CN103891558B

CN103891558B - 柑桔接穗预处理促使复合感染病原脱除的技术

Info

Publication number: CN103891558B
Application number: CN201410132037.XA
Authority: CN
Inventors: 姜玲; 卢铭玉
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2014-04-02
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2034-04-02
Also published as: CN103891558A

Abstract

本发明公开了柑桔接穗预处理促使复合感染病原脱除的技术，采集柑桔枝条，将柑桔枝条修剪去掉叶片和叶柄，用次氯酸钠(NaClO)水溶液表面消毒；对表面消毒后的柑桔枝条接穗进行分子检测；当检测过的柑桔枝条感染HLB和CTV病毒时，对接穗材料进行药剂脱毒处理，获得无病毒芽，完成柑桔接穗预处理脱毒的步骤。本发明的有益效果是通过小分子杀细菌三氯生（TCL）及几种抗生素处理，获得脱除柑桔衰退病（CTV）和柑桔黄龙病（HLB）病原的无病毒茎尖材料。脱毒效率高，效果好。为进一步茎尖微芽嫁接或嫩芽嫁接提供了无病毒的茎尖材料。

Description

柑桔接穗预处理促使复合感染病原脱除的技术

技术领域

本发明属于无病毒良种繁育技术领域，涉及柑桔接穗预处理促使复合感染病原脱除的技术。

背景技术

柑桔脱毒技术是实现无病毒良种繁育的关键环节，是果树栽培、育种及引种推广领域中必备的配套技术。伴随着气候变化及国内外柑桔品种引进和交流的增多，柑桔病毒及类似病毒的感染日趋严重，复合感染情况加剧，因此，研究新型、高效、实用的柑桔脱毒技术具有重要的实际应用价值。

1.柑桔病毒及类似病毒病的危害：柑橘种植面积和产量逐年增加，在栽培过程中，柑橘多采用无性繁殖，往往易感染一种或几种病毒，病毒的危害已成为制约柑橘产业发展的主要障碍。柑橘黄龙病（Huanglongbing，HLB）是我国重大的植物检疫性病害，是当前柑橘生产上来势最凶、波及面最广、防治最难的传染性和毁灭性病害（Bové，2006；Grafton-Cardwelletal.，2013）。柑桔木虱是柑桔黄龙病重要的传播媒介。HLB由一种特殊的韧皮部杆菌引起，同行研究认为：HLB病原菌CandidatusLiberibacter是一种革兰氏阴性菌，属于变形细菌门（Proteobacteria），α-变形细菌亚纲（Alpha-Proteobacteria）。它侵染主要的柑橘主栽品种和近缘属植物，它可以通过菟丝子传播给指示植物长春花及一些敏感的植物，如：烟草和番茄等非芸香科植物。通过16SrDNA序列分析证明，韧皮部杆菌与木豆丛枝病植原体的相似性达到99％（Teixeiraetal.，2008），在世界范围内，柑橘黄龙病迅速蔓延，迄今为止，尚没有一种能根除柑橘黄龙病的有效方法，在柑橘品种资源中也未发现完全抗病的品种。受全球性暖冬气候影响，传病虫媒越冬逐年北移，带病（虫）柑桔种苗的引种增多而导致该病发生面积有逐年扩大的趋势。柑桔衰退病(Citrustristezavirus，CTV)，是世界性的柑桔病毒病害，广泛分布于世界各柑桔产地，对全世界柑桔产业造成了严重的威胁。最早它是在南美洲的阿根廷和巴西发现的，先后有50多个国家和地区有此病的发生，20多个国家将其列为检疫对象。在我国福建、浙江及广东等柑桔主要产区分布相当普遍。此外，柑橘黄龙病和柑橘衰退病复合感染现象日益严重。

2.HLB的防治和检测：注射农用四环素曾经被用于防治黄龙病，在田间缓解症状，恢复产量有一定的作用，但是，成本过高，在我国广西省，及时清除病株减少病原，采用联防的措施，HLB的控制产生了良好的效果。在巴西，通过清除病株和使用杀虫剂控制木虱，黄龙病的防治已经取得一定的成果（Bové，2006）。另外，选用相对抗性强的品种、加强柑桔木虱防治、推广无毒苗木、间种番石榴趋避木虱等园艺手段，也是可以减少黄龙病的为害（Morganetal.，2009）。但是，在大规模的新建果园，采用无病毒苗木仍是至关重要的方法。目前，柑橘黄龙病PCR检测主要根据16SrDNA和β-操纵子设计引物进行（BoveandAyres2007），实时定量PCR也被广泛应用于柑橘黄龙病的检测（Lietal，2008；Dengetal，2008），灵敏度高，准确性高，对于田间感病状况能快速地监控。

3.柑桔无病毒良种繁育的重要性：各级政府十分重视优良品种的引进和推广，先后投入许多资金从国外引进各类柑橘优良品种。但是无病毒工厂化育苗系统有限的使用，大大影响了新品种的推广速度。传统的柑橘品种育苗主要是在大田中进行操作，由于苗木管理制度不完善，果农自繁自育的现象普遍，这样，不能保证品种的健康、纯正和苗木质量。建立无病毒苗木繁育体系，采用工厂化育苗方法是解决柑橘品种结构调整中优良种苗供不应求问题的关键手段。欧美各国早在上世纪80年代，就开始研究果树的脱毒技术，获得了一大批无病毒苗木。90年代以来，又着重开展果树良种繁育体系建设，推行果树无病毒化栽培。

4.研究新型的高效的脱毒技术的必要性：除了昆虫作为传播媒介，柑橘病毒广泛传播的另一个主要原因是带毒接穗的使用，这就需要对优良品种进行脱毒，从采穗圃再获得无病毒接穗，扩繁后建立健康无毒的柑橘园，因此，研究新型的、高效的、操作方便的脱毒技术十分必要，有效的脱毒方法对柑橘产业的发展具有重要意义。茎尖嫁接脱毒的原理是：根据一般病毒在植物体内分布不均匀，顶端生长点的分生组织不带毒或疏导组织不健全，病毒不能上运，茎尖中检查不到病毒，从而通过茎尖嫁接脱毒得到无毒苗木。已有研究表明，黄龙病和哀退病的脱毒率分别为100%和78%。(宋端琳等，1990)。含有3个和4个叶原基的茎尖嫁接获得的试管苗其HLB脱毒率分别为95.7%和73%，含2个叶原基条件下，采用“一株两芽法”微芽嫁接可以获得的STG成活率仅为47.7%(姜玲等，2007)。利用50℃湿热空气、相对湿度95％处理苗木60分钟，促使其抽出新梢，再利用新梢茎尖进行微芽嫁接，明显提高嫁接成活率(谭祖国等，2011)。

尽管茎尖微芽嫁接技术是一种有效的脱毒技术，客观地讲，由于在不同的季节病原浓度存在着差异，加上同时有两种病原感染的影响，单独使用茎尖微芽嫁接时，就面临着新的挑战：(1)茎尖来源受到季节的影响，在四季分明的一些省份，在自然状况下，新梢集中在春季产生，夏季有部分芽的产生，而秋冬季节通常没有柑桔茎尖材料来满足柑桔脱毒的需要。这就需要我们人为地采取措施，促进茎尖新芽的产生；(2)当病原浓度较高时，脱毒效率降低；(3)当采用小于3个叶原基微芽嫁接时，试管苗成活率低，但芽越大，脱毒效果越差；（4）生产上经常不能提供足够的苗木作脱毒材料，需要提供接穗作为脱毒原始材料。

发明内容

本发明的目的在于提供柑桔接穗预处理促使复合感染病原脱除的技术，解决了不同季节提供柑桔接穗材料时，材料病原浓度较高时，脱毒效率降低的问题。

本发明采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1：采集柑桔枝条，将柑桔枝条修剪去掉叶片和叶柄，用次氯酸钠(NaClO)水溶液表面消毒；

步骤2：对表面消毒后的柑桔枝条接穗进行分子检测；

步骤3：当检测过的柑桔枝条仅受到HLB感染时，对接穗材料进行如下药剂脱毒处理：

方法一：接穗扦插于含有2-5μMTCL溶液和1/4MS培养基的高压灭菌的蛭石中，用保鲜膜封住，放置在培养室中，催芽12天后获得无病毒芽，完成柑桔接穗预处理脱毒的步骤，茎尖材料可以用于后续的茎尖嫁接或嫩芽嫁接繁殖；

或方法二：接穗在含有30-50μM的TCL溶液或接穗在含有0.75-1.5g/l阿莫西林或0.75g/l四环素溶液中浸泡1h，然后，扦插于经过高压灭菌的蛭石中，蛭石中含有1/4MS培养基，扦插时用保鲜膜封住，放置在培养室中，催芽12天后获得无病毒芽，完成柑桔接穗预处理脱毒的步骤；

步骤4：当检测过的柑桔枝条同时受到HLB和CTV感染时，对接穗材料进行如下药剂脱毒处理：将枝条浸泡于含有30-50μM的TCL溶液处理1h或者将枝条浸泡于含有0.75g/L四环素处理枝条1h。然后，扦插于经过高压灭菌的蛭石中，蛭石中含有1/4MS培养基，扦插时用保鲜膜封住，放置在培养室中，催芽12天后获得无病毒芽，完成柑桔接穗预处理脱毒的步骤。

本发明的特点还在于步骤1中消毒采用2%的次氯酸钠(NaClO)水溶液对枝条表面消毒5min。步骤3和步骤4中，培养室设定温度28℃、光照2000lx、光照时间14h/d。

本发明的有益效果是通过小分子杀细菌三氯生（TCL）及几种抗生素处理，获得脱除柑桔衰退病（CTV）和柑桔黄龙病（HLB）病原的无病毒茎尖材料。脱毒效率高，效果好。为进一步茎尖微芽嫁接或嫩芽嫁接提供了无病毒的茎尖材料。

附图说明

图1是本发明实施步骤流程图；

图2供试绿橙样品处理之前的柑桔黄龙病Real-timePCR检测；

图3接穗预处理及催芽试验；

图4供试绿橙样品处理后的柑桔黄龙病Real-timePCR检测；

图5处理前和处理后的绿橙嫩芽CTV检测情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

如图1所示为本发明方法步骤，本发明主要在两个方面处理：

(1)接穗预处理脱毒：接穗预处理是采用不同浓度的化学小分子杀细菌三氯生（TCL）及几种抗生素进行预处理，在柑桔茎尖萌发之前和之后，对材料分别进行HLB和CTV的病原分子检测，探讨不同处理去除HLB和CTV病原，或降低病原浓度的效果。从中筛选出有效的小分子杀细菌或杀病毒剂或筛选出有效的抗生素，并获得最佳的处理浓度和处理方法。经过药剂处理并检测后，如果获得的是无毒接穗，可以直接采用常规嫁接繁殖苗木。大大缩短了繁殖健康苗木需要的时间。

(2)催芽处理及时获得茎尖接穗：在适宜的温度和湿度条件下，接穗预处理脱毒可能在催芽过程中进行，即：边用药剂进行脱毒处理，边进行催芽试验；也可能先进行药剂的预处理，再进行催芽处理。其目的是打破季节的限制，在不同的季节，获得茎尖接穗，有利于茎尖微芽嫁接脱毒操作。在接穗预处理和茎尖微芽嫁接的双重脱毒作用下，获得健康的柑桔苗木。

本发明步骤如下：

步骤1：接穗材料的采集：

采集柑桔枝条，将柑桔枝条修剪去掉叶片和叶柄，用2%的次氯酸钠(NaClO)水溶液表面消毒5min，用水冲洗干净；

步骤2：对表面消毒后的柑桔枝条接穗进行分子检测；

方法一：接穗扦插于含有2-5μMTCL溶液和1/4MS培养基的高压灭菌的蛭石中，用保鲜膜封住，保温保湿，放置在培养室中，温度28℃，光照2000lx，光照时间14h/d，催芽12天后，完成柑桔接穗预处理脱毒的步骤。茎尖材料可以用于后续的茎尖嫁接或嫩芽嫁接繁殖。

或方法二：接穗在含有30－50μM的TCL溶液或接穗在含有0.75－1.5g/l阿莫西林或0.75g/l四环素溶液中浸泡1h，然后，扦插于经过高压灭菌的蛭石中（蛭石中含有1/4MS培养基）扦插时用保鲜膜封住，保温保湿，放置在培养室中，温度28℃，光照2000lx，光照时间14h/d，催芽12天后，获得无病毒芽，完成柑桔接穗预处理脱毒的步骤。

步骤4：当检测过的柑桔枝条同时受到HLB和CTV感染时，对接穗材料进行如下药剂脱毒处理：将枝条浸泡于含有30－50μM的TCL溶液处理1h或者将枝条浸泡于含有0.75g/L四环素处理枝条1h。然后，扦插于经过高压灭菌的蛭石（蛭石中含有1/4MS培养基）中，扦插时用保鲜膜封住，保温保湿，放置在培养室中，温度28℃，光照2000lx，光照时间14h/d，催芽12天后，完成柑桔接穗预处理脱毒的步骤。

对本发明进行实验验证：

（1）接穗的采集：本试验采用的柑桔枝杆材料为海南琼中县采集的优良柑桔品种材料‘绿橙’，原始品种名为红江橙，它是甜橙(CitrusSinensis(L.)Osbeck与桔(C.reticulateBlanco)的嫁接嵌合体优良品种。

（2）接穗材料常规消毒处理：对实时定量RT_PCR分子检测后，将感病的接穗材料进行药剂处理和催芽试验。每次将200枝，柑桔绿橙枝条适当修剪，修剪去掉叶片和叶柄，每个枝条上含芽数为8-15个然后用2%的次氯酸钠(NaClO)水溶液表面消毒5min，用自来水冲洗干净。平均每个处理用枝条15枝(即15个重复)。做两个批次重复试验。试验结果取平均值。试验中所用图片通过Excell软件产生，标准误差值通过统计分析计算获得。

（3）接穗材料的药剂处理：根据表1中的设计，本试验包含了LC1：清水对照，LC2：接穗基部扦插入含有2μMTCL的蛭石中，LC3：接穗基部扦插入含有5μM三氯生(TCL)的蛭石中，LC4:终浓度为30μMTCL浸泡处理接穗1h，LC5:50μMTCL浸泡处理接穗1h，LC6:0.75g/l四环素浸泡处理接穗1h，LC7:1.5g/l四环素浸泡接穗1h，LC8:0.75g/l青霉素浸泡1h,LC8:1.5g/l青霉素浸泡接穗1h和50℃湿热蒸汽处理1h。具体操作程序是：将接穗进行表面消毒，然后，接穗在试剂中浸泡1h，扦插于经过高压灭菌的蛭石中。蛭石的体积为塑料盒的1/3，且用1/4MS培养基(含有大量元素和微量元素，无蔗糖和有机成分)拌匀，扦插后用保鲜膜封住，保温保湿，放置在培养室中，温度28℃，光照2000lx，光照时间14h/d。定时检查湿度情况。其中2μM和5μM三氯生(TCL)处理是将试剂加入到蛭石中，在催芽过程中，长时间持续处理。萌芽后材料用于嫁接和分子检测。下表1为柑橘黄龙病Real-timePCR检测所用引物。

表1

(4)微芽嫁接和常规嫁接：

砧木的培养：从果实中取出种子，用5%NaOH浸泡5min去果胶，清水冲洗干净，与超净工作台上用10%NaClO消毒30min,无菌水冲洗4-5次，播种到含MS中，暗培养15d。温度28℃。微芽嫁接：取芽用8%NaClO消毒10min，在双目显微镜下剥去含3-4个叶原基的茎尖嫁接到15-18d的砧木上，培养在含MS液体培养基的试管中。去除萌蘖：一般要去萌3-4次后接穗就会抑制萌蘖的生长。转管：一个月后培养基消耗，将STG苗转至含0.2mg/mlGA₃的MS液体培养基中。STG移栽:待STG苗长出3-4片叶时移栽，移栽前在阳光下炼苗一个星期。常规嫁接采用长方形芽接法进行。

(5)柑橘黄龙病Real-timePCR检测：

DNA提取:提取DNA的方法参考文献田亚南（1996）的CTAB法，张志忠等（2004）的方法进行。用紫外分光光度计检测DNA浓度。根据检测浓度来确定稀释倍数，将稀释后的DNA提取液作为PCR操作的贮备液。根据柑桔黄龙病16SrRNA特异性序列设计引物，并设计看家基因引物(引物：A04F/A04R和COX+/COX-)。

QPCR扩增:利用亚洲韧皮杆菌核糖体蛋白基因的特异性靶序列设计引物(表1)。实时突光定量PCR试剂盒:2XSYBRGreenqPCRMix,购自庄盟国际生物基因科技有限公司。PCR仪(美国Bio-Rad公司)、DYY-5型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)、凝胶成像系统(Segrate公司)、核酸蛋白检测仪(Amersham公司),突光定量PCR仪LightCycler480。每种处理的检测到重复3次。

(6)柑橘衰退病RT-PCR检测：

根据许昌杰等（2004）的方法RNA的提取，用紫外分光光度计检测RNA浓度。衰退病检测所用的通用RT-PCR引物根据CTV的P18基因设计，引物设计见表2。RT-PCR扩增，以所提RNA为模板根据（AMV）Ver.3.0说明书进行反转录，反应混合物根据TaKaRaRNAPCRKit。RT-PCR条件为：所用RT-PCR方法为分步法。PCR循环条件为：94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，31个循环。琼脂糖凝胶电泳:将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，具体步骤是将适量琼脂糖熔于1×TAE缓冲液体中，冷却至50℃倒入电泳槽内，凝固30min；点样：用移液枪取4-10μlPCR产物，加溴酚兰1μl，按顺序加样到点样孔中；100V电压，80mA电流电泳40min；利用凝胶成像系统观察结果。下表2为柑橘衰退病病毒检测所用引物。

表2

试验结果：

(1)处理前接穗带病情况的检测：

处理前，绿橙接穗用实时定量PCR进行HLB带病情况检测样品，分别标记为（标记LC1-LC15），H1-H5为5个田间取得的带病征的对照样品。检测结果(见表3和图2)。结果表明：除LC2样品以外，其他样品都疑似携带柑橘黄龙病。因此，利用带病材料进行接穗的药剂预处理和催芽试验。

表3

+表示检测结果为阳性，疑似携带黄龙病。

以CK-为基准，以看家基因表达量作对照，2^-ΛΛt的值大于1的样品为疑似携带黄龙病的阳性株。

(2)不同处理的萌芽率观察：

表4中的萌芽率为接穗扦插不同批次试验的平均的统计结果。从萌芽的时间进程看，50μM三氯生萌芽率最高，主要在7-12天内萌发，对照次之。统计时发现50℃湿热处理7天内首先萌芽，青霉素处理未能出芽(结果没有列入表中)。在三氯生、四环素处理中，90%以上的芽是在扦插7-12day出现的，长约1cm-1.5cm，芽的质量好，生长健壮，在第12天时还有少部分芽处于萌动状态，只有不到10%的芽会持续到第25天时萌发(图3，因此，配套的分子检测工作是在接穗扦插12天时进行，从而，在90%的芽萌发时，掌握接穗预处理的脱毒效果。这些萌发的芽可以用于进一步的STG操作，在操作时，可以加大叶原基数，如：使用4个叶原基嫁接，提高嫁接的成活率。试验中9种处理方式均能产生一定数量的茎尖供给STG的需要。

表4

图3中，A：茎尖萌发情况(10day)，B：茎尖萌发情况(11day)C：TCL持续处理12天时情况，D：催芽使用的塑料箱，E：扦插第5天幼芽开始突出。

(3)处理后接穗HLB带病情况的检测：

QPCR分子检测显示(见表5不同处理的材料的黄龙病Real-timePCR检测结果)：接穗经过2μMTCL持续处理，5μMTCL持续处理，30μMTCL，50μMTCL，0.75g/l和1.5g/l阿莫西林，0.75g/l四环素处理接穗1h，均能获得不带HLB病原的茎尖材料，且长势健状，如图4所示。

表5

+表示检测结果为阳性，疑似携带黄龙病。

以CK-为基准，以看家基因表达量1作对照，2^-ΛΛt的值大于1的样品为疑似携带黄龙病的阳性株。

(4)处理前后柑桔衰退病CTV带病情况的比较：

从检测结果可以看出，处理前和处理后，CTV的检测结果存在着十分明显的差异。处理前检测的15个样品结果均为阳性带病材料。处理后，清水对照处理,有微弱的带，说明抽生幼嫩的茎尖所含的病原浓度可能降低，50℃热蒸汽处理1h，样品也能检测到极微弱的带，茎尖病原浓度降低，50μMTCL处理枝条1h，检测结果呈阴性，30μMTCL处理枝条1h，检测结果呈阴性，5μMTCL持续处理枝条，检测结果阳性，2μMTCL持续处理枝条,检测结果阳性，对CTV的作用效果不明显，这是由于TCL是一种有效的小分子抑菌剂，浓度高时，也可以对病毒产生一定干扰，当处理浓度太低时，它对病毒的作用不如对细菌的抑制作用具有针对性。同时，这个结果也说明即使是抽生幼嫩的茎尖有运输能力，病原浓度也可能不会降低。如图5C中的9：阿莫西宁0.75g/L处理枝条1h，有微弱的带，10：阿莫西宁1.5g/L处理枝条1h，有微弱的带，即病原浓度降低，但没有彻底根除。说明阿莫西宁对降低病原浓度有一定的效果，四环素0.75g/L处理枝条1h，检测结果呈阴性,四环素1.5g/L处理枝条1h，检测结果呈阴性。因此，30μM和50μMTCL处理枝条1h，0.75g/L和1.5g/L四环素处理枝条1h，对CTV的控制是有明显的效果的，如图5所示：(a)处理前，正对照，感染CTV强株系，-：负对照，健康的愈伤组织材料，1-15为处理前样品检测结果均为阳性带病。(b)处理前，+：感染CTV强株系的正对照，-：负对照，健康的愈伤组织材料，LC01-LC05表示的是处理前绿橙枝条的检测结果,H1-H5表示的是田间叶样阳性对照。(c)处理后，+：感染CTV强株系的正对照，-：负对照，健康的愈伤组织材料，图5C中，3：清水处理对照,有微弱的带，4：50℃处理1h，有微弱的带，5：50μMTCL处理枝条1h，检测结果阴性，6：30μMTCL处理枝条1h，检测结果阴性，7：5μMTCL持续处理枝条，检测结果阳性，8：2μMTCL持续处理枝条,检测结果阳性，9：阿莫西宁0.75g/L处理枝条1h，有微弱的带，10：阿莫西宁1.5g/L处理枝条1h，有微弱的带，11：四环素0.75g/L处理枝条1h，检测结果阴性,12：四环素1.5g/L处理枝条1h，检测结果阴性。

综合接穗处理前后HLB和CTV的检测结果，可以看出：30μM和50μM的TCL处理枝条1h，0.75g/L和1.5g/L四环素处理枝条1h，对于去除HLB和CTV的病原是有效的，0.75g/L的四环素处理可以有效去除HLB病原，并使CTV的病原浓度明显下降。因此，当经过分子检测后，确认柑桔材料仅仅受到HLB感染时，采用2μMTCL持续处理，5μMTCL持续处理，30μMTCL，50μMTCL，阿莫西林0.75g/l，阿莫西林1.5g/l和四环素0.75g/l分别处理1小时，对于后期的嫁接繁殖，获得健康苗木是有效的。确认柑桔材料同时受到HLB和CTV感染时，采用30μM的TCL-50μM的TCL分别处理枝条1h，0.75g/L和1.5g/L四环素处理枝条1h，这几种处理方法对于去除HLB和CTV复合感染病原是有效的。

本研究通过接穗预处理脱毒和预处理和催芽处理及分子检测，得到柑桔接穗预处理促使复合感染病原脱除的技术程序。当经过QPCR分子检测，确认柑桔材料仅仅受到柑桔黄龙病(HLB)感染时，接穗材料通过(A)2-5μMTCL持续处理，(B)30-50μM的TCL浸泡1小时，(C)0.75g/l-1.5g/l的阿莫西林浸泡1小时，(D)0.75g/l的四环素浸泡1小时，可以获得不带病原的健康材料，当确认柑桔材料同时受到柑桔黄龙病(HLB)和柑桔衰退病(CTV)感染时，采用(B)30μM-50μM的TCL浸泡1小时，(D)0.75g/L四环素浸泡接穗1小时，分子检测表明，这两种处理方法可以去除HLB和CTV复合感染病原，检测结果表现阴性。试验证明，供试材料具有11%-25.9%的发芽能力，在处理后第7-12天内，接穗萌芽快且茎尖表现良好的健康状态，在第25天时，仍有约10%健状的芽萌发。上述预处理和催芽处理获得的茎尖材料可以打破季节的限制，供茎尖微嫁接繁育无病毒苗木之用。

本发明技术能在解决微芽嫁接接穗来源、脱除复合病原方面发挥重要作用。无毒材料或病原浓度低的材料对后续的嫁接脱毒工作带来很大的便利，病原在预处理阶段被去除或浓度降低，意味着，可以采用适当大小的茎尖进行微芽嫁接，增大叶原基数，提高试管苗成活率，提高脱除柑桔两种复合感染病原的效果。此外，利用分子手段快速检测之后，不含病原的阴性接穗，可以不进行催芽处理，直接用常规嫁接的方法快速繁殖健康苗木。

Claims

1.柑桔接穗预处理促使复合感染病原脱除的方法，其特征在于按照以下步骤进行：

步骤2：对表面消毒后的柑桔枝条接穗进行分子检测；

方法一：接穗扦插于含有2-5μMTCL溶液和1/4MS培养基的高压灭菌的蛭石中，用保鲜膜封住，放置在培养室中，催芽12天后获得无病毒芽，完成柑桔接穗预处理脱毒的步骤，茎尖材料用于后续的茎尖嫁接或嫩芽嫁接繁殖；

步骤4：当检测过的柑桔枝条同时受到HLB和CTV感染时，对接穗材料进行如下药剂脱毒处理：将枝条浸泡于含有30-50μM的TCL溶液中处理1h或者将枝条浸泡于0.75g/L的四环素溶液中处理1h，然后，扦插于经过高压灭菌的蛭石中，蛭石中含有1/4MS培养基，扦插时用保鲜膜封住，放置在培养室中，催芽12天后获得无病毒芽，完成柑桔接穗预处理脱毒的步骤。

2.按照权利要求1所述柑桔接穗预处理促使复合感染病原脱除的方法，其特征在于：所述步骤1中消毒采用2％的次氯酸钠(NaClO)水溶液对枝条表面消毒5min。

3.按照权利要求1所述柑桔接穗预处理促使复合感染病原脱除的方法，其特征在于：所述步骤3和所述步骤4中，培养室设定温度28℃、光照2000lx、光照时间14h/d。