CN104429944B - 一种批量制备无菌油棕种胚样品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种批量制备无菌油棕种胚样品的方法。用剪枝剪沿成熟油棕果实果柄中心线剪开三分之二，掰开后用解剖针将种胚挑出；将外观健壮饱满的种胚用0.01‑0.05％的氯化汞冲洗后再在超净工作台中用0.01‑0.05％的氯化汞浸泡消毒5‑30min；消毒后的种胚经灭菌水漂洗后用灭菌滤纸除去灭菌水，接种至PhytoTechnology公司的含维生素的MS基本培养基中于20‑30℃条件下暗培养2‑5天，再转移至光培养条件下培养15‑25天即可萌发。本发明在短时间内即可获得大量无菌油棕种胚样品，污染率低，萌发率高，能够满足组织培养以及基于胚培养的转录组、蛋白质组等相关研究对大量样品的需求。

Description

一种批量制备无菌油棕种胚样品的方法

技术领域

本发明涉及油棕种胚样品的制备，具体涉及一种批量制备无菌油棕种胚样品的方法。

背景技术

油棕是重要的热带产油植物，目前主要通过种子进行种苗繁育，但存在种子萌发周期长且萌芽率低等问题。解除高度木质化的种子外壳及外围致密胚乳等物理限制，然后通过胚培养开展种苗繁育或种子萌发相关研究是一条重要途径，而获得完整的无菌种胚是前提。油棕胚呈长圆锥状，长度约2-3mm，质地柔脆，被包裹在坚硬的致密胚乳中，外围依次是高度木质化的种子外壳以及富含油脂的果肉。现有技术通常需要带胚乳灭菌，然后在超净工作台中剥胚，取胚效率低且胚的完整性差，而种胚的千粒重仅为1.2g左右，远远无法满足相关实验对每批次需制备大量种胚样品的需求。

取胚效率是制备大量种胚样品的技术瓶颈。鉴于油棕种胚细小柔脆，目前只能通过手工剥胚。含种胚的油棕胚乳仅为小型花生粒大小，近圆形且致密坚硬。带胚乳剥胚时，受力点不易掌握，尤其是在操作空间受限的超净工作台中，极易因手工取胚过程中的机械损伤导致后续污染或无法正常萌发，并因此严重拖慢取胚速度及接种速度。而用剪枝剪直接从油棕果实中取出裸胚具有受力面积大、可操作性强、取胚速度快、胚完整性好等优点。此外，直接进行裸胚消毒具有消毒试剂浓度低、消毒时间短、环境污染小等优点，是制备大量油棕种胚样品的理想方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种批量制备无菌油棕种胚样品的方法，该方法在短时间内即可获得大量无菌油棕种胚样品，能够满足组织培养以及基于胚培养的转录组、蛋白质组等相关研究对大量样品的需求。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种批量制备无菌油棕种胚样品的方法，包括如下步骤：

(1)收集成熟的油棕果实，用剪枝剪沿果柄中心线剪开三分之二，掰开即可看到乳白色的种胚，然后用解剖针将种胚挑出。

(2)用镊子挑选保留外观健壮饱满的种胚。

(3)用0.01-0.05％的氯化汞冲洗种胚后再在超净工作台中用0.01-0.05％的氯化汞浸泡消毒5-30min。

(4)将(3)中获得的种胚用灭菌水漂洗除去残留的氯化汞，再用灭菌滤纸除去灭菌水，接种至MS基本培养基中于20-30℃条件下暗培养2-5天，再转移至光培养条件下培养15-25天即可萌发；所述的MS基本培养基为PhytoTechnology公司的含维生素的MS基本培养基。

步骤(4)中所述的光培养条件优选为：光照强度为1500-3500LX、温度为25-35℃。

优选的，所述的批量制备无菌油棕种胚样品的方法包括如下步骤：

(1)收集成熟的油棕果实，用剪枝剪沿果柄中心线剪开三分之二，掰开即可看到乳白色的种胚，然后用解剖针将种胚挑出，转移至固定在烧杯口的聚酯纤维纱布上。

(2)根据肉眼观察比较，用镊子挑选保留外观健壮饱满的种胚。

(3)用装有0.01-0.05％氯化汞的喷壶在纱布上喷雾冲洗种胚，然后用药勺将种胚转移至超净工作台中的灭菌烧杯中，用0.01-0.05％的氯化汞浸泡消毒5-30min。

(4)将(3)中获得的种胚用灭菌水漂洗3-5次除去残留的氯化汞，转移至垫有灭菌滤纸的灭菌培养皿中除去灭菌水，然后接种至装有PhytoTechnology公司的含维生素的MS基本培养基培养皿中；接种好的培养皿先在20-30℃条件下暗培养2-5天，再转移至光培养条件下培养15-25天即可萌发。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

(1)用剪枝剪和解剖针直接取胚，可操作性强、取胚速度快，人工取胚效率可达100个/小时，且胚完整性好。

(2)由于油棕果穗发育状态及果粒着生位置的不同，种胚的发育状态及饱满程度也有所不同，而发育不良的胚容易寄生各种真菌和细菌，且不易萌发或后期生长不良。本发明提前剔除了发育不良的种胚，降低了种胚污染率，同时提高了后续萌发率。

(3)油棕种胚质地柔嫩，对酒精、次氯酸钠、氯化汞等常用消毒剂的耐受性差，如消毒处理不当，极易因消毒剂量过大导致无法萌发，而消毒剂量不足又会造成大量污染。本发明用0.01-0.05％的氯化汞消毒5-30min，消毒浓度低、时间短，环境污染小，可将种胚的整体污染率控制在5％以内，且不影响萌发，大大降低了后续胚培养的工作量。

(4)选择的培养基含有维生素，对消毒后的裸胚有一定的修复保护作用，同时有助于降低种胚的褐变几率。培养条件模拟了种胚在胚乳中萌发的模式，先在20-30℃条件下暗培养2-5天，使种胚通过吸胀作用充分吸水膨胀，再转移至光培养条件下进一步激活胚萌发过程，种胚污染率低、萌发速度快，可批量制备无菌油棕种胚样品用于组织培养以及基于胚培养的转录组、蛋白质组等相关研究。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。应理解，下面的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下述实施例中使用的MS基本培养基是PhytoTechnology公司含维生素的MS基本培养基。PhytoTechnology公司的MS基本培养基分两种，一种含维生素，一种不含维生素。

实施例1

(1)收集成熟的油棕果实，用剪枝剪沿果柄中心线剪开三分之二，掰开即可看到乳白色的种胚，然后用解剖针从将种胚挑出，转移至固定在烧杯口的聚酯纤维纱布上。

(2)根据肉眼观察比较，用小镊子挑除短小、瘦弱、干瘪等与其他种胚有明显差异的种胚，仅保留外观健壮饱满的种胚。

(3)用装有0.01％氯化汞的喷壶在纱布上喷雾冲洗可能粘有污染物的种胚，然后用小药勺将干净的种胚转移至超净工作台中的灭菌小烧杯中，用0.01％的氯化汞浸泡消毒30min。

(4)将获得的种胚用灭菌蒸馏水漂洗3次除去残留的氯化汞，转移至垫有灭菌滤纸的灭菌培养皿中除去多余的灭菌蒸馏水，然后接种至提前准备好的PhytoTechnology公司含维生素的MS基本培养基中。接种好的培养皿先在25℃条件下暗培养2天，再转移至光培养(光照强度为1500-3500LX、温度为25℃)条件下培养15天即可萌发，污染率为4.6％，最终萌发率为85.2％。

实施例2

(1)收集成熟的油棕果实，用剪枝剪沿果柄中心线剪开三分之二，掰开即可看到乳白色的种胚，然后用解剖针将种胚挑出，转移至固定在烧杯口的聚酯纤维纱布上。

(2)根据肉眼观察比较，用小镊子挑除短小、瘦弱、干瘪等与其他种胚有明显差异的种胚，仅保留外观健壮饱满的种胚。

(3)用装有0.01％氯化汞的喷壶在纱布上喷雾冲洗可能粘有污染物的种胚，然后用小药勺将干净的种胚转移至超净工作台中的灭菌小烧杯中，用0.05％的氯化汞浸泡消毒5min。

(4)将获得的种胚用灭菌蒸馏水漂洗5次除去残留的氯化汞，转移至垫有灭菌滤纸的灭菌培养皿中除去多余的灭菌蒸馏水，然后接种至提前准备好的PhytoTechnology公司含维生素的MS基本培养基中。接种好的培养皿先在25℃条件下暗培养3天，再转移至光培养(光照强度为1500-3500LX、温度为30℃)条件下培养20天即可萌发，污染率为3.9％，最终萌发率为81.4％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种批量制备无菌油棕种胚样品的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)收集成熟的油棕果实，用剪枝剪沿果柄中心线剪开三分之二，掰开即可看到乳白色的种胚，然后用解剖针将种胚挑出，转移至固定在烧杯口的聚酯纤维纱布上；

(2)根据肉眼观察比较，用小镊子挑除短小、瘦弱、干瘪与其他种胚有明显差异的种胚，仅保留外观健壮饱满的种胚；

(3)用装有0.01％氯化汞的喷壶在纱布上喷雾冲洗可能粘有污染物的种胚，然后用小药勺将干净的种胚转移至超净工作台中的灭菌小烧杯中，用0.05％的氯化汞浸泡消毒5min；

(4)将获得的种胚用灭菌蒸馏水漂洗5次除去残留的氯化汞，转移至垫有灭菌滤纸的灭菌培养皿中除去多余的灭菌蒸馏水，然后接种至提前准备好的PhytoTechnology公司含维生素的MS基本培养基中；接种好的培养皿先在25℃条件下暗培养3天，再转移至光培养条件下培养20天；

所述光培养的条件为光照强度为1500-3500LX、温度为30℃。