CN103798012B - 利用长春花筛选抗韧皮部杆菌药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用长春花筛选抗韧皮部杆菌药物的方法，包括长春花感病植株的培育、长春花的扦插再生、长春花扦插再生条件的优化、药物处理和抗韧皮部杆菌药物的筛选。本发明以植物韧皮部杆菌的天然寄主长春花为筛选抗韧皮部杆菌药物的试材，筛选方法快速、操作简便，能直观、准确评价待筛选药物抗韧皮部杆菌的效果。
Description
技术领域
本发明涉及筛选抗菌药物的方法，具体涉及一种利用长春花筛选抗韧皮部杆菌药物的方法，属植保技术领域。
背景技术
韧皮部杆菌（Ca.Liberibacter）是一种引起柑橘黄龙病、马铃薯斑马片病等严重病害的病菌，对世界柑橘、马铃薯等生产造成巨大的损失。如柑橘黄龙病2005年在美国佛罗里州首次发现，在短短的5年时间里，已经扩散到全部34个柑橘产生产县，造成高达46亿美元的经济损失；同样地，马铃薯斑马片病是20世纪90年代中期在南美洲首次发现的新病害，近年该病害在美国、墨西哥及新西兰等地扩散为害，对当地马铃薯生产构成严重威胁。这类菌至今还未能获得纯化培养，因此其科赫氏假说（Koch’s postulates）还未得到验证，也无法通过离体培养进行药物筛选，严重制约了该菌和相关病害的防治。
长春花是韧皮部杆菌的天然寄主，病原菌在长春花体内繁殖速度很快，而且感病后症状明显，是一种理想的筛选抗韧皮部杆菌药物的植物材料。健康的长春花生长快，扦插成活率高，对外界条件要求很低，但当长春花感染韧皮部杆菌后，由于病原菌的快速繁殖造成韧皮部的严重损伤，很难扦插成活。因此，如果通过在培养基中添加外源生长调节剂以及控制培养条件，促进带菌发病的长春花枝条扦插后能够保持正常的发根和生长，这样就能通过发病的长春花扦插再生和病原菌的增殖情况进行抗韧皮部杆菌的药物筛选和评价。
经检索，目前，未见有抗韧皮部杆菌药物筛选方法的相关文献报道。本领域技术人员长期希望找到一种能快速、准确、操作简便地用于筛选及评价抗韧皮部杆菌药物的方法，用于防治柑橘黄龙病、马铃薯斑马片病等病害。
发明内容
本发明目的是提供一种利用长春花筛选抗韧皮部杆菌药物的方法，能快速、准确、操作简便地用于筛选及评价抗韧皮部杆菌药物。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明利用长春花筛选抗韧皮部杆菌药物的方法，其特征在于如下步骤：
（1）长春花感病植株的培育：通过菟丝子的吸器与寄主植物维管束相连接，将感染柑橘黄龙病植株的韧皮部杆菌病原菌传到种子培育的长春花，1～6个月后，长春花叶片出现感染韧皮部杆菌的症状，经PCR检测，确定长春花植株感病，保育在防虫温室中。
（2）长春花的扦插再生：在采集长春花感病枝条前1～12个小时，完全浇灌植株，采集1～10cm至少包含两张叶片的带菌枝条，在枝条的基部用促根剂和植物生长调节剂蘸浸，种植在栽培基质中，置于10～35℃的遮阴、防虫控温温室中，保持空气相对湿度60～95%；其特征在于所述栽培基质为蛭石、或砂、或蛭石和砂、或蛭石和有机土的混合基质，其配比一般为蛭石和砂各50%，或蛭石和有机土各50%。所述的植物生长调节剂一般为NAA或/和IBA，二种植物生长调节剂的浓度各为2～16μg/ml；蘸浸时间一般为1-8个小时；
（3）长春花扦插再生条件的优化：调整培养基基质组成、喷施植物生长调节剂、促根剂和营养液；
（4）药物处理：取待筛选的药物，0.1～1000mg/L浸泡处理严重感病的长春花枝条1～12小时，进行扦插、管理，扦插后1～4周，用相同的药物再处理1～3次；所述待筛选的药物，如抗生素、化学杀菌剂、生物杀菌剂、抗菌多肽等。
（5）抗韧皮部杆菌药物的筛选：2～6个月后，观察不同药物处理的成活再生生物量和检测新生长枝条的韧皮部杆菌的含量，筛选出抗韧皮部杆菌药物。
其中步骤（3）所述调整基质，指将基质调整为有机土和蛭石各50%的混合物；所述的营养液为MS或MT，使用浓度为水和营养液的体积比为1：1。
本发明的有益效果是：
1、能直观、准确评价待筛选药物抗韧皮部杆菌的效果。
2、筛选方法快速、操作简便。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
（1）通过菟丝子的吸器与寄主植物维管束相连接，将感染柑橘黄龙病植株的韧皮部杆菌传到种子培育的长春花，2个月后，长春花叶片出现感染韧皮部杆菌的症状，经PCR检测，确定长春花植株感病，保育在防虫温室中。
PCR检测方法如下：①病原菌DNA的提取：用Qiagen的植物DNA提取试剂盒提取（DNeasy Plant Mini Kit,Cat.69106,Qiagen,MO,USA）。将感病的长春花叶片，撕取中脉，将约200mg中脉装入2.0ml离心管，加入AP1缓冲液和RNAase后,用匀浆机（Fast Prep24）打碎，然后在65℃下温育20min，期间反复颠倒试管2～3次；加入AP2缓冲液置于冰浴中20min，然后在10,000×g下离心5min，加入1.5倍体积的AP3/E缓冲液，反复振荡数次，转入微滤柱，10,000×g离心1min；用AW缓冲液清洗两次之后再空柱离心彻底甩干，最后向柱中加入50μl AE缓冲液洗脱，8,000×g离心1min洗脱植物总DNA，所得用于PCR检测；②病原菌的实时定量PCR检测：采用TaqMan进行，利用亚洲韧皮杆菌核糖体蛋白基因16s核糖体DNA的特异性靶序列按照Primer Express软件（ABI，USA）设计的探针和引物的组合（参考Li等2006的方法）：HLBas（5‘-GTCGAGCGCGTATGCAA TACG-3’）、HLBr（5‘-CTACCTTTTTCTACGGGATAACGC-3’）、HLBp（5‘-AGACGGGTGAGTAACGCG-3’），由上海生物工程公司合成引物，TaqMan荧光探针5′端、3′端分别用FAM报导荧光染料和TRAMA淬灭荧光染料标记，铝膜袋闭光保存于-20℃备用。采用20μl反应体系，含有终浓度1×TaqMan qPCR Mix(Applied Biosystems)、300nM(each)引物(HLBas and HLBr),150nM探针(HLBp)以及适量模板。PCR反应程序：在ABI PRISM7500(Applied Biosystems,Foster City,CA)荧光定量PCR仪上进行，预扩增95℃，1min；然后95℃，3s，60℃，30s，40个循环；末次延伸72℃，7min；在每个循环的延伸阶段（60℃）同步多次采集荧光。
（2）采集2～4cm至少包含两张叶片的严重感染韧皮部杆菌含菌量的枝条，用5μg/ml的IBA和5μg/ml NAA处理枝条的基部4个小时，然后将处理后的扦插枝条种植在蛭石和砂各50%的培养基质中，置于25℃的遮阴、防虫控温温室中，保持空气相对湿度90%。
（3）以有机土和蛭石的混合物为培养基基质，扦插后，每隔一个星期喷施相同浓度的NAA和IBA一次，共喷施两次；并且配合施用营养液MS或MT。
从表1结果可以明显看出，经过上述优化的再生长春花系统，可以有效促进带病长春花枝条的生长，其再生率高达60%以上，而常规方法无法促进带病长春花枝条的生长，再生率为0.1%。
表1：优化与常规长春花处理感病长春花枝条的再生效果比较
（4）用待筛选的药物氨苄（25和50mg/L）或二溴氮基丙酰胺（100μl/ml和200μl/ml）浸泡处理严重感病的长春花枝条4小时，进行扦插和管理；扦插后7天和14天，用同样浓度的药物再处理一次；2个月后观察不同药物处理的长春花成活再生生物量和新生长枝条的韧皮部杆菌含量。
从表2结果可以看出，没有任何药物处理（0，水对照），长春花植株体内的细菌含量仍最高，药物处理后菌量显著降低，利用定量PCR检测经氨苄处理后的菌量Ct值高于36，基本无法检测到细菌，说明完全清除干净；而二溴氮基丙酰胺处理仍有少量的细菌存在。从再生率和生物量来看，氨苄的处理明显优于对照和二溴氮基丙酰胺。综合说明氨苄的效果优于二溴氮基丙酰胺，氨苄为抗韧皮部杆菌的药物。
表2：不同药物处理的长春花成活再生生物量和新枝条韧皮部杆菌含量表
注：严重感病植株，Ct值低于26；中度感病植株，Ct值在26.1和35.9之间；无症状的健康枝条，Ct值高于36.0。
Claims (5)
1.一种利用长春花筛选抗韧皮部杆菌药物的方法，其特征在于步骤如下：
(1)长春花感病植株的培育：通过菟丝子的吸器与寄主植物维管束相连接，将感染柑橘黄龙病植株的韧皮部杆菌病原菌传到种子培育的长春花，1～6个月后，长春花叶片出现感染韧皮部杆菌的症状，经PCR检测，确定长春花植株感病，保育在防虫温室中；
(2)长春花的扦插再生：在采集长春花感病枝条前1～12个小时，完全浇灌植株，采集1～10cm至少包含两张叶片的带菌枝条，在枝条的基部用促根剂和植物生长调节剂蘸浸，种植在栽培基质中，置于10～35℃的遮阴、防虫控温温室中，保持空气相对湿度60～95％；
(3)长春花扦插再生条件的优化：调整培养基基质组成、喷施植物生长调节剂、促根剂和营养液；
(4)药物处理：取待筛选的药物，0.1～1000mg/L浸泡处理严重感病的长春花枝条1～12小时，进行扦插、管理，扦插后1～4周，用相同的药物再处理1～3次；
(5)抗韧皮部杆菌药物的筛选：2～6个月后，观察不同药物处理的成活再生生物量和检测新生长枝条的韧皮部杆菌的含量，筛选出抗韧皮部杆菌药物。
2.根据权利要求1所述的一种利用长春花筛选抗韧皮部杆菌药物的方法，其特征在于所述栽培基质为蛭石、或砂、或蛭石和砂、或蛭石和有机土的混合基质，其配比为蛭石和砂各50％，或蛭石和有机土各50％。
3.根据权利要求1所述的一种利用长春花筛选抗韧皮部杆菌药物的方法，其特征在于植物生长调节剂为NAA或/和IBA。
4.根据权利要求3所述的一种利用长春花筛选抗韧皮部杆菌药物的方法，其特征在于植物生长调节剂NAA和IBA的使用浓度各为2～16μg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种利用长春花筛选抗韧皮部杆菌药物的方法，其特征在于长春花扦插再生过程中，喷施的营养液为MS或MT。
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