、β-巯基乙醇50nM、脂质0.1-1mg/L、微量元素1-5mg/L、谷胱甘肽0.1-5mg/L、对氨基苯甲酸0.5-5mg/L、氢化可的松1-50ng/mL、维生素PP20-50mg/L、维生素C5-50mg/L、式I所示的化合物2-10μM、式II所示的化合物5-20μM、黄体酮10-20ng/mL、腐胺1-10mg/L、肝素1-10IU/mL、EGF1-10ng/mL、b-FGF1-10ng/mL、HGF1-10ng/mL、VEGF1-10ng/mL；
根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述无血清培养基中，所述脂质包括胆固醇、花生四烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸中的一种或几种的组合。
根据本发明的具体实施方案，优选地，在上述无血清培养基中，所述微量元素包括Cu、Zn、Se、Fe、Sn、Ni、Ag、Al、Cr、Ge、Zr、Rb、Co、Cd、Ga、Mg、Mn和Ba中的一种或几种的组合。
根据本发明的具体实施方案，优选地，以该无血清培养基的体积计，其包括以下成分组成：
α-MEM10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L-谷氨酰胺5mM、泊洛沙姆188100mg/L、重组人白蛋白8g/L、重组人转铁蛋白20mg/L、重组人胰岛素10mg/L、Hepes5mM、β-巯基乙醇50nM、胆固醇0.5mM、花生四烯酸50nM、棕榈酸0.26mg/L、棕榈油酸0.25mg/L、硬脂酸0.28mg/L、油酸0.28mg/L、亚油酸0.28mg/L、亚麻酸0.28mg/L、Cu5nM、Se30nM、Zn1mM、Ga0.3mM、Cr5μM、Mg0.3mM、Mn5nM、谷胱甘肽1mg/L、对氨基苯甲酸1mg/L、氢化可的松50ng/mL、维生素PP50mg/L、维生素C20mg/L、式I所示的化合物10μM、式II所示的化合物20μM、黄体酮15ng/mL、腐胺10mg/L、肝素10IU/mL、EGF10ng/mL、b-FGF10ng/mL、HGF10ng/mL、VEGF10ng/mL。
根据本发明的具体实施方案，优选地，以该无血清培养基的体积计，其还包括：原儿茶酸1.5mmol/L、PDGF-BB10ng/mL、IGF-I10ng/mL、GM-CSF1-10ng/mL、TGF-β1-10ng/mL。
根据本发明的具体实施方案，优选地，以该无血清培养基的体积计，其还包括：原儿茶酸1.5mmol/L、PDGF-BB10ng/mL、IGF-I10ng/mL、GM-CSF10ng/mL、TGF-β10ng/mL。
上述用于培养间充质干细胞的无血清培养基的制备方法可以包括以下步骤：将各种成分与水（例如注射用水，但不限于此）混合之后利用0.22μm滤器过滤除菌，密封，4℃避光保存的步骤。在制备过程中，对于不溶于水的成分可以先将其溶于适当的溶剂，然后再与水混合，具体的可以根据现有方式进行。
本发明所采用的上述MSCs无血清培养基BPS-SFM的化学成分明确、无动物源性物质，可支持原代细胞的分离，且培养时无需包被细胞培养皿，培养效果与有血清培养基培养效果相当，避免异源性污染，可保证批次稳定性。
本发明提供的MSCs无血清培养基BPS-SFM对MSCs原代分离培养具有良好的支持作用，且支持作用与传统的10%胎牛血清培养基相当。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞的培养方法，其包括以下步骤：
a、采用明胶对培养皿进行包被处理，接种细胞前弃去明胶，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液进行洗涤；
b、将分离获得的组织块和细胞重悬液接种于步骤a处理后的培养皿中；
c、待细胞生长融合至80%-90%时进行消化传代。
在上述培养方法中，优选地，在步骤a中，采用0.1%-0.2%的明胶对培养皿进行包被，然后在37℃、5%CO2的培养箱中孵育1小时或4℃孵育8-12小时。
本发明还提供一种脐带间充质干细胞的分离和培养方法，其包括以下步骤：
采用上述脐带间充质干细胞的分离方法对健康的新生儿脐带组织进行分离获得组织块和细胞重悬液；
采用上述脐带间充质干细胞的培养方法对分离获得的组织块进行培养。
根据本发明的具体实施方案，优选地，上述脐带间充质干细胞的分离和培养方法包括以下具体步骤：
（1）用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；
（2）将脐带剪成长度均匀的小段（例如3-4cm长的小段），进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通氏胶均匀剪碎，加入胶原酶A，置于CO2培养箱中消化处理；
（3）消化处理之后，进行离心处理并收集细胞和残余组织，利用PBS缓冲液洗去残留胶原酶，再次进行离心分离，弃去上层清液；
（4）加入胰酶，置于CO2培养箱中消化处理，加入PBS缓冲液混匀，离心分离，弃去上层清液；
（5）用MSCs培养基重悬组织和细胞，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液；
（6）采用明胶对培养皿进行包被处理，接种细胞前弃去明胶，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液进行洗涤；
（7）将分离获得的组织块和细胞重悬液接种于步骤a处理后的培养皿中；
（8）待细胞生长融合至80%-90%时进行消化传代。
本发明所提供的方法将酶消化法和贴壁法相结合，以制备的明胶铺被细胞培养皿，结合本发明的MSCs无血清BPS-SFM培养基，可在较短时间内获得高纯度和增殖快速的原代脐带间充质干细胞，有效提高分离效率和细胞得率。采用本发明所提供的方法可以有效利用脐带组织高效获得原代脐带间充质干细胞，且采用无血清培养体系，获得的细胞无动物源性污染，为日后的基础和临床研究的应用提供理想的种子细胞，并且，分离方法简单易行，有利于用于生产实践。
本发明提供的脐带间充质干细胞的分离和培养方法是一种高效高纯度获得脐带间充质干细胞的方法，通过利用酶消化结合明胶铺被提高脐带间充质干细胞的得率和纯度，有效缩短分离获得时间，以实现快速制备和鉴定的方法，可获得以往培养方法更高的得率。
本发明提供的方法在利用酶消化法结合明胶包被的基础上，结合本发明的MSCs无血清BPS-SFM培养基，能高效快速获得高纯度的原代间充质干细胞，原代细胞的得率是常规分离方法获得的原代细胞的得率的10-100倍。
附图说明
图1a和图1b分别为将酶消化法和贴壁法相结合并在BPS-SFM无血清培养基培养条件下，分离、传代获得的P0、P1代MSCs的形态图。
图2a-图2f分别为单独贴壁法以及酶消化法和贴壁法相结合的分离方法，分别添加BPS-SFM无血清培养基和商品化的Sciencell公司无血清培养基MSCM-SF第6天和第12天分离P0代细胞的比较图。
图3为BPS-SFM无血清培养基中不同分离方法分离P0代细胞时细胞出现和传代的时间比较图。
图4为BPS-SFM无血清培养基中不同分离方法分离获得的P0代细胞的细胞数比较图。
图5为分别在加BPS-SFM无血清培养基和商品化的Sciencell公司无血清培养基MSCM-SF的P0代、P1代MSCs的细胞数比较图。
图6为利用BPS-SFM无血清培养基分离传代获得的P1代细胞的表面标志流式结果。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种脐带间充质干细胞的分离和培养方法，其包括以下步骤：
1、获取15cm健康新生儿脐带组织，用含2wt%青霉素-链霉素（青霉素终浓度100U/mL，链霉素终浓度0.01g/100mL）的PBS缓冲液充分洗净，充分去除血污；
2、将洗净的脐带均匀剪为3-4cm长度的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉，利用眼科剪刀将剥离的华通氏胶剪为1mm3-3mm3的小块，得到华通氏胶组织块。
3、取10cm培养皿，用浓度为0.2wt%的明胶对培养皿进行包被，置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育1小时，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液进行洗涤，去除残留明胶。
4、用BPS-SFM无血清培养基重悬组织和细胞（剪碎的华通氏胶组织块），接种于明胶铺被的培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱的培养，待细胞生长融合至85%时进行消化传代。
本实施例所采用的BPS-SFM无血清培养基的具体成分如表1所示：
表1
| 组分 | 含量 |
| α-MEM | 10.2g/L |
| 碳酸氢钠 | 2.4g/L |
| L-谷氨酰胺 | 5mM |
| 泊洛沙姆188 | 100mg/L |
| 重组人白蛋白 | 8g/L |
| 重组人转铁蛋白 | 20mg/L |
| 重组人胰岛素 | 10mg/L |
| Hepes | 5mM |
| β-巯基乙醇 | 50nM |
| 胆固醇 | 0.5mM |
| 花生四烯酸 | 50nM |
| 棕榈酸 | 0.26mg/L |
| 棕榈油酸 | 0.25mg/L |
| 硬脂酸 | 0.28mg/L |
| 油酸 | 0.28mg/L |
| 亚油酸 | 0.28mg/L |
| 亚麻酸 | 0.28mg/L |
| 维生素PP | 50mg/L |
| 维生素C | 20mg/L |
| Cu | 5nM |
| Se | 30nM |
| Zn | 1mM |
| Ga | 0.3mM |
| Cr | 5μM |
| Mg | 0.3mM |
| Mn | 5nM |
| 谷胱甘肽 | 1mg/L |
| 对氨基苯甲酸 | 1mg/L |
| 氢化可的松 | 50ng/mL |
| 式I所示的化合物 | 10μM |
| 式II所示的化合物 | 20μM |
| 黄体酮 | 15ng/mL |
| 腐胺 | 10mg/L |
| 肝素 | 10IU/mL |
| EGF | 10ng/mL |
| b-FGF | 10ng/mL |
| HGF | 10ng/mL |
| VEGF | 10ng/mL |
| 原儿茶酸 | 1.5mmol/L |
| PDGF-BB | 10ng/mL |
| IGF-I | 10ng/mL |
| GM-CSF | 10ng/mL |
| TGF-β | 10ng/mL |
| α-MEM | 10.2g/L |
| 碳酸氢钠 | 2.4g/L |
| L-谷氨酰胺 | 5mM |
上述BPS-SFM培养基是通过将表1所示的各种成分与注射用水混合在一起然后采用0.22μm的滤器过滤除菌得到的，不溶于水的成分可以先溶于适当的溶剂再与水混合。该BPS-SFM培养基应密封，4℃避光保存。所使用的细胞培养试剂为Sciencell公司产品，细胞因子为美国Peprotech公司的产品，细胞培养瓶为德国SARSTEDT公司提供。
上述BPS-SFM培养基的各种参数如下：
pH：7.2-7.4；渗透压：260-320mOsm/kg；细菌、真菌检测：阴性；衣原体、支原体检测：阴性；内毒素<0.5EU/mL。
实施例2
本实施例提供了一种脐带间充质干细胞的分离和培养方法，其包括以下步骤：
1、获取10cm剖腹产新生儿脐带组织，用含5wt%青霉素-链霉素（青霉素终浓度100U/mL，链霉素终浓度0.01g/100mL）的PBS缓冲液，充分去除血污；
2、将洗净的脐带均匀剪为3-4cm长度小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；
3、将剥离的华通氏胶剪碎为1mm3-3mm3的小块，加入15mL浓度为1mg/mL的胶原酶A和浓度为1mg/mL的中性蛋白酶的混合液（二者的体积比为1：2），置于37℃、5%CO2的培养箱中消化处理2小时，期间每20分钟取出检测消化情况；
4、消化处理之后，离心收集细胞和残余组织，利用含1wt%的青霉素-链霉素且无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液（青霉素终浓度100U/mL，链霉素终浓度0.01g/100mL）洗去残留胶原酶A，以2000rpm的转速离心5分钟，弃上清；
5、加入15mL浓度为0.25wt%的胰酶（含0.02%EDTA），置于37℃、5%CO2的培养箱中消化10分钟，期间每3分钟监测消化情况；消化处理之后，利用含1wt%青霉素-链霉素且无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液洗去残留酶，以2000rpm的转速离心5分钟，弃上清；
6、取10cm培养皿，用浓度为0.1wt%的明胶对培养皿进行包被，4℃过夜，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液进行洗涤，去除残留明胶；
7、用BPS-SFM无血清培养基（同实施例1）重悬组织和细胞，接种于明胶铺被的培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱培养，待大部分组织团块周围细胞生长融合至85%时进行消化传代。
实施例3
本实施例提供了一种比较和分析不同脐带间充质干细胞的分离和培养的方法，其包括以下步骤：
1、获取15cm剖腹产新生儿脐带组织，用含5wt%青霉素-链霉素（青霉素终浓度100U/mL，链霉素终浓度0.01g/100mL）的PBS缓冲液充分去除血污；
2、将洗净的脐带均匀分为3段，分别进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；
3、取10cm培养皿，用浓度为0.1wt%的明胶对培养皿进行包被，4℃过夜（8-12小时），用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液进行洗涤，去除残留明胶；
4、将剥离的华通氏胶剪碎为1mm3-3mm3的小块，其中，两组分别加入5mL浓度为1mg/mL的胶原酶A和浓度为1mg/mL的中性蛋白酶的混合液（二者的体积比为1：2），置于37℃、5%CO2的培养箱中消化处理2小时，期间每20分钟取出检测消化情况；另外一组直接接种于明胶包被的10cm培养皿，倒置37℃、5%CO2倒置6小时后，添加BPS-SFM无血清培养基进行培养；
5、进行消化的两组在经消化处理之后，离心收集细胞和残余组织，利用含1wt%的青霉素-链霉素且无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液（青霉素终浓度100U/mL，链霉素终浓度0.01g/100mL）洗去残留胶原酶A，以2000rpm的转速离心5分钟，弃上清；
6、向上述两组之中分别加入5mL浓度为0.25wt%的胰酶（含0.02%EDTA），置于37℃、5%CO2的培养箱中消化10分钟，期间每3分钟监测消化情况；消化处理之后，利用含1wt%青霉素-链霉素且无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液洗去残留酶，以2000rpm的转速离心5分钟，弃上清；
7、对两组经过了贴壁法和酶消化法处理后离心获得的组织和细胞分别用BPS-SFM无血清培养基（同实施例1，即酶消化法+贴壁法+BPS-SFM）和对照组Sciencell公司生产的MSCM-SF无血清培养基（酶消化法+贴壁法+MSCM-SF）进行重悬，接种于明胶铺被的培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱培养，待大部分组织团块周围细胞生长融合至85%时进行消化传代。
8、在显微镜下分别观察接种第6天、第12天时的细胞数和细胞状态，比较不同分离方法下获得的细胞数和P0代细胞获得时间。
实施例4
本实施例提供了一种比较和分析不同无血清培养基在脐带间充质干细胞的分离和扩增中作用的方法，其包括以下步骤：
1、获取10cm剖腹产新生儿脐带组织，用含2wt%青霉素-链霉素（青霉素终浓度100U/mL，链霉素终浓度0.01g/100mL）的PBS缓冲液充分去除血污；
2、将洗净的脐带均匀分为2段，分别进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉；
3、将剥离的华通氏胶剪碎为1mm3-3mm3的小块，其中两组分别加入5mL浓度为1mg/mL的胶原酶A和浓度为1mg/mL的中性蛋白酶的混合液（二者的体积比为1：2），置于37℃、5%CO2的培养箱中消化处理2小时，期间每20分钟取出检测消化情况；
4、进行消化的两组在经消化处理之后，离心收集细胞和残余组织，利用含1wt%的青霉素-链霉素且无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液（青霉素终浓度100U/mL，链霉素终浓度0.01g/100mL）洗去残留胶原酶A，以2000rpm的转速离心5分钟，弃上清；
5、分别加入5mL浓度为0.25wt%的胰酶（含0.02%EDTA），置于37℃、5%CO2的培养箱中消化10分钟，期间每3分钟监测消化情况；消化处理之后，利用含1wt%青霉素-链霉素且无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液洗去残留酶，以2000rpm的转速离心5分钟，弃上清；
6、取10cm培养皿，用浓度为0.1wt%的明胶对培养皿进行包被，4℃过夜（8-12小时），用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液进行洗涤，去除残留明胶；
7、分别用BPS-SFM无血清培养基（同实施例1）和对照组MSCM-SF无血清培养基重悬组织和细胞，接种于明胶铺被的培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱培养；
8、待大部分组织团块周围细胞生长融合至85%时，用TrypLE进行消化，计数，分别以4×104/mL重悬于BPS-SFM无血清培养基和对照组MSCM-SF无血清培养基中，接种于明胶铺被的培养皿中，标记为P1代细胞；
9、待两种培养基中P1代细胞生长融合至85%时，用TrypLE进行消化，计数。
实施例5流式细胞仪检测细胞表型
本实施例是对BPS-SFM培养基的P1代细胞进行细胞表型，按照以下步骤进行：
收集实施例4中实验组BPS-SFM培养基中的P1代细胞，分别与荧光标记的CD29、CD90、CD105、CD34和CD45等表面抗体孵育，并以FITC和PE标记的小鼠IgG同型抗体作为对照；在4℃下孵育45min，离心收集细胞；利用PBS缓冲液清洗3次后，将细胞重悬于400μL PBS缓冲液中，上机进行流式细胞仪分析。
图1a和图1b分别为将酶消化法和贴壁法相结合并在BPS-SFM无血清培养基培养条件下，分离、传代获得的P0、P1代MSCs的形态图，图1a为实施例2的P0代，图1b为实施例4的P1代。由图1a和图1b可以看出，在BPS-SFM无血清培养基中，P0、P1代MSCs呈均一短梭形生长，透光性良好。
图2a-图2f为单独贴壁法（实施例1）以及酶消化法和贴壁法相结合（实施例3）的分离方法，分别添加BPS-SFM无血清培养基和商品化的Sciencell公司无血清培养基MSCM-SF第6天和第12天分离P0代细胞的比较图。其中，图2a为酶消化法+贴壁法+BPS-SFM的分离方法第6天分离的P0代细胞图，图2b为单独贴壁法+BPS-SFM的分离方法第6天分离的P0代细胞图，图2c为酶消化法+贴壁法+MSCM-SF的分离方法第6天分离的P0代细胞图，图2d为酶消化法+贴壁法+BPS-SFM的分离方法第12天分离的P0代细胞图，图2e为单独贴壁法+BPS-SFM的分离方法第12天分离的P0代细胞图，图2f为酶消化法+贴壁法+MSCM-SF的分离方法第12天分离的P0代细胞图。
由图2a-图2f可以看出，在BPS-SFM无血清培养基培养的条件下，酶消化法和贴壁法相结合的分离方法在分离接种第6天即有大量原代细胞出现，而单独贴壁法则仅有少量细胞从组织周围滋生；而在第12天，酶消化法和贴壁法相结合的分离组出现大量原代细胞增殖，远多于同时接种的单独贴壁法组的细胞数。而在对照组培养基MSCM-SF中，即使采用酶消化法和贴壁法相结合的方法仍旧无法获得原代细胞。
图3为BPS-SFM无血清培养基中不同分离方法分离P0代细胞时细胞出现和传代的时间比较图，即实施例3中的分离和培养方法。由图3可以看出酶消化法和贴壁法相结合的分离方法可在更短时间内获得P0代细胞。
图4为BPS-SFM无血清培养基中不同分离方法分离获得的P0代细胞的细胞数比较图。结果显示酶消化法和贴壁法相结合的分离方法（实施例3中的分离和培养方法）比较贴壁法（实施例1）可获得更多P0代细胞。
表2
图5为实施例4中分别在BPS-SFM无血清培养基和商品化的Sciencell公司的MSCM-SF无血清培养基分离P0代细胞，并待细胞融合传代后，分别培养获得的P1代MSCs的细胞数比较图。表2的统计结果显示BPS-SFM无血清培养基体系可以在更短时间内获得更多MSCs细胞。
图6为实施例5测得的利用BPS-SFM无血清培养基分离传代获得的P1代细胞的表面标志流式结果。表3为阳性率结果。
表3
| 表面标志 | CD29 | CD90 | CD105 | CD34 | CD45 |
| 阳性率(%) | 99.56 | 99.92 | 93.51 | 0.41 | 0.86 |
由图6和表3可以看出BPS-SFM无血清培养基中培养获得的MSCs CD29、CD90、CD105的阳性率均＞95%，CD34和CD45的表达均为阴性。
Claims (7)
1.一种脐带间充干细胞的分离方法，其包括以下步骤：
(1)用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；
(2)将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通氏胶，同时去除脐动脉和脐静脉，将剥离的华通氏胶均匀剪碎，加入胶原酶A或者胶原酶A与中性蛋白酶的混合液，置于CO2培养箱中消化处理；所述胶原酶A的浓度为1mg/mL-3mg/mL，胶原酶A的添加量为每根10-15cm脐带添加15mL，消化处理的时间为2-4小时；胶原酶A与中性蛋白酶的混合液是由浓度为1mg/mL的胶原酶A和浓度为1mg/mL的中性蛋白酶混合得到的，所述胶原酶A与所述中性蛋白酶的体积比为1：2-1：4；
(3)消化处理之后，进行离心处理并收集细胞和残余组织，利用PBS缓冲液洗去残留酶，再次进行离心分离，弃去上层清液；
(4)加入胰酶，置于CO2培养箱中消化处理，加入PBS缓冲液混匀，离心分离，弃去上层清液；所述胰酶的浓度为0.05％-0.25％，添加量为每10-15cm脐带添加15mL，消化时间为10-15分钟；所述胰酶中添加有0.02wt％的EDTA，以所述胰酶的总量计；
(5)用MSCs培养基重悬组织和细胞，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后离心分离获得组织块和细胞重悬液；
其中，所述MSCs培养基为用于培养间充质干细胞的无血清培养基，以所述用于培养间充质干细胞的无血清培养基的体积计，其包括以下成分：
α-MEM 10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L-谷氨酰胺5mM、泊洛沙姆188 100mg/L、重组人白蛋白8g/L、重组人转铁蛋白20mg/L、重组人胰岛素10mg/L、Hepes 5mM、β-巯基乙醇50nM、胆固醇0.5mM、花生四烯酸50nM、棕榈酸0.26mg/L、棕榈油酸0.25mg/L、硬脂酸0.28mg/L、油酸0.28mg/L、亚油酸0.28mg/L、亚麻酸0.28mg/L、Cu 5nM、Se 30nM、Zn 1mM、Ga 0.3mM、Cr 5μM、Mg 0.3mM、Mn 5nM、谷胱甘肽1mg/L、对氨基苯甲酸1mg/L、氢化可的松50ng/mL、维生素PP50mg/L、维生素C 20mg/L、式I所示的化合物10μM、式II所示的化合物20μM、黄体酮15ng/mL、腐胺10mg/L、肝素10IU/mL、EGF 10ng/mL、b-FGF 10ng/mL、HGF 10ng/mL、VEGF 10ng/mL；
2.根据权利要求1所述的分离方法，其中，在所述含青霉素和链霉素的PBS缓冲液中，所述青霉素和链霉素的总质量百分比浓度为2-5％。
3.根据权利要求1或2所述的分离方法，其中，在所述含青霉素和链霉素的PBS缓冲液中，青霉素的含量为100U/mL，链霉素的含量为0.01g/100mL。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其中，以该无血清培养基的体积计，其还包括：原儿茶酸1.5mmol/L、PDGF-BB 10ng/mL、IGF-I 10ng/mL、GM-CSF 1-10ng/mL、TGF-β1-10ng/mL。
5.根据权利要求4所述的分离方法，其中，以该无血清培养基的体积计，其包括：原儿茶酸1.5mmol/L、PDGF-BB 10ng/mL、IGF-I 10ng/mL、GM-CSF 10ng/mL、TGF-β 10ng/mL。
6.一种脐带间充质干细胞的分离和培养方法，其包括以下步骤：
采用权利要求1-5任一项所述的脐带间充质干细胞的分离方法对健康的新生儿脐带组织进行分离获得组织块和细胞重悬液；
采用脐带间充质干细胞的培养方法对分离获得的组织块进行培养；
所述脐带间充质干细胞的培养方法包括以下步骤：
a、采用明胶对培养皿进行包被处理，接种细胞前弃去明胶，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液进行洗涤；
b、将分离获得的组织块和细胞重悬液接种于步骤a处理后的培养皿中；
c、待细胞生长融合至80％-90％时进行消化传代。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤a中，采用0.1％-0.2％的明胶对培养皿进行包被，然后在37℃、5％CO2的培养箱中孵育1小时或4℃孵育8-12小时。
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