CN107318656B - 一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法 - Google Patents

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Abstract

本发明具体为一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法，解决了现有马铃薯茎尖脱毒存在脱毒周期长、脱毒苗易发生变异、制苗成本高且病毒检测合格率低的问题。a、将马铃薯块茎置于土壤上发芽，发芽后进行拔高培养；b、待催生的芽长到50‑80cm，在最高的茎上剪茎尖，浸泡冲洗灭菌后无菌水冲洗，接种于培养基上；c、茎尖苗在25℃‑28℃的温度下、2200Lx‑2500Lx的光照强度下培养；d、待茎尖苗长高到7‑8cm时，剪取茎尖置于培养基中培养；e、重复d步骤4‑5次后剪取茎尖保种，剩余茎段进行病毒检测；f、病毒检测合格后，脱毒完成。本发明大幅提高了脱毒率，而且杜绝了脱毒苗变异现象的发生，同时检测的合格率较高。

Description

一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法
技术领域
本发明涉及植物组培与种植技术领域，具体为一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法。
背景技术
马铃薯是我国主要的蔬菜作物。2015年1月，农业部制定的《2015年种植业工作要点》已经把马铃薯列为重点，今后马铃薯将逐渐成为我国第四大主粮作物。国家将在不和三大主粮抢水争地的前提下，将马铃薯由目前的8000多万亩，到2020年扩大至1.5亿亩，把亩产量由目前的1吨多提高到2吨以上。这也是中央1号文件所提的“稳粮增收、提质增效”。
马铃薯生产中，存在的病毒和类病毒虽然有十几种，但广大马铃薯产区普遍存在的为马铃薯X 病毒（PVX）、马铃薯A 病毒和Y病毒（PVA，PVY）、马铃薯S 病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）以及马铃薯纺锤状块茎类病毒（PSTVd），这些病毒和类病毒使马铃薯品种退化，在马铃薯的连年种植过程中，产量和品质逐年下降，而解决退化的有效措施就是生产脱毒种薯。
马铃薯茎尖培养脱毒苗是马铃薯脱毒种薯产业的基础，优质快速地茎尖培养为以后脱毒苗和脱毒薯的生产赢得了时间和效益，当前脱毒马铃薯茎尖培养脱毒的标准程序如下：块茎、植株成芽条（或者带病毒试管苗）；结合热处理（36℃,16小时光照，8小时黑暗，30℃）；表面清洗之后，常规消毒处理；解剖镜下剥离分生组织约0.1~0.3mm、带1~2个出生叶原基；在无菌条件下操作：接入已灭菌的分生组织培养基培养（4-5个月）；待分生组织分化后，转入生长培养基成苗（15-20天）；具5~7片叶的茎尖分化苗扩繁（15-20天转接一次）；各株系茎尖分化苗的病毒及类病毒检测；无病原菌的试管苗留作基础种苗；至少一个生长季节，经遗传稳定性鉴定后工厂化快繁用。
该技术是目前马铃薯茎尖脱毒的一般程序，但存在如下不足之处：
1、脱毒周期长、环节多，需要经过热处理使病毒钝化，茎尖剥离以后进行愈伤及成苗培养，获得脱毒苗以后还需要进行稳定性鉴定；
2、对技术和设备要求高，需要解剖镜，茎尖剥离的操作很细致，茎尖不能过大或过小，过大脱毒率低，过小不易成活，一般要求0.1-0.3mm，带1-2个叶原基最宜；
3、脱毒苗可能发生变异，茎尖剥离后的愈伤培养会在培养基内加一些激素，分生组织受这些激素影响可能会产生遗传变异，并且马铃薯茎尖细胞小，有可能遗传物质不完全。
目前也有部分学者通过以下方法进行脱毒：将需要脱毒的原原种进行田间播种；植株生长期常规管理；在现蕾或开花期从马铃薯地理筛选健康的植株，做好标记，较其他植株提前半个月收获，每株筛选个大，薯型标准和健康的种薯单独收获和贮存；种薯发芽后，剪取幼芽进行病毒检测；将检测健康的种薯，重新催芽后剪取大芽经酒精和升汞杀菌处理后，放于常规MS固体培养基上做成茎段苗；将长高的茎段苗剪取上部三分之一高度保种，剩余三分之二进行病毒检测；病毒检测合格后，按照常规方法进行快繁。
该技术存在如下不足之处：
1、最少需要两次病毒检测，增加了制苗成本；
2、通过剪取幼芽进行病毒检测健康的种薯重新催芽后得到的芽不一定不含有病毒；
3、将长高的茎段苗剪取上部三分之一高度保种，存留的三分之一不一定不含有病毒；
4、病毒检测合格率低，制苗效率低且成本较高。
发明内容
本发明为了解决现有马铃薯茎尖脱毒存在脱毒周期长、脱毒苗易发生变异、制苗成本高且病毒检测合格率低的问题，提供了一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法。
本发明是采用如下技术方案实现的：一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法，采用如下步骤：a、将需要脱毒的马铃薯块茎置于四周遮光、顶部透光环境中的土壤上发芽，发芽后在20℃-25℃的温度进行拔高培养；b、待催生的芽长到50-80cm，在最高的茎上剪取0.8-1cm的茎尖，洗洁精水浸泡后洗净，然后清水中浸泡后冲洗干净，接着灭菌后无菌水冲洗4-5次，接种于培养基上做成茎尖苗；c、茎尖苗在25℃-28℃的温度下、2200Lx-2500Lx的光照强度下每天光照12小时进行培养；d、待茎尖苗长高到7-8cm时，在超净台上剪取0.2mm的茎尖（以肉眼可见为准）置于培养基中按步骤c的培养条件进行培养；e、重复d步骤4-5次后剪取茎尖保种，剩余茎段进行病毒检测；f、病毒检测合格后，脱毒完成。
本发明所述的马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法大大简化了脱毒的步骤，不需要经过热处理操作，简化了茎尖剥离的步骤，撇开了解剖镜下的细微操作，避免了因茎尖过小而丢失遗传物质的问题；而且茎尖剥离后的培养中不添加激素，大大降低了产生遗传变异的几率；同时拔高培养及茎尖苗培养参数的选取是通过大量反复试验得出的，克服了现有马铃薯茎尖脱毒存在脱毒周期长、脱毒苗易发生变异、制苗成本高且病毒检测合格率低的问题。
培养基选用含糖30g/L、PH值为5.6-6.4的MS培养基。
该培养基的选取在保证脱毒效果的前提下，大幅降低了产生遗传变异的几率。
消毒时，先用体积百分比为75%酒精表面消毒30s，然后用质量百分比为0.05%氯化汞溶液消毒10min。
培养基盛放用培养皿的半径为3.5cm，每个培养米内均匀分布4-5颗茎尖苗。
本发明所述的脱毒方法大大简化了脱毒的工序，茎尖长度的选取大幅提高了脱毒率，而且简化了茎尖剥离的步骤，杜绝了脱毒苗变异现象的发生，同时通过重复培养使得病毒检测的合格率较高，适用于在其他植物组织培养。
表1为采用本发明所述的一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法后各类病毒的脱毒情况。
。
具体实施方式
实施例1
一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法，采用如下步骤：a、将需要脱毒的马铃薯块茎置于四周遮光、顶部透光环境中的土壤上发芽，发芽后在20℃的温度进行拔高培养；b、待催生的芽长到50cm，在最高的茎上剪取0.8cm的茎尖，洗洁精水浸泡后洗净，然后清水中浸泡后冲洗干净，接着灭菌后无菌水冲洗4次，接种于培养基上做成茎尖苗；c、茎尖苗在25℃的温度下、2200Lx的光照强度下每天光照12小时进行培养；d、待茎尖苗长高到7cm时，在超净台上剪取0.2mm的茎尖置于培养基中按步骤c的培养条件进行培养；e、重复d步骤4次后剪取茎尖保种，剩余茎段进行病毒检测；f、病毒检测合格后，脱毒完成。
培养基选用含糖30g/L、PH值为5.6的MS培养基；消毒时，先用体积百分比为75%酒精表面消毒30s，然后用质量百分比为0.05%氯化汞溶液消毒10min；培养基盛放用培养皿的半径为3.5cm，每个培养米内均匀分布4颗茎尖苗。
实施例2
一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法，采用如下步骤：a、将需要脱毒的马铃薯块茎置于四周遮光、顶部透光环境中的土壤上发芽，发芽后在25℃的温度进行拔高培养；b、待催生的芽长到80cm，在最高的茎上剪取1cm的茎尖，洗洁精水浸泡后洗净，然后清水中浸泡后冲洗干净，接着灭菌后无菌水冲洗5次，接种于培养基上做成茎尖苗；c、茎尖苗在28℃的温度下、2500Lx的光照强度下每天光照12小时进行培养；d、待茎尖苗长高到8cm时，在超净台上剪取0.2mm的茎尖置于培养基中按步骤c的培养条件进行培养；e、重复d步骤5次后剪取茎尖保种，剩余茎段进行病毒检测；f、病毒检测合格后，脱毒完成。
培养基选用含糖30g/L、PH值为6.4的MS培养基；消毒时，先用体积百分比为75%酒精表面消毒30s，然后用质量百分比为0.05%氯化汞溶液消毒10min；培养基盛放用培养皿的半径为3.5cm，每个培养米内均匀分布5颗茎尖苗。
实施例3
一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法，采用如下步骤：a、将需要脱毒的马铃薯块茎置于四周遮光、顶部透光环境中的土壤上发芽，发芽后在22℃的温度进行拔高培养；b、待催生的芽长到63cm，在最高的茎上剪取0.9cm的茎尖，洗洁精水浸泡后洗净，然后清水中浸泡后冲洗干净，接着灭菌后无菌水冲洗4次，接种于培养基上做成茎尖苗；c、茎尖苗在27℃的温度下、2355Lx的光照强度下每天光照12小时进行培养；d、待茎尖苗长高到8cm时，在超净台上剪取0.2mm的茎尖置于培养基中按步骤c的培养条件进行培养；e、重复d步骤5次后剪取茎尖保种，剩余茎段进行病毒检测；f、病毒检测合格后，脱毒完成。
培养基选用含糖30g/L、PH值为5.7的MS培养基；消毒时，先用体积百分比为75%酒精表面消毒30s，然后用质量百分比为0.05%氯化汞溶液消毒10min；培养基盛放用培养皿的半径为3.5cm，每个培养米内均匀分布4颗茎尖苗。

Claims (5)

1.一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法，其特征在于：采用如下步骤：a、将需要脱毒的马铃薯块茎置于四周遮光、顶部透光环境中的土壤上发芽，发芽后在20℃-25℃的温度进行拔高培养；b、待催生的芽长到50-80cm，在最高的茎上剪取0.8-1cm的茎尖，洗洁精水浸泡后洗净，然后清水中浸泡后冲洗干净，接着灭菌后无菌水冲洗4-5次，接种于培养基上做成茎尖苗；c、茎尖苗在25℃-28℃的温度下、2200Lx-2500Lx的光照强度下每天光照12小时进行培养；d、待茎尖苗长高到7-8cm时，在超净台上剪取0.2mm的茎尖置于培养基中按步骤c的培养条件进行培养；e、重复d步骤4-5次后剪取茎尖保种，剩余茎段进行病毒检测；f、病毒检测合格后，脱毒完成。
2.根据权利要求1所述的一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法，其特征在于：培养基选用含糖30g/L、p H值为5.6-6.4的MS培养基。
3.根据权利要求1或2所述的一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法，其特征在于：消毒时，先用体积百分比为75%酒精表面消毒30s，然后用质量百分比为0.05%氯化汞溶液消毒10min。
4.根据权利要求1或2所述的一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法，其特征在于：培养基盛放用培养皿的半径为3.5cm，每个培养皿内均匀分布4-5颗茎尖苗。
5.根据权利要求3所述的一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法，其特征在于：培养基盛放用培养皿的半径为3.5cm，每个培养皿内均匀分布4-5颗茎尖苗。
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