CN110358727A - 一种处理重度污染的脐带组织的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种处理重度污染的脐带组织的方法,通过前期有序的消毒清洗，能够将组织内部和外部的污染物清理彻底，通过培养组织，多次筛选获得无污染的组织，通过组织块贴壁培养法获得质量合格的间充质干细胞；另外，整个筛选过程不添加任何抗生素抑制污染物生长，更客观地获得无污染的合格的细胞，对间充质干细胞的后期使用和实验不产生任何负面的影响。
Description
技术领域
本发明涉及脐带组织处理技术领域，具体为一种处理重度污染的脐带组织的方法。
背景技术
对于受污染的脐带，当前处理方法有以下几点：1.将脐带组织直接浸泡在75％的酒精当中消毒，缺点是如果浸泡时间短，污染物不能完全杀灭，如果浸泡时间长，脐带会失水且酒精会导致脐带组织失活，且血管中如果存在凝血或者无凝血而导致血管闭合状态，酒精无法进入血管内部，导致脐带血管中的污染物无法消除；2、通过培养过程中添加抗生素抑制细菌真菌生长，缺点是一旦发生重度污染，抗生素浓度低则无法抑制细菌真菌的繁殖，抗生素浓度稍高则会导致细胞无法正常生长，且操作繁琐，必须定时换液，修正浓度，而且即使初期能够抑制菌群增殖，后期菌群爆发增殖依旧无法控制。并且存在存储和应用隐患，在细胞收获期依旧依赖抗生素控制菌落，进入质检环节失去抗生素的作用必然是一个不合格品，且对GMP车间环境，液氮存储环境构成威胁；应用阶段如果涉及干细胞诱导，必然不能添加抗生素，而污染物的爆发必然导致样本的废弃；通过组织酶解法获得间充质干细胞，此方法将组织剪碎酶解，通过过滤离心法获得间充质干细胞，此过程中污染物伴随细胞一直存在，即便后期清洗离心，污染物也随之离心沉淀，与细胞混合在一起，无法彻底分离去除。
发明内容
本发明的目的在于提供一种处理重度污染的脐带组织的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种处理重度污染的脐带组织的方法,其特征在于：包括以下步骤：
A、去除脐带表面肉眼可见的污染源：将脐带放入培养皿中，用生理盐水冲洗，除去脐带表面较大的血块和粘液，每清洗一次换一个培养皿，至清洗后的溶液透明无色为止；
B、去除脐带内三根血管内的血液：用注射器吸取生理盐水，从血管一端插入，用止血钳夹紧，迅速推入生理盐水，冲洗血管内壁，每次冲洗量为50ml-60ml，每根血管冲洗5次-6次，若还有红色液体流出，则增加次数，至流出液体透明无色；
C、去除血管内的凝血：用注射器吸取肝素钠溶液，从血管一端插入，用止血钳夹紧，缓慢推入，每次冲洗量为20ml-30ml，每根血管冲洗5次-6次，直至流出的液体透明无色；
D、血管内部消毒：用注射器吸取5ml-6ml 75％酒精迅速冲洗血管内部，冲洗完毕后立即用20ml-30ml生理盐水冲洗血管，三根血管依次消毒；
E、脐带整体消毒：将脐带浸没在75％酒精中1分钟-2分钟，至脐带表面褶皱，用生理盐水冲洗三遍，剪去脐带两端各2厘米；
F、分离华通氏胶：将脐带展开，用手术刀直接割取脐带中心处的华通氏胶，操作过程中避免与血管有任何接触；
G、华通氏胶表层消化：将所获得的整块华通氏胶，按体积比1:1，加入浓度为0.1％的Ⅱ型胶原酶，37℃，150rpm恒温摇床震荡消化5分钟-6分钟；
H、华通氏胶表层清洗；
I、剪碎华通氏胶并清洗：将清洗后的组织放入离心管中剪成2mm×2mm大小的组织，加入生理盐水震荡清洗，用100目筛网过滤，重复两次；
J、华通氏胶的筛选；
K、脐带间充质干细胞培养扩增及冻存：根据组织贴壁法培养细胞，根据各机构要求扩增冻存脐带间充质干细胞。
优选的，所述步骤H具体过程如下：将消化后的组织用生理盐水冲洗，至洗液不产生拉丝状，然后将组织放入培养皿中，用组织镊夹住一端，用手术刀将组织表层刮去，然后再用生理盐水清洗3-5遍。
优选的，所述步骤J具体过程如下：一次筛选操作为选取大小厚度均一的组织块接入96孔板中，每个孔内接一个组织块，加入适量培养基没过组织即可，48小时后显微镜下观察，将污染的接种孔标记，将未污染的组织吸出，放入新的孔板中，如果污染的孔数大于4个，则需要重复接种96孔板，直至污染孔数小于等于4个；二次筛选操作为当96孔板中污染孔小于等于四个后，吸取无污染组织块，用六孔板接种，每个六孔板中放入4个组织块，组织块的量可根据污染孔的比例调整，如果污染孔数多，则每个六孔板中放入的组织块数量可减少为3个，降低交叉污染的概率，每个六孔板中加入适量培养基，没过组织块即可，72小时之后选取未污染的接种孔，将组织转移至T25瓶中贴壁培养，每个瓶中接种10至12个组织块，每24小时观察，如有污染直接舍弃此培养瓶。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明中，为解决脐带消毒不彻底的问题，本发明通过脐带内部清洗，去除凝血，内部消毒和外部消毒相结合，将脐带暴露在外的表面无遗漏地进行消毒。
2.本发明中，为解决华通氏胶分离过程中可能破坏血管和外皮而导致脐带内部组织受污染的问题，本发明采用眼科剪展开脐带组织，并用手术刀直接切取脐带中心部位的华通氏胶，避免了手术器械，目的组织与脐带血管和外皮的接触，尽可能避免目的组织遭受污染。
3.本发明中，为解决所获得的华通氏胶表面可能粘附和渗透的微量污染物，采用超短时间的酶解，并对组织刮洗，获得无污染物粘附的组织。
4.本发明中，如果脐带血管出现肉眼无法观察识别的破裂，并且有极少量的污染物渗透进入脐带深层也会导致干细胞提取失败，为解决这一问题，采用96孔板，6孔板，T25培养瓶逐步筛选分离出合格的无污染的组织进行培养。
5.本发明全程不使用任何抗生素，一方面抗生素的使用会干扰无污染组织的筛选，如果某个组织发生污染，必须使其暴露剔除，另一方面，抗生素的使用会对干细胞后期的扩增诱导产生不可预期的干扰。
6.本采用采用消毒，筛选，培养步骤，可以从重度污染的脐带组织中提取出合格的间充质干细胞，避免了资源的浪费，避免了存储机构的损失，更避免了客户仅有的干细胞存储机会的丧失。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供如下技术方案：一种处理重度污染的脐带组织的方法,包括以下步骤：
A、去除脐带表面肉眼可见的污染源：将脐带放入培养皿中，用生理盐水冲洗，除去脐带表面较大的血块和粘液，每清洗一次换一个培养皿，至清洗后的溶液透明无色为止；
B、去除脐带内三根血管内的血液：用注射器吸取生理盐水，从血管一端插入，用止血钳夹紧，迅速推入生理盐水，冲洗血管内壁，每次冲洗量为50ml-60ml，每根血管冲洗5次-6次，若还有红色液体流出，则增加次数，至流出液体透明无色；
C、去除血管内的凝血：用注射器吸取肝素钠溶液，从血管一端插入，用止血钳夹紧，缓慢推入，每次冲洗量为20ml-30ml，每根血管冲洗5次-6次，直至流出的液体透明无色；
D、血管内部消毒：用注射器吸取5ml-6ml 75％酒精迅速冲洗血管内部，冲洗完毕后立即用20ml-30ml生理盐水冲洗血管，三根血管依次消毒；
E、脐带整体消毒：将脐带浸没在75％酒精中1分钟-2分钟，至脐带表面褶皱，用生理盐水冲洗三遍，剪去脐带两端各2厘米；
F、分离华通氏胶：将脐带展开，用手术刀直接割取脐带中心处的华通氏胶，操作过程中避免与血管有任何接触；操作过程中组织块保持完整，不能用组织镊拉扯破碎，可用眼科剪和手术刀分离最为简易直接，不能将血管戳破,分离华通氏胶的位置尽量远离血管和外皮，其他部位的组织存在较大概率的污染和失活；
G、华通氏胶表层消化：将所获得的整块华通氏胶，按体积比1:1，加入浓度为0.1％的Ⅱ型胶原酶，37℃，150rpm恒温摇床震荡消化5分钟-6分钟；
H、华通氏胶表层清洗：目的是清理组织表面的杂质和半消化状态的组织；
I、剪碎华通氏胶并清洗：将清洗后的组织放入离心管中剪成2mm×2mm大小的组织，加入生理盐水震荡清洗，用100目筛网过滤，重复两次；
J、华通氏胶的筛选；
K、脐带间充质干细胞培养扩增及冻存：根据组织贴壁法培养细胞，根据各机构要求扩增冻存脐带间充质干细胞。
本发明中，步骤H具体过程如下：将消化后的组织用生理盐水冲洗，至洗液不产生拉丝状，然后将组织放入培养皿中，用组织镊夹住一端，用手术刀将组织表层刮去，然后再用生理盐水清洗3-5遍。
此外，本发明中，步骤J具体过程如下：一次筛选操作为选取大小厚度均一的组织块接入96孔板中，每个孔内接一个组织块，加入适量培养基没过组织即可，48小时后显微镜下观察，将污染的接种孔标记，将未污染的组织吸出，放入新的孔板中，如果污染的孔数大于4个，则需要重复接种96孔板，直至污染孔数小于等于4个；二次筛选操作为当96孔板中污染孔小于等于四个后，吸取无污染组织块，用六孔板接种，每个六孔板中放入4个组织块，组织块的量可根据污染孔的比例调整，如果污染孔数多，则每个六孔板中放入的组织块数量可减少为3个，降低交叉污染的概率，每个六孔板中加入适量培养基，没过组织块即可，72小时之后选取未污染的接种孔，将组织转移至T25瓶中贴壁培养，每个瓶中接种10至12个组织块，每24小时观察，如有污染直接舍弃此培养瓶。
本发明中，为解决脐带消毒不彻底的问题，本发明通过脐带内部清洗，去除凝血，内部消毒和外部消毒相结合，将脐带暴露在外的表面无遗漏地进行消毒；本发明中，为解决华通氏胶分离过程中可能破坏血管和外皮而导致脐带内部组织受污染的问题，本发明采用眼科剪展开脐带组织，并用手术刀直接切取脐带中心部位的华通氏胶，避免了手术器械，目的组织与脐带血管和外皮的接触，尽可能避免目的组织遭受污染；本发明中，为解决所获得的华通氏胶表面可能粘附和渗透的微量污染物，采用超短时间的酶解，并对组织刮洗，获得无污染物粘附的组织；本发明中，如果脐带血管出现肉眼无法观察识别的破裂，并且有极少量的污染物渗透进入脐带深层也会导致干细胞提取失败，为解决这一问题，采用96孔板，6孔板，T25培养瓶逐步筛选分离出合格的无污染的组织进行培养；本发明全程不使用任何抗生素，一方面抗生素的使用会干扰无污染组织的筛选，如果某个组织发生污染，必须使其暴露剔除，另一方面，抗生素的使用会对干细胞后期的扩增诱导产生不可预期的干扰；本采用采用消毒，筛选，培养步骤，可以从重度污染的脐带组织中提取出合格的间充质干细胞，避免了资源的浪费，避免了存储机构的损失，更避免了客户仅有的干细胞存储机会的丧失。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种处理重度污染的脐带组织的方法,其特征在于：包括以下步骤：
A、去除脐带表面肉眼可见的污染源：将脐带放入培养皿中，用生理盐水冲洗，除去脐带表面较大的血块和粘液，每清洗一次换一个培养皿，至清洗后的溶液透明无色为止；
B、去除脐带内三根血管内的血液：用注射器吸取生理盐水，从血管一端插入，用止血钳夹紧，迅速推入生理盐水，冲洗血管内壁，每次冲洗量为50ml-60ml，每根血管冲洗5次-6次，若还有红色液体流出，则增加次数，至流出液体透明无色；
C、去除血管内的凝血：用注射器吸取肝素钠溶液，从血管一端插入，用止血钳夹紧，缓慢推入，每次冲洗量为20ml-30ml，每根血管冲洗5次-6次，直至流出的液体透明无色；
D、血管内部消毒：用注射器吸取5ml-6ml 75％酒精迅速冲洗血管内部，冲洗完毕后立即用20ml-30ml生理盐水冲洗血管，三根血管依次消毒；
E、脐带整体消毒：将脐带浸没在75％酒精中1分钟-2分钟，至脐带表面褶皱，用生理盐水冲洗三遍，剪去脐带两端各2厘米；
F、分离华通氏胶：将脐带展开，用手术刀直接割取脐带中心处的华通氏胶，操作过程中避免与血管有任何接触；
G、华通氏胶表层消化：将所获得的整块华通氏胶，按体积比1:1，加入浓度为0.1％的Ⅱ型胶原酶，37℃，150rpm恒温摇床震荡消化5分钟-6分钟；
H、华通氏胶表层清洗：
I、剪碎华通氏胶并清洗：将清洗后的组织放入离心管中剪成2mm×2mm大小的组织，加入生理盐水震荡清洗，用100目筛网过滤，重复两次；
J、华通氏胶的筛选；
K、脐带间充质干细胞培养扩增及冻存：根据组织贴壁法培养细胞，根据各机构要求扩增冻存脐带间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种处理重度污染的脐带组织的方法，其特征在于：所述步骤H具体过程如下：将消化后的组织用生理盐水冲洗，至洗液不产生拉丝状，然后将组织放入培养皿中，用组织镊夹住一端，用手术刀将组织表层刮去，然后再用生理盐水清洗3-5遍。
3.根据权利要求1所述的一种处理重度污染的脐带组织的方法，其特征在于：所述步骤J具体过程如下：一次筛选操作为选取大小厚度均一的组织块接入96孔板中，每个孔内接一个组织块，加入适量培养基没过组织即可，48小时后显微镜下观察，将污染的接种孔标记，将未污染的组织吸出，放入新的孔板中，如果污染的孔数大于4个，则需要重复接种96孔板，直至污染孔数小于等于4个；二次筛选操作为当96孔板中污染孔小于等于四个后，吸取无污染组织块，用六孔板接种，每个六孔板中放入4个组织块，组织块的量可根据污染孔的比例调整，如果污染孔数多，则每个六孔板中放入的组织块数量可减少为3个，降低交叉污染的概率，每个六孔板中加入适量培养基，没过组织块即可，72小时之后选取未污染的接种孔，将组织转移至T25瓶中贴壁培养，每个瓶中接种10至12个组织块，每24小时观察，如有污染直接舍弃此培养瓶。
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