CN104792967A - 一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法 - Google Patents

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马庆旭
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Abstract

一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法，属于生物地球化学技术领域。其包括如下步骤：对采集土壤进行风干和研磨处理，过筛备用；用强盐硫酸钾溶液对土壤进行反复淋洗处理；将淋洗过的土壤置于高压灭菌锅中进行高温高压蒸汽灭菌处理；向灭菌处理过的土壤添加不同浓度的15N标记甘氨酸溶液进行吸附试验，经震荡、离心、过滤后，根据吸附前后溶液中甘氨酸浓度差计算土壤的甘氨酸吸附曲线；根据甘氨酸吸附曲线，选择其吸附饱和点和半饱和点的土壤，在无菌培养室内进行水稻幼苗的培养试验，21天后收获，计算氨基酸态氮的吸收、及氨基酸对水稻的氮营养贡献率。本发明对揭示土壤有机氮的肥力本质及生态系统氮素循环都具有重要作用。

Description

一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法
技术领域
本发明属于生物地球化学技术领域，具体涉及一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法。
背景技术
氮素是生物合成氨基酸、蛋白质及其它含氮有机物的大量营养元素，在植物的生命活动中发挥极其重要的作用。氨基酸作为土壤有机氮的一种重要存在形式，近来逐渐引起人们的重视。土壤中氨基酸分为游离态和吸附，前者浓度很低，仅为1～158 μmol/L；而吸附在土壤固体表面的氨基酸含量远高于游离氨基酸，大约占土壤氨基酸总量的88%～92%。与无机氮相比，虽然氨基酸态氮含量很低，但半衰期短、总流通量大的特点使其理论上可满足植物对氮素营养的需求。已经证实植物能够直接吸收、利用环境介质中各种分子态氨基酸，且多种植物的氨基酸转运基因已经被分离和克隆出来。在一些极地苔原、高山、森林生态系统中，植物对氨基酸态氮的吸收甚至高于无机氮，表明氨基酸态氮有可能作为植物的一种重要营养氮源。
氨基酸作为植物和微生物的优良碳源和氮源，二者对其吸收存在激烈竞争。目前我们对土壤氨基酸对植物氮营养贡献的认识主要是建立在15N同位素示踪和13C/14C示踪技术的基础上，常规水培、土培、离体根培养和田间原位培养是评估土壤氨基酸生物有效性的常见方法。然而，水培培养中植物和微生物对氨基酸的竞争吸收程度较根际土壤中显著降低，且由于缺少土壤对外加氨基酸的物理阻滞，可能会造成植物对氨基酸吸收能力的高估；土培培养主要采用根外注射模拟培养方法，容易导致氨基酸分布不均匀，造成局部的养分“热点”，也可能造成氨基酸对植物的氮营养贡献的高估；离体根培养由于破坏了植物的正常生理机能，不能反映植物的真实吸收情况。当前的分析测试技术也存在一些不容忽视的问题，如氨基酸吸收的长期无菌要求、同位素示踪技术的缺陷等。总之，人们对准确评价氨基酸的生物有效性仍存在很大的争议。随着农业可持续发展热潮的不断高涨，植物的有机营养问题越来越引起人们的高度重视。因此，研究和开发一种测定土壤氨基酸生物有效性的新型方法，对于明确土壤氨基酸对植物的真实氮营养贡献，进一步揭示土壤肥力本质和氮素循环都具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法的技术方案。
所述的一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）对采集土壤进行风干和研磨处理，过20目筛备用；
2）在常温下，用强盐硫酸钾溶液对土壤进行反复淋洗处理，洗脱土壤表面吸附的氨基酸；
3）将淋洗过的土壤置于高压灭菌锅中进行高温高压蒸汽灭菌处理，使土壤中的微生物失活；
4）向灭菌处理过的土壤添加一系列不同浓度的15N标记甘氨酸溶液进行吸附试验，浓度分别为0, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 240, 480, 700, 800, 1000, 1200 mg/L，经震荡、离心、过滤后，根据吸附前后溶液中甘氨酸浓度差计算土壤的甘氨酸吸附曲线；
5）预先培养好无菌幼苗，根据步骤4）中的甘氨酸吸附曲线，选择其吸附饱和点和半饱和点的土壤，在无菌培养室内进行水稻幼苗的培养试验，21天后收获，根据以下公式(1)和公式(2)计算氨基酸态氮的吸收、及氨基酸对水稻的氮营养贡献率：
式(1)中，N u ：水稻幼苗对土壤吸附态氨基酸的吸收，单位：μg/株；
U N : 水稻幼苗全氮含量，单位：μg/株；
A s : 标记处理水稻幼苗15N同位素原子百分超，单位：%；
A c : 未标记处理水稻幼苗15N同位素原子百分超，单位：%；
A a : 甘氨酸培养液中15N同位素原子百分超，单位：%；
式(2)中，N cn ：土壤吸附态甘氨酸对水稻幼苗的氮营养贡献率，单位：%。
 所述的一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法，其特征在于步骤2）中硫酸钾溶液浓度为0.5 mol/L，具体淋洗方法为：称取5克风干土放入50ml 离心管，加入25ml的0.5 mol/L 的硫酸钾溶液，加入2滴氯仿溶液，在150转/min条件下震荡60min，在4000转/min条件下离心10min，过滤，以上淋洗过程重复5次。
 所述的一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法，其特征在于步骤3）中灭菌温度为121℃，灭菌时间30min；灭菌后土壤搅拌均匀，灭菌过程重复3次。
 所述的一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法，其特征在于步骤4）中甘氨酸溶液由无菌水配置，并经0.22μm的微孔滤膜过滤得到。
所述的一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法，其特征在于步骤5）中无菌幼苗具体培养方法为：取水稻种子采用70% 酒精浸1 min-无菌水冲3次-2%次氯酸钠浸5 min-无菌水冲5次- 0.1% 氯化汞浸5 min-无菌水冲6次的组合灭菌程序，种子发芽后，播于含约10ml营养琼脂培养基的培养皿进行菌检，得到无菌幼苗。
上述的一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法，能够克服微生物对土壤氨基酸的分解，准确度高，且能最大程度反映吸附态氨基酸对植物的理论氮营养贡献，其对揭示土壤有机氮的肥力本质及生态系统氮素循环都具有重要作用。
附图说明
图1为本发明的一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法流程图。
图2为本发明实施例中土壤A、B 的吸附曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，但并不因此限制本发明的保护范围。
实施例1：
如1所示，首先，采集浙江省萧山稻田土壤A（海拔10m，30o3' 59.2" N, 120o15' 31.4" E），进行风干和研磨处理后，过20目筛备用；称取5克土壤，加入25 ml 0.5 mol/L 的硫酸钾溶液和2滴氯仿，经震荡(150转/min，60min)，离心(4000转/min，10 min)，过滤弃掉淋洗液，重复此淋洗步骤5次以洗脱土壤表面吸附的氨基酸；淋洗后的土壤在121℃高压灭菌锅中经高温高压蒸汽灭菌30min，为使土壤中的微生物完全失活重复此灭菌步骤3次；
然后，分别向灭菌处理过的土壤添加25ml一系列15N 标记的甘氨酸溶液进行吸附试验(0, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 240, 480, 700, 800, 1000, 1200 mg/L)，该甘氨酸溶液由无菌水配置，并经0.22μm的微孔滤膜过滤达到了无菌效果。经震荡(150转/min，60min)、离心(4000转/min，10 min)、过滤后，根据吸附前后溶液中甘氨酸浓度差计算得到其吸附饱和、吸附半饱和甘氨酸浓度分别为700 mg/L、350 mg/L，相应的甘氨酸吸附量分别为1490 mg/Kg、745 mg/Kg（如图2）；
预先培养好无菌幼苗，选择吸附饱和点和半饱和点的土壤，在无菌培养室内进行水稻幼苗的培养试验。用15ml离心管作为培养容器，每管中含15克上述吸附处理过的土壤。为保证水稻幼苗正常生长，除甘氨酸外，向离心管补充适量的铵态氮和常规不含氮水稻营养液。21天后收获，根据以下公式(1)和公式(2)计算氨基酸态氮的吸收、及氨基酸对水稻的氮营养贡献率：
式(1)中，Nu：水稻幼苗对土壤吸附态氨基酸的吸收，单位：μg/株;
UN: 水稻幼苗全氮含量，单位：μg/株；
As: 标记处理水稻幼苗15N同位素原子百分超，单位：%；
Ac: 未标记处理水稻幼苗15N同位素原子百分超，单位：%；
Aa: 甘氨酸培养液中15N同位素原子百分超，单位：%；
式(2)中，Ncn：土壤吸附态甘氨酸对水稻幼苗的氮营养贡献率，单位：%。
该实施例中无菌幼苗具体培养方法为：取水稻种子采用70% 酒精浸1 min-无菌水冲3次-2%次氯酸钠浸5 min-无菌水冲5次- 0.1% 氯化汞浸5 min-无菌水冲6次的组合灭菌程序，种子发芽后，播于含约10ml营养琼脂培养基的培养皿进行菌检，得到无菌幼苗。含氮营养液采用0.22μm的微孔滤膜过滤，不含氮营养液采用121℃、30min高温高压灭菌。
经过21天的无菌培养后，甘氨酸吸附半饱和处理中UN为5550.7μg/株，Nu 为867.5μg/株，As为8.2%，Ac为0.37%，Aa为50.1%，计算得到氨基酸对水稻幼苗的氮营养贡献率Ncn为15.6%。甘氨酸吸附饱和处理中UN为5745.2μg/株，Nu 为2595.1μg/株，As为23.0%，Ac为0.37%，Aa为50.1%，计算得到氨基酸对水稻幼苗的氮营养贡献率Ncn为45.2%。
实施例2：
首先，采集浙江省仙居县高山稻田土壤B（海拔700m，28o56' 39.6" N, 120o46' 39.6"E），进行风干和研磨处理后，过20目筛备用；称取5克土壤，加入25 ml 0.5 mol/L 的硫酸钾溶液和2滴氯仿，经震荡(150转/min，60min)，离心(4000转/min，10min)，过滤弃掉淋洗液，重复此淋洗步骤5次以洗脱土壤表面吸附的氨基酸；淋洗后的土壤在121℃高压灭菌锅中经高温高压蒸汽灭菌30min，为使土壤中的微生物完全失活重复此灭菌步骤3次；
然后，分别向灭菌处理过的土壤添加一系列15N 标记的甘氨酸溶液进行吸附试验(0, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 240, 480, 700, 800, 1000, 1200 mg/L)，该甘氨酸溶液由无菌水配置，并经0.22μm的微孔滤膜过滤达到了无菌效果。经震荡(150转/min，60min)、离心(4000转/min，10min)、过滤后，根据吸附前后溶液中甘氨酸浓度差计算得到其吸附饱和、半饱和甘氨酸浓度分别为480 mg/L、240 mg/L，相应的甘氨酸吸附量分别为280 mg/Kg、140 mg/Kg（如图2）；
预先培养好无菌幼苗，选择其吸附饱和点和半饱和点土壤，在无菌培养室内进行水稻幼苗的培养试验。用15ml离心管作为培养容器，每管中包含20克上述吸附处理过的土壤。为保证水稻幼苗正常生长，除甘氨酸外，向离心管补充适量的铵态氮和常规不含氮水稻营养液。21天后收获，根据以下公式(1)和公式(2)计算氨基酸态氮的吸收、及氨基酸对水稻的氮营养贡献率：
式(1)中，Nu：水稻幼苗对土壤吸附态氨基酸的吸收，单位：μg /株;
UN: 水稻幼苗全氮含量，单位：μg/株；
As: 标记处理水稻幼苗15N同位素原子百分超，单位：%；
Ac: 未标记处理水稻幼苗15N同位素原子百分超，单位：%；
Aa: 甘氨酸培养液中15N同位素原子百分超，单位：%；
式(2)中，Ncn：土壤吸附态甘氨酸对水稻幼苗的氮营养贡献率，单位：%。
该实施例中无菌幼苗具体培养方法为：取水稻种子采用70% 酒精浸1 min-无菌水冲3次-2%次氯酸钠浸5 min-无菌水冲5次- 0.1% 氯化汞浸5 min-无菌水冲6次的组合灭菌程序，种子发芽后，播于含约10ml营养琼脂培养基的培养皿进行菌检，得到无菌幼苗。含氮营养液采用0.22μm的微孔滤膜过滤，不含氮营养液采用121℃、30min高温高压灭菌。
经过21天的无菌培养后，甘氨酸吸附半饱和处理中UN为3691.6μg/株，Nu 为658.0μg/株，As为9.3%，Ac为0.37%，Aa为50.1%，计算得到氨基酸对水稻幼苗的氮营养贡献率Ncn为17.8%。甘氨酸吸附饱和处理中UN为3822.8μg/株，Nu 为1801.7μg/株，As为24.1%，Ac为0.37%，Aa为50.1%，计算得到氨基酸对水稻幼苗的氮营养贡献率Ncn为47.3%。
应当说明的是，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）对采集土壤进行风干和研磨处理，过20目筛备用；
2）在常温下，用强盐硫酸钾溶液对土壤进行反复淋洗处理，洗脱土壤表面吸附的氨基酸；
3）将淋洗过的土壤置于高压灭菌锅中进行高温高压蒸汽灭菌处理，使土壤中的微生物失活；
4）向灭菌处理过的土壤添加一系列不同浓度的15N标记甘氨酸溶液进行吸附试验，浓度分别为0, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 240, 480, 700, 800, 1000, 1200 mg/L，经震荡、离心、过滤后，根据吸附前后溶液中甘氨酸浓度差计算土壤的甘氨酸吸附曲线；
5）预先培养好无菌幼苗，根据步骤4）中的甘氨酸吸附曲线，选择其吸附饱和点和半饱和点的土壤，在无菌培养室内进行水稻幼苗的培养试验，21天后收获，根据以下公式(1)和公式(2)计算氨基酸态氮的吸收、及氨基酸对水稻的氮营养贡献率：
式(1)中，N u ：水稻幼苗对土壤吸附态氨基酸的吸收，单位：μg/株；
U N : 水稻幼苗全氮含量，单位：μg/株；
A s : 标记处理水稻幼苗15N同位素原子百分超，单位：%；
A c : 未标记处理水稻幼苗15N同位素原子百分超，单位：%；
A a : 甘氨酸培养液中15N同位素原子百分超，单位：%；
式(2)中，N cn ：土壤吸附态甘氨酸对水稻幼苗的氮营养贡献率，单位：%。
2.根据权利要求1所述的一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法，其特征在于步骤2）中硫酸钾溶液浓度为0.5 mol/L，具体淋洗方法为：称取5克风干土放入50ml 离心管，加入25ml的0.5 mol/L 的硫酸钾溶液，加入2滴氯仿溶液，在150转/min条件下震荡60min，在4000转/min条件下离心10min，过滤，以上淋洗过程重复5次。
3.根据权利要求1所述的一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法，其特征在于步骤3）中灭菌温度为121℃，灭菌时间30min；灭菌后土壤搅拌均匀，灭菌过程重复3次。
4.根据权利要求1所述的一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法，其特征在于步骤4）中甘氨酸溶液由无菌水配置，并经0.22μm的微孔滤膜过滤得到。
5.根据权利要求1所述的一种测定土壤吸附态氨基酸对植物氮营养贡献率的方法，其特征在于步骤5）中无菌幼苗具体培养方法为：取水稻种子采用70% 酒精浸1 min-无菌水冲3次-2%次氯酸钠浸5 min-无菌水冲5次- 0.1% 氯化汞浸5 min-无菌水冲6次的组合灭菌程序，种子发芽后，播于含约10ml营养琼脂培养基的培养皿进行菌检，得到无菌幼苗。
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