CN106034894A - 一种两步法保育黄龙病染病柑橘种质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种两步法保育黄龙病染病柑橘种质的方法，取种子浸入70%酒精1分钟，用5%NaOH浸泡5分钟除去果胶，然后浸入3%次氯酸钠溶液20分钟，无菌水清洗2‑3次，接着在常温水中浸泡5‑10小时，随后用50‑55度的湿热空气进行热处理40‑60分钟，然后除去种皮，播种于加入恩诺沙星钠与磺胺间二甲氧嘧啶钠抗生素的MS培养基中，种苗长至5cm高后移载至灭菌营养土中培育，采取苗木生发的新稍作为接穗，嫁接在经过同样处理的砧木种子所生发的砧木实生苗上。本发明首次筛选了恩诺沙星钠与磺胺间二甲氧嘧啶钠的杀菌剂组合物进行合理混配；首次采用了热处理‑加杀菌剂两步法对黄龙病染病柑橘种质进行脱毒，脱毒效果更好。

Description

一种两步法保育黄龙病染病柑橘种质的方法
技术领域
本发明涉及一种两步法保育黄龙病染病柑橘种质的方法，属于病害防控技术领域。
背景技术
柑橘黄龙病是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害。柑橘染病后造成：经济寿命急剧缩短、产量大幅降低、果实品质低劣、经济损失巨大。近年来，柑橘黄龙病的传播范围越来越广，危害程度不断加剧，现已广泛分布于亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的 50 多个国家和地区，上亿株柑橘被摧毁。该病也已在我国广东、广西、福建、海南和台湾的柑橘产区广泛蔓延, 并在浙江、贵州、湖南相继发生, 我国有柑橘栽培的19个省、区已有11个遭受危害,受害面积占柑橘总栽培面积的80%以上, 产量占总产量的85%左右，每年经济损失高达数十亿美元。
由于柑橘及其近缘植物对该病均不抗病，一旦发病，柑橘会在3-5年内快速衰退，并很快死亡，因此该病在我国大范围流行还造成了很多优良的地方品种或优异育种材料的数量急剧下降，濒临灭绝，而且在不断增多的国内外柑橘品种引进和交流过程中也发现，很多柑橘种质资源虽然有很好的农艺性状，但一些已感染了黄龙病，难以直接利用，所以急需发展可快速脱毒并保育受黄龙病侵染的优良柑橘种质资源的方法。
单独用加热方法处理柑橘种质有一定的脱毒作用，但在实际操作中，受柑橘品种、组织结构及病原菌含量多寡等因素的影响，其脱毒效果并不稳定，经常会有一些样品不能完全脱去病菌，为确保更好的杀菌效果，往往需要大大延长热处理的时间，但这样会加重植物材料的损伤，可能影响材料的农艺性状。因此该方法还需要进一步优化改进。已有研究发现柑桔黄龙病病原为一种革兰氏阴性细菌Candidatus Liberibacter asiaticus，因此积极筛选抗生素进行辅助脱毒处理是一种积极可行的方法。
恩诺沙星钠是一种低毒、高效、广谱杀菌剂，为环丙沙星的乙基化合物，能与细菌DNA回旋酶亚基A结合，从而抑制了酶的切割与连接功能，阻止了细菌DNA的复制，而呈现抗菌作用。磺胺间二甲氧嘧啶钠杀菌剂，性质稳定、使用简便、对革兰氏阴性菌有较强抑制作用，其可竞争性阻碍细菌合成二氢叶酸，最终影响核酸、蛋白质合成，从而抑制细菌的生长繁殖。申报人发现此二种杀菌剂都可以很好的抑制黄龙病菌增殖。
前人有报道使用四环素抗生素对染病柑橘接穗进行脱毒的报道，但长期单一使用四环素抗生素会使黄龙病菌很快产生抗药性，从而大大减弱杀菌效果。本发明首次筛选出了恩诺沙星钠和磺胺间二甲氧嘧啶钠两种不同杀菌机制的杀菌剂混配使用，可大大减少黄龙病菌产生抗药性的几率，对黄龙病菌的脱毒极为关键。
本发明首次筛选了恩诺沙星钠与磺胺间二甲氧嘧啶钠的杀菌剂的组合物进行合理的混配用于杀灭黄龙病菌，可大大减少病原菌产生抗药性的几率，对黄龙病菌的脱毒极为关键；首次采用了热处理-杀菌剂两步法对黄龙病染病柑橘种质进行脱毒，脱去携菌种质中的黄龙病菌的效果更佳，对植物材料的损伤更小，不破坏原有柑橘种质的优异农艺性状。总之，本方法具备高效、低毒、安全、经济、多功能的特性。 经检索，目前未见有使用恩诺沙星钠与磺胺间二甲氧嘧啶钠的杀菌剂的组合物及热处理-杀菌剂两步法来保育因黄龙病的严重危害而濒临灭绝的优良柑橘种质。
发明内容
本发明首次筛选了恩诺沙星钠与磺胺间二甲氧嘧啶钠的杀菌剂并进行合理的混配用于杀灭黄龙病菌，还采用了热处理-杀菌剂两步法对黄龙病染病柑橘种质进行脱毒，可大大减少病原菌产生抗药性的几率，脱去携菌种质中的黄龙病菌的效果更佳，对植物材料的损伤更小，不破坏原有柑橘种质的优异农艺性状。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种两步法保育黄龙病染病柑橘种质的方法，其特征在于：所述方法包括如下：
1. 预处理：在黄龙病染病柑橘母树上采集柑橘的种子，浸入体积分数为70%的酒精1分钟，再用5wt.%NaOH浸泡5分钟除去果胶，然后浸入3wt%的次氯酸钠溶液20分钟，无菌水清洗2-3次；
2. 接着在无菌常温水中浸泡5-10小时，随后用湿度>95%、温度为50-55度的湿热空气进行热处理40-60分钟，然后除去种皮；
3. 将种子播种于加入0.2-0.6g/L恩诺沙星钠与0.1-0.4g/L磺胺间二甲氧嘧啶钠抗生素的MS培养基中，种苗长至5cm高后移载至灭菌营养土中培育，采取苗木生发的新稍作为接穗；
4. 为防止砧木中潜伏有黄龙病，因此在外观健壮的砧木母树上采集种子后，仍然按照上述步骤（1）-（3）同样的处理方法，获得砧木实生苗。具体为：采集健壮砧木的种子，用同样的方法处理: 首先用5wt.%NaOH浸泡5分钟除去果胶，浸入70%酒精1分钟，然后浸入5wt.%的次氯酸钠溶液20分钟，无菌水清洗2-3次，接着在无菌常温水中浸泡5-10小时，随后用湿度>95%，温度为50-55度的湿热空气进行热处理40-60分钟，然后除去种皮，种子播种于含有恩诺沙星钠与磺胺间二甲氧嘧啶钠的MS培养基中，种苗长至5cm后移载至营养土中培育。
5. 待砧木实生苗长高至30-40cm后，即把步骤（3）中获得的新梢接穗嫁接在砧木实生苗上，分别在嫁接苗成活后12个月、24个月和36个月采集样品，进行检测黄龙病菌含量。
含有恩诺沙星钠与磺胺间二甲氧嘧啶钠的MS培养基的成分如下：每1000ml MS培养基加入以下成分：恩诺沙星钠0.2-0.6克；磺胺间二甲氧嘧啶钠，0.1-0.4克；增效剂：二甲氧苄啶钠0.02-0.1克；新型助渗剂：氮酮，1-5 mL；分散剂：木质素磺酸钠，1-2克。
其制备方法如下：将适量恩诺沙星钠、磺胺间二甲氧嘧啶钠、增效剂、分散剂一起加入到锥型混合机中混合2-6小时，将混合后的物料加入到气流粉碎机中粉碎后，再加入到锥型混合机中混合2小时，使用60目的标准筛进行筛分后，加入去离子水充分搅拌溶解，然后加入助渗剂并充分搅拌溶解并过滤除菌，随后加入50-60度的溶解状态的无菌MS培养基，并搅拌均匀，最后使培养基凝固，即作为柑橘种子培养基。
本发明的优点在于：
1）能彻底清除染病的柑橘优良种质中的黄龙病病原菌。
不同杀菌机制的杀菌剂组合物可大大降低黄龙病菌产生抗药性的风险。
采用了热处理-杀菌剂两步法处理柑橘病树种质，脱去携菌柑橘种质中的黄龙病菌的效果更佳，对植物材料的损伤更小，不破坏原有柑橘种质的优异农艺性状。具备高效、低毒、安全、经济、多功能的特性。
能快速保护和培育因染病而濒临灭绝的稀有、优良的柑橘种质资源。
能定量、准确评价感病柑橘种质资源的恢复和保育效果。
具体实施方式
实施例1
首先测定染病母树的黄龙病菌含量，标记为0月的数据。
然后对其进行脱毒，所有步骤均在100目无虫网室内进行，具体步骤如下：取母树种子浸入70%酒精1分钟，用5 wt.%NaOH浸泡5分钟除去果胶，然后浸入3wt.%次氯酸钠溶液20分钟，无菌水清洗2次，接着在常温水中浸泡5小时，随后用湿度>95%、温度为50度的湿热空气进行热处理40分钟，然后除去种皮，播种于含有0.2g/L恩诺沙星钠、0.1g/L磺胺间二甲氧嘧啶钠、二甲氧苄啶钠0.02克、氮酮1mL、木质素磺酸钠1克的MS培养基中，种苗长至5cm高后移载至灭菌营养土中培育，采取苗木生发的新稍作为接穗，嫁接在经过同样处理的砧木种子所生发的砧木实生苗上，具体方法如下：采集健壮砧木的种子，用同样的方法处理: 首先用5 wt.%NaOH浸泡5分钟除去果胶，浸入70%酒精1分钟，然后浸入5 wt.%的次氯酸钠溶液20分钟，无菌水清洗2次，接着在无菌常温水中浸泡5小时，随后用湿度>95%，温度为50度的湿热空气进行热处理40钟，然后除去种皮，种子播种于含有0.2g/L恩诺沙星钠、0.1g/L磺胺间二甲氧嘧啶钠、二甲氧苄啶钠0.02克、氮酮1mL、木质素磺酸钠1克的MS培养基中，种苗长至5cm后移载至营养土中培育。砧木长高至30cm后，即可把母本新梢接穗嫁接在砧木上。对照直接在母树长势良好的枝条上采集接穗，嫁接在长势较好的砧木上。分别在嫁接苗成活后12个月、24个月和36个月采集样品，随机在10个接穗东西南北四个方位取叶片4片，检测其黄龙病菌Ct值及菌含量的变动情况。
实时荧光定量PCR实验参照文献Wenbin Li et al., 2006。20μL的反应体系，引物终浓度250 nM，探针终浓度150 nM，缓冲液参照takara探针法实时荧光定量PCR试剂盒说明书。PCR反应程序：95℃预变性20s，然后95℃ 5 s，58℃ 40 s，40个循环。实验结束后，记录荧光定量PCR反应的Ct值。
表1柑橘样品中黄龙病菌Ct值随时间的变化
*：同一行的两组数据间具有差异显著 （T-test）；-：未检测到黄龙病菌。
表2柑橘样品中黄龙病菌浓度*104(病原菌个数/每克柑橘病样)随时间的变化
*：同一行的两组数据间具有差异显著 （T-test）；-：未检测到黄龙病菌。
结果发现：处理组与对照组的黄龙病菌Ct值与黄龙病菌浓度在处理前无显著差异（P>0.05）,而对照组的黄龙病菌浓度在处理12个月、24个月和36个月后持续增加，而处理组中并无检测到任何黄龙病菌， 说明本发明可以完全清除柑橘种质资源中的黄龙病菌,可有效保育黄龙病染病柑橘种质。
实施例2
首先测定染病母树的黄龙病菌含量，标记为0月的数据。
然后对其进行脱毒，所有步骤均在100目无虫网室内进行，具体步骤如下：取母树种子浸入70%酒精1分钟，用5 wt.%NaOH浸泡5分钟除去果胶，然后浸入3 wt.%次氯酸钠溶液20分钟，无菌水清洗3次，接着在常温水中浸泡10小时，随后用湿度>95%、温度为55度的湿热空气进行热处理60分钟，然后除去种皮，播种于含有0.6g/L恩诺沙星钠、0.4g/L磺胺间二甲氧嘧啶钠、二甲氧苄啶钠0.1克、氮酮5 mL、木质素磺酸钠2克的MS培养基中，种苗长至5cm高后移载至灭菌营养土中培育，采取苗木生发的新稍作为接穗，嫁接在经过同样处理的砧木种子所生发的砧木实生苗上，具体如下：采集健壮砧木的种子，用同样的方法处理: 首先用5 wt.%NaOH浸泡5分钟除去果胶，浸入70%酒精1分钟，然后浸入5 wt.%的次氯酸钠溶液20分钟，无菌水清洗3次，接着在无菌常温水中浸泡10小时，随后用湿度>95%，温度为55度的湿热空气进行热处理60分钟，然后除去种皮，种子播种于含有0.6g/L恩诺沙星钠、0.4g/L磺胺间二甲氧嘧啶钠、二甲氧苄啶钠0.1克、氮酮5 mL、木质素磺酸钠2克的MS培养基中，种苗长至5cm后移载至营养土中培育。砧木长高至40cm后，即可把母本新稍接穗嫁接在砧木上。对照直接在母树长势良好的枝条上采集接穗，嫁接在长势较好的砧木上。分别在嫁接苗成活后12个月、24个月和36个月采集样品，随机在10个接穗的东南西北方位取叶片4片，检测其黄龙病菌Ct值及菌含量的变动情况。
实时荧光定量PCR实验参照文献Wenbin Li et al., 2006。20μL的反应体系，引物终浓度250 nM，探针终浓度150 nM，缓冲液参照takara探针法实时荧光定量PCR试剂盒说明书。PCR反应程序：95℃预变性20s，然后95℃ 5 s，58℃ 40 s，40个循环。实验结束后，记录荧光定量PCR反应的Ct值。
表3柑橘样品中黄龙病菌Ct值随时间的变化
*：同一行的两组数据具有差异显著 （T-test）；-：未检测到黄龙病菌。
表4柑橘样品中黄龙病菌浓度*104(病原菌个数/每克柑橘病样)随时间的变化
*：同一行的两组数据具有差异显著 （T-test）；-：未检测到黄龙病菌。
结果发现：处理组与对照组的黄龙病菌Ct值与黄龙病菌浓度在处理前无显著差异（P>0.05）,而对照组的黄龙病菌浓度在处理12个月、24个月和36个月后持续增加，而处理组中并无检测到任何黄龙病菌， 说明本发明可以完全清除柑橘种质资源中的黄龙病菌,可有效保育黄龙病染病柑橘种质。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种两步法保育黄龙病染病柑橘种质的方法，其特征在于：所述方法包括如下：
（1）预处理：在黄龙病染病柑橘母树上采集柑橘的种子，浸入70%酒精1分钟，再用5wt.%NaOH浸泡5分钟除去果胶，然后浸入3wt.%的次氯酸钠溶液20分钟，无菌水清洗2-3次；
（2）接着在无菌常温水中浸泡5-10小时，随后用湿度>95%、温度为50-55度的湿热空气进行热处理40-60分钟，然后除去种皮；
（3）将种子播种于加入含有恩诺沙星钠与磺胺间二甲氧嘧啶钠抗生素的MS培养基中，种苗长至5cm高后移载至灭菌营养土中培育，采取苗木生发的新稍作为接穗；
（4）为防止砧木中潜伏有黄龙病，因此在外观健壮的砧木母树上采集种子后，仍然按照上述步骤（1）-（3）同样的处理方法，获得砧木实生苗；
（5）待砧木实生苗长高至30-40cm后，即把步骤（3）中获得的新梢接穗嫁接在砧木实生苗上，分别在嫁接苗成活后12个月、24个月和36个月采集样品，进行检测黄龙病菌含量。
2.根据权利要求1所述的一种两步法保育黄龙病染病柑橘种质的方法，其特征在于：所述的含有恩诺沙星钠与磺胺间二甲氧嘧啶钠的MS培养基的成分如下：每1000ml MS培养基加入以下成分：恩诺沙星钠0.2-0.6克；磺胺间二甲氧嘧啶钠0.1-0.4克；增效剂：二甲氧苄啶钠0.02-0.1克；新型助渗剂：氮酮，1-5 mL；分散剂：木质素磺酸钠，1-2克。
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