CN107568066A - 一种马铃薯茎尖脱毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种马铃薯茎尖脱毒方法，包括以下步骤：A1、田间标记选择健康植株，并且选择大且薯型标准的健康种薯，将种薯的块茎打破休眠后，热处理6周，期间喷施水杨酸2次；A2、从步骤A1得到的薯块上剥取大芽，进行清洗；A3、无菌条件下切下大芽顶部1‑3mm，接入液体培养基，培养成试管苗。本发明方法简化了茎尖剥离的步骤，显著降低了茎尖剥离技术难度，使再生植株由弱苗变壮苗，变传统多步骤成苗为一步成苗，成苗时间为30天左右，缩短脱毒周期约33.3％‑60％，实现了从薯块到脱毒苗长周期变短周期的跨越；增加成苗率44％以上，改善了茎尖剥离成苗困难的现状；提高脱毒率36％以上，突破了马铃薯常规脱毒法PVS和PVM难以脱除的技术瓶颈。

Description

一种马铃薯茎尖脱毒方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种马铃薯茎尖脱毒方法。

背景技术

马铃薯在种植过程中感染病毒而引起退化直接影响了马铃薯的品质及产量,严重阻碍了马铃薯的生产和利用。马铃薯脱毒技术,是解决马铃薯种薯退化的主要技术措施。因此，脱毒种薯越来越受到广大马铃薯栽培者的欢迎。我国在马铃薯茎尖组织培养方面也取得了很多研究成果,并在各地建成脱毒种薯繁育体系。马铃薯茎尖组织培养脱毒苗是马铃薯脱毒种薯产业的基础,优质快速地茎尖培养为以后脱毒苗和脱毒薯的生产赢得了时间和效益。通过组织培养途径，从而建立无病毒生产体系是目前非常有效的获得无病毒植株的途径。然而当前脱毒马铃薯茎尖培养效率低,成苗率和脱毒率达不到预期目的,因此优化马铃薯茎尖脱毒培养方法非常必要。

目前现有的马铃薯茎尖脱毒标准程序如下：块茎、植株或芽条(或者带病毒试管苗)；结合热处理(36℃，16小时光照；8小时黑暗，30℃)；表面清洗之后，常规消毒处理；解剖镜下剥离分生组织约0.1-0.3mm、带1-2个初生叶原基；在无菌条件下操作；接入已灭菌的分生组织培养基培养(3-5个月)；待分生组织分化后，转入生长培养基成苗(15-20天)；具5-7叶的茎尖分化苗扩繁(15-20天转接一次)；各株系茎尖分化苗的病毒及类病毒检测；无病原菌的试管苗留作基础种苗；至少一个生长季节；经遗传稳定性鉴定后工厂化快繁用。

该技术是目前马铃薯茎尖脱毒的一般程序，但存在以下不足：

1、脱毒周期长、环节多。

2、对技术和设备要求高，需要解剖镜，茎尖剥离的操作很细致，茎尖不能过大或过小，过大脱毒率低，过小不易成活，一般要求0.1-0.3mm，带1-2个叶原基最宜。

3、脱毒苗可能发生变异，茎尖剥离后的愈伤培养会在培养基内加一些激素，分生组织受这些激素影响可能会产生遗传变异，并且马铃薯茎尖细胞小，有可能遗传物质不完全。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种马铃薯茎尖培养效率高、成苗率和脱毒率均比较高的马铃薯茎尖脱毒方法。

一种马铃薯茎尖脱毒方法，包括以下步骤：

A1、田间标记选择健康植株，并且选择大且薯型标准的健康种薯，将种薯的块茎打破休眠后，热处理6周，期间喷施水杨酸2次；

A2、从步骤A1得到的薯块上剥取大芽，进行清洗；

A3、无菌条件下切下大芽顶部1-3mm，接入液体培养基，培养成试管苗。

进一步地，如上所述的马铃薯茎尖脱毒方法，在步骤A3之后，还包括以下步骤：

A4、剪取试管苗上部三分之一保种，剩余三分之二进行病毒检测；

A5、病毒检测合格后，将所述上部三分之一保种的部分按照常规方法进行快繁。

进一步地，如上所述的马铃薯茎尖脱毒方法，步骤A1中水杨酸的浓度为45mg/L。

进一步地，如上所述的马铃薯茎尖脱毒方法，所述液体培养基的配方为：

MS培养基，6-BA 0.4mg/L，GA3 0.1mg/L，NAA 0.1mg/L，水杨酸1-1.5mg/L；病毒唑20mg/L。

进一步地，如上所述的马铃薯茎尖脱毒方法，步骤A3的培养条件为：24℃，16小时光照，8小时黑暗，20-30天。

进一步地，如上所述的马铃薯茎尖脱毒方法，所述热处理的条件为：33-36℃，16小时光照；8小时黑暗，25-32℃；

进一步地，如上所述的马铃薯茎尖脱毒方法，所述清洗的方式为：将所述大芽加入吐温20，浸泡，荡洗片刻，流水冲洗30-60分钟；70％酒精浸润30秒，再用2.5％次氯酸钙浸泡15分钟，并搅动，无菌水冲洗3-5次。

有益效果：

第一、可以在相对短的周期内获得马铃薯脱毒试管苗

具体地，由于传统茎尖脱毒采用的是剥离茎尖生长点(0.1-0.3mm)，首先移入分生组织培养基培养(3-5个月)；待分生组织分化后，转入生长培养基成苗(15-20天)。从剥离下来的生长点到成苗需要转接两次，时间长达将近半年。而本发明方法采用的是大芽顶端1-3mm的芽尖，不需要经过分生组织培养，可直接在液体培养基中培养成苗，从切下的芽尖到成苗只需要20-30天，大大缩短成苗时间。

第二、成苗率高、脱毒率高

具体地，由于传统方法使用的茎尖生长点，茎尖剥离的操作很细致，剥离的茎尖组织过小不易成活。而本发明方法采取的芽尖1-3mm，切取的组织大，成活率更高。

本发明经过田间正向选择，提高了脱毒率，所谓正向选择即从田间标记选择健康植株，并且选择大且薯型标准的健康种薯，具体的措施为：在盛花期大田选择标记健康植株，并提前15天收获标记植株，选择其中大且薯型标准的健康种薯，块茎打破休眠后，人工气候箱内热处理6周(33-36℃，16小时光照；8小时黑暗，25-32℃)，期间喷施水杨酸2次。第三、得到的脱毒试管苗健康，遗传基因稳定

具体地，由于传统方法需要经过分生组织培养和生长培养两部分，时间长达3-6个月，这期间使用的培养基均大量使用激素来诱导其组织的分化以及植株的建成，而植物激素容易导致基因突变的产生；而本发明方法直接由大芽长成植株，不需要大量植物激素的刺激，只需要一次培养，时间短，使用激素量少，因此，本发明方法减少了激素的使用(激素能诱导遗传变异的产生)，从而使得到的脱毒试管苗遗传基因稳定；另外，分生组织越大，带有的遗传物质越多，遗传物质更稳定。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的马铃薯茎尖脱毒方法包括以下步骤：

步骤1、盛花期大田选择标记健康植株，并提前15天收获标记植株，选择其中大且薯型标准的健康种薯，块茎打破休眠后，人工气候箱内热处理6周(33-36℃，16小时光照；8小时黑暗，25-32℃)，期间喷施45mg/L水杨酸2次；

具体地，首先，提前收获标记是为了确定收获种薯是我们标记选择的健康植株，不会与其他植株混淆，同时避免后期地上部死亡的薯块感染病菌。

其次，侵染马铃薯的病毒有多种，有部分对温度敏感，部分则对温度不敏感。本发明采用热处理结合化学方法处理钝化病毒，可对更多病毒类型起到钝化作用。常规热处理钝化病毒方法主要是利用病毒受热的不稳定性而失去其活性达到脱病毒目的。一般采用35-55℃的热水或高温蒸汽、高温空气处理，温度越高处理的时间越短。但温度越高，其发芽率越低，而本发明采用的热处理温度比常规方法稍低，且加入一定变温处理，从而可以进一步提高发芽率。

再其次，水杨酸可钝化部分病毒，在热处理钝化病毒的基础上进一步的减少病毒对新芽的感染。另外，水杨酸的浓度选择45mg/L，可以使其钝化病毒效果最佳。

最后，关于打破休眠的方式，凡是成熟的种子，给予适宜的发芽条件，却不能正常发芽或发芽率很低，这一自然现象叫休眠。种子休眠是经过长期自然造择的结果，是植物的一种生物学特性。它可以保护种子在不良的环境下免受伤害，使其种族得以繁衍。但种子的休眠期长又会影响农业生产，因此需要用不同方法，解除种子休眠，以保证适时播种，不误农时。常用的打破马铃薯休眠的方法有很多种，本发明采用任意一种现有的打破休眠方式都可以，在此不做限制。

步骤2、将大芽从薯块上剥取，加入吐温20，流水冲洗30-60分钟；70％酒精浸润30秒，再用2.5％次氯酸钙浸泡15分钟，并搅动，无菌水冲洗3-5次；

具体地，吐温20是一种清洗剂，主要用于清洗，一般浸泡和荡洗的时间为20-30秒。

步骤3、无菌条件下切下芽顶部1-3mm，接入液体培养基，培养成试管苗(24℃，16小时光照，8小时黑暗，20-30天)；

具体地，传统方法只取茎尖生长点(0.1-0.3mm)，需大量激素诱导产生分生组织，而后才逐步成苗，操作难度大，需要激素多，成苗时间长，而本发明从大芽顶部切下1-3mm，操作方便，更易成苗，且成苗时间短，激素用量少，减少了基因诱变的几率。

步骤4、剪取试管苗上部三分之一保种，剩余三分之二进行病毒检测；

具体地，因为上部三分之一染毒率最低，而中下部染毒率更高，因此本发明选择染毒率最低的所述上部三分之一部分进行保种，而中下部容易染毒的部分进行病毒测试，以保证得到的脱毒苗更为纯净。保种则是为了确认脱毒苗无毒后进行进一步的扩增生产。病毒检测的主要目的是确认操作是否成功，确保得到了需要的脱毒试管苗。

步骤5、病毒检测合格后，将剪取得到的所述上部三分之一保种按照常规方法进行快繁。

本发明方法简化了茎尖剥离的步骤，显著降低了茎尖剥离技术难度，使再生植株由弱苗变壮苗，变传统多步骤成苗为一步成苗，成苗时间为30天左右，缩短脱毒周期约33.3％-60％，实现了从薯块到脱毒苗长周期变短周期的跨越；增加成苗率44％以上，改善了茎尖剥离成苗困难的现状；提高脱毒率36％以上，突破了马铃薯常规脱毒法PVS和PVM难以脱除的技术瓶颈。

本发明技术从缩短脱毒周期和保证马铃薯种薯遗传稳定性两个环节入手，通过盛花期标记健康植株；每株单独收获，并筛选个头大，薯型标准而健康，待其解除休眠后，对薯块进行热处理结合化学处理6周，无菌环境下剥离大茎尖，转入优化的液体培养基，对成苗的试管苗进行病毒检测，获得健康的脱毒试管苗，满足雾培及基质等无土栽培方式需要，从而达到健康和高效的马铃薯原原种生产。

本方法经过田间正选择，从源头上降低感染病毒的几率，而其他方法仅从种薯中直接挑选，均未涉及田间正选择，但许多病毒在大田中表现更为明显；另外，本发明采用热处理结合化学处理钝化病毒，可以钝化更多病毒类型，降低感染几率。综上，本发明从田间正选择和热处理两种处理手段结合起来，提高了脱毒率。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种马铃薯茎尖脱毒方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1、田间标记选择健康植株，并且选择大且薯型标准的健康种薯，将种薯的块茎打破休眠后，热处理6周，期间喷施水杨酸2次；

A2、从步骤A1得到的薯块上剥取大芽，进行清洗；

A3、无菌条件下切下大芽顶部1-3mm，接入液体培养基，培养成试管苗。

2.根据权利要求1所述的马铃薯茎尖脱毒方法，其特征在于，在步骤A3之后，还包括以下步骤：

A4、剪取试管苗上部三分之一保种，剩余三分之二进行病毒检测；

A5、病毒检测合格后，将所述上部三分之一保种的部分按照常规方法进行快繁。

3.根据权利要求1所述的马铃薯茎尖脱毒方法，其特征在于，步骤A1中水杨酸的浓度为45mg/L。

4.根据权利要求1所述的马铃薯茎尖脱毒方法，其特征在于，所述液体培养基的配方为：

MS培养基，6-BA 0.4mg/L，GA3 0.1mg/L，NAA 0.1mg/L，水杨酸1-1.5mg/L；病毒唑20mg/L。

5.根据权利要求1所述的马铃薯茎尖脱毒方法，其特征在于，步骤A3的培养条件为：24℃，16小时光照，8小时黑暗，20-30天。

6.根据权利要求1所述的马铃薯茎尖脱毒方法，其特征在于，所述热处理的条件为：33-36℃，16小时光照；8小时黑暗，25-32℃。

7.根据权利要求1所述的马铃薯茎尖脱毒方法，其特征在于，所述清洗的方式为：将所述大芽加入吐温20，浸泡，荡洗片刻，流水冲洗30-60分钟；70％酒精浸润30秒，再用2.5％次氯酸钙浸泡15分钟，并搅动，无菌水冲洗3-5次。