CN103891531A - 一种保育感染黄龙病柑橘种质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种保育感染黄龙病的柑橘种质的方法，包括砧木的培育与热处理、接穗的采集和药物处理、嫁接、管理和检测。本发明对砧木幼苗进行热处理，培育无黄龙病砧木、对感染黄龙病但还有生活力的柑橘枝条进行药物处理，取接穗于药物处理后的柑橘枝条，嫁接于无黄龙病的砧木上。经嫁接苗成活后4个月、8个月和12个月采集样品，并进行PCR检测和发病情况调查，结果表明，本发明能彻底清除柑橘优良种质或品种感病接穗的黄龙病病原菌，直观、准确评价感病种质资源的恢复和保育效果，快速保护和培育柑橘种质资源。

Description

一种保育感染黄龙病柑橘种质的方法

技术领域

本发明涉及一种保育感染病害的果树种质的方法，特别是一种保育感染黄龙病的柑橘种质的方法，属农业科学领域。

背景技术

柑桔黄龙病是一种由韧皮部杆菌（Ca.Liberibacter）引起的毁灭性、传染性和检疫性的重大病害，俗称柑桔的“癌症”，分布极其广泛。亚洲、非洲、南美洲等40多个国家和地区均有发生和流行，主要通过柑桔木虱转移吸食、带病苗木和接穗等材料传播。通常新树感病后1～2年内即死亡，老树感病后3～5年内死亡或丧失结果能力，严重时可造成毁园。如柑橘黄龙病2005年在美国佛罗里达首次发现，在短短的5年时间里，已经扩散到全部34个柑橘产生产县，造成高达46亿美元的经济损失；同样，在我国广西，根据广西全区各地黄龙病普查的情况看，定植3～4年后，大部分果园的发病率都超过5%，所以广西每年因该病危害造成的直接经济损失至少达8.05～9.62亿元。柑橘黄龙病的猖獗危害和蔓延扩散，对柑橘产业的稳定和发展造成了严重威胁，已经成为柑橘产业发展的重大障碍。

由于柑橘及其近缘属植物都没有发现抗病资源和抗病基因，目前生产上主要采用控制木虱传播、砍除带病植株、减少病原菌量、种植无毒种苗等措施以减少或推迟黄龙病的爆发。由于黄龙病病原菌在柑橘体内的潜伏期长、缺乏有效药物防治，一旦发病，最终的结果就是死亡，造成很多地方优良品种或优异的育种材料和种质资源濒临灭绝。

经检索，目前，未见有快速保育因黄龙病的严重危害而濒临灭绝的柑橘优异种质资源或品种方法的相关文献报道。本领域技术人员长期渴望找到一种能快速、有效地恢复并保育因受黄龙病影响而濒临死亡柑橘种质资源或品种的方法，用于防治柑橘黄龙病和选育柑橘新品种等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种保育感染黄龙病的柑橘种质的方法，能快速、有效地恢复并保育因感染黄龙病而濒临灭绝的柑橘种质资源或品种。

为实现上述目的，本发明采用以下方法和步骤。

本发明的保育感染黄龙病的柑橘种质资源的方法，其特征在于步骤如下：

（1）砧木的培育与热处理：选择健康砧木母本树，采摘成熟的果实，经播种、幼苗管护，培育砧木幼苗；砧木幼苗在人工气候室中进行热处理，每天35～45℃处理5～15小时，持续5～10天，保育在防虫温室中；2～8个星期后，经PCR检测，选择没有检测到黄龙病病原菌的砧木幼苗，备用；

（2）接穗的采集和药物处理：采集感染黄龙病但还有生活力的柑橘枝条，每枝带有1～5张叶片，置于药物中处理5～15小时，保持通风、光照，温度控制在20～32℃、相对湿度控制在50～90%；

（3）嫁接、管理和检测：取步骤（2）的接穗，嫁接在步骤（1）的砧木幼苗上，分别在嫁接苗成活后4个月、8个月和12个月采集样品，进行PCR检测和发病情况调查。

其中步骤（1）所述砧木幼苗热处理为每天45℃处理10个小时，持续5天。

其中步骤（2）所述的药物为抗生素或抗菌剂或生物杀菌剂或抗菌多肽及其组合，使用浓度为10～1000mg/L。

本发明的有益效果是：

1、能彻底清除柑橘优良种质或品种感病接穗的黄龙病病原菌。

2、能直观、准确评价感病种质资源的恢复和保育效果。

3、能快速保护和培育柑橘种质资源。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

（1）柑橘砧木的热处理：将感病和健康的柑橘砧木幼苗，置于人工气候室中进行热处理，每天45℃处理10个小时，然后保持35℃恢复14小时，持续5天，然后将处理的砧木幼苗保育在防虫温室中，3个星期后，处理的砧木幼苗恢复生长，分别在热处理之后的4个月和8个月后，利用定量PCR技术检测砧木幼苗黄龙病的病原菌数量和热处理的效果。其中①病原菌DNA的提取：用Qiagen的植物DNA提取试剂盒提取（DNeasyPlant Mini Kit,Cat.69106,Qiagen,MO,USA）。将砧木幼苗叶片，撕取中脉，将约200mg中脉装入2.0ml离心管，加入AP1缓冲液和RNAase后，用匀浆机（Fast Prep24）打碎，然后在65℃下温育20min，期间反复颠倒试管2～3次；加入AP2缓冲液置于冰浴中20min，然后在10,000×g下离心5min，加入1.5倍体积的AP3/E缓冲液，反复振荡数次，转入微滤柱，10,000×g离心1min；用AW缓冲液清洗两次之后再空柱离心彻底甩干，最后向柱中加入50μl AE缓冲液洗脱，8,000×g离心1min洗脱植物总DNA，所得用于PCR检测；②病原菌的实时定量PCR检测：利用亚洲韧皮杆菌核糖体蛋白基因16s核糖体DNA的特异性靶序列按照Primer Express软件（ABI，USA）设计的探针和引物的组合（参考Li等2006的方法）：HLBas（5‘-GTCGAGCGCGTATGCAA TACG-3’）、HLBr（5‘-CTACCTTTTTCTACGGGATAACGC-3’）、HLBp（5‘-AGACGGGTGAGTAACGCG-3’），由上海生物工程公司合成引物，TaqMan荧光探针5′端、3′端分别用FAM报导荧光染料和TRAMA淬灭荧光染料标记，铝膜袋闭光保存于-20℃备用。采用20μl反应体系，含有终浓度1×TaqMan qPCR Mix(Applied Biosystems)、300nM(each)引物(HLBas and HLBr),150nM探针(HLBp)以及适量模板。PCR反应程序：在ABI PRISM7500(Applied Biosystems,Foster City,CA)荧光定量PCR仪上进行，预扩增95℃，1min；然后95℃，3s，60℃，30s，40个循环；末次延伸72℃，7min；在每个循环的延伸阶段（60℃）同步多次采集荧光，结果如表1所示。

从表1结果可以明显看出，上述的热处理可以明显清除砧木幼苗的黄龙病病原菌，使嫁接的砧木100%无菌。

表1：砧木热处理的效果

（2）将经筛选的有效药物处理严重感病但还有生活力的的柑橘接穗枝条12小时，进行嫁接和管理；分别在嫁接成活后4个月、8个月和12个月采集样品，进行PCR检测，观察不同药物处理的柑橘接穗枝条上长出新叶的黄龙病病原菌含量和发病情况，结果如表2所示。

从表2结果可以看出，没有任何药物处理（0，水对照），柑橘嫁接苗的细菌含量持续增加，药物处理后，接穗上长出的新枝条没有检测到细菌。说明本发明可以完全清除柑橘种质资源或品种所感染的黄龙病病原菌，促进其生长恢复。

表2：不同药物处理接穗后再生枝条叶片的黄龙病病原菌含量

Claims (4)

1.一种保育感染黄龙病的柑橘种质资源的方法，其特征在于步骤如下：

（1）砧木的培育与热处理：选择健康砧木母本树，采摘成熟的果实，经播种、幼苗管护，培育砧木幼苗；砧木幼苗在人工气候室中进行热处理，每天35～45℃处理5～15小时，持续5～10天，，保育在防虫温室中；2～8个星期后，经PCR检测，取没有检测到黄龙病病原菌的砧木幼苗，备用；

（2）接穗的采集和药物处理：采集感染黄龙病但还有生活力的柑橘枝条，每枝带有1～5张叶片，置于药物中处理5～15小时，保持通风、光照，温度控制在20～32℃、相对湿度控制在50～90%；

（3）嫁接、管理和检测：取步骤（2）的接穗，嫁接在步骤（1）的砧木幼苗上，分别在嫁接苗成活后4个月、8个月和12个月采集样品，进行PCR检测和发病情况调查。

2.根据权利要求1所述的一种保育感染黄龙病的柑橘种质资源的方法，其特征在于所述药物为抗生素或抗菌剂或生物杀菌剂或抗菌多肽及其组合。

3.根据权利要求1或2所述的一种保育感染黄龙病的柑橘种质资源的方法，其特征在于所述药物的使用浓度为10～1000mg/L。

4.根据权利要求1所述的一种保育感染黄龙病的柑橘种质资源的方法，其特征在于所述砧木幼苗热处理为每天45℃处理10个小时，持续5天。