CN107793209A - 稳定性同位素标记植物的专用培养基、其制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种稳定性同位素标记植物的专用培养基、其制备方法及用途，稳定性同位素标记植物的专用培养基包括以下组分：无机盐、稳定性同位素标记NH4NO3、稳定性同位素标记KNO3、辅助添加剂和水。优点为：本发明不仅改进了旧有方法繁琐步骤和不完全不完整的蛋白质组标记，而且可以实现简易、低成本、快速、高效的植物全蛋白质组标记，为定量内标的制备和高精度地定量蛋白质组研究创造了条件。

Description

稳定性同位素标记植物的专用培养基、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种稳定性同位素标记植物的专用培养基、其制备方法及用途。
背景技术
蛋白质是细胞内基因功能的直接执行者，而且蛋白与蛋白相互关联、共同执行细胞复杂生命活动。细胞内的蛋白表达是非常动态的，个别蛋白的丰度和活动在不同的细胞发展、生长和分裂阶段中，以至于对生物和非生物的反应均不一样。所以，能够量化和比对细胞在不同发展阶段和反应时的蛋白质组的表达水平具有非常高的生物价值。
蛋白质组学是系统鉴定和定量细胞内蛋白质、并研究其功能的新兴学科。植物的蛋白质组学研究，特别是定量蛋白质组学研究可以发现、鉴别基因差异和生物学处理的效应，揭示其分子调控网络和分子机制。但由于技术的限制，现有技术中，主要采用双向凝胶电泳技术分析植物组的蛋白质表达水平，该种方法难于定量分析植物组的蛋白质表达水平，还具有分析过程繁琐、分析成本高、分析速度慢等不足，不利于精确分析植物细胞在不同阶段和反应下所做出的改变，可见，具有较大的使用局限性。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种稳定性同位素标记植物的专用培养基、其制备方法及用途，可以简易、低成本、快速、高效的进行植物全蛋白质组标记，为定量内标的制备和高精度地定量蛋白质组研究创造了条件。
本发明采用的技术方案如下：
本发明第一目的提供一种稳定性同位素标记植物的专用培养基，包括以下组分：无机盐、稳定性同位素标记NH4NO3、稳定性同位素标记KNO3、辅助添加剂和水。
优选的，所述无机盐在所述专用培养基中的终浓度为0.025-400mg/L；
所述稳定性同位素标记NH4NO3在所述专用培养基中的终浓度为500-2500mg/L；
所述稳定性同位素标记KNO3在所述专用培养基中的终浓度为500-2500mg/L。
优选的，所述无机盐为CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、H3BO3、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O中的一种或几种的混合物。
优选的，所述辅助添加剂包括肌醇、淤酸、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺素中的一种或几种的混合物。
优选的，所述CaCl2·2H2O在所述专用培养基中的终浓度为300-500mg/L；
所述MgSO4·7H2O在所述专用培养基中的终浓度为300-500mg/L；
所述KH2PO4在所述专用培养基中的终浓度为100-200mg/L；
所述H3BO3在所述专用培养基中的终浓度为5-10mg/L；
所述CoCl2·6H2O在所述专用培养基中的终浓度为0.01-0.05mg/L；
所述CuSO4·5H2O在所述专用培养基中的终浓度为0.01-0.05mg/L；
所述FeSO4·7H2O在所述专用培养基中的终浓度为20-30mg/L；
所述MnSO4·4H2O在所述专用培养基中的终浓度为20-30mg/L；
所述KI在所述专用培养基中的终浓度为0.5-1mg/L；
所述Na2MoO4·2H2O在所述专用培养基中的终浓度为0.20-0.40mg/L；
所述ZnSO4·7H2O在所述专用培养基中的终浓度为5-10mg/L；
所述Na2EDTA·2H2O在所述专用培养基中的终浓度为35-50mg/L；
所述肌醇在所述专用培养基中的终浓度为100mg/L；
所述淤酸在所述专用培养基中的终浓度为1mg/L；
所述盐酸吡哆醇在所述专用培养基中的终浓度为1mg/L；
所述盐酸硫胺素的在所述专用培养基中的终浓度为10mg/L。
优选的，所述专用培养基的pH值为5.6-5.8；
和/或所述稳定性同位素标记NH4NO3为15NH4 15NO3；
和/或所述稳定性同位素标记KNO3为K15NO3。
本发明第二目的提供一种稳定性同位素标记植物的专用培养基的制备方法，包括以下步骤：
S1，按配方量秤取无机盐、稳定性同位素标记NH4NO3、稳定性同位素标记KNO3、辅助添加剂和水；
S2，将S1秤取到的无机盐、稳定性同位素标记NH4NO3、稳定性同位素标记KNO3和辅助添加剂均加入到S1秤取到的水中，搅拌混合至固体完全溶解，即得到所述专用培养基。
本发明第三目的提供一种一种稳定性同位素标记植物的专用培养基的用途，所述专用培养基用于稳定性同位素标记植物蛋白质组。
优选的，将植物在所述专用培养基中培养，得到稳定性同位素标记植物蛋白质组。
优选的，所述培养的方式为室温25℃培养1代，培养时间为100-500小时。
本发明的有益效果如下：
本发明不仅改进了旧有方法繁琐步骤和不完全不完整的蛋白质组标记，而且可以实现简易、低成本、快速、高效的植物全蛋白质组标记，为定量内标的制备和高精度地定量蛋白质组研究创造了条件。
附图说明
图1为本发明验证例提供的质谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明进行详细说明：
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
专用培养基制备方法实施例1
配方：
按照上述组分及其终浓度，用超纯水配置，并调pH至5.6-5.8，采用高压灭菌后，得到稳定性同位素标记植物的专用培养基。
备注：如需制备固体培养基，需在采用高压灭菌后，每500mL培养基加入4g洋菜。
专用培养基制备方法实施例2
配方：
按照上述组分及其终浓度，用超纯水配置，并调pH至5.6，采用高压灭菌后，得到稳定性同位素标记植物的专用培养基。
备注：如需制备固体培养基，需在采用高压灭菌后，每500mL培养基加入4g洋菜。
专用培养基制备方法实施例3
配方：
按照上述组分及其终浓度，用超纯水配置，并调pH至5.8，采用高压灭菌后，得到稳定性同位素标记植物的专用培养基。
备注：如需制备固体培养基，需在采用高压灭菌后，每500mL培养基加入4g洋菜。
专用培养基制备方法实施例4
配方：
按照上述组分及其终浓度，用超纯水配置，并调pH至5.7，采用高压灭菌后，得到稳定性同位素标记植物的专用培养基。
备注：如需制备固体培养基，需在采用高压灭菌后，每500mL培养基加入4g洋菜。
专用培养基制备方法实施例5
配方：
按照上述组分及其终浓度，用超纯水配置，并调pH至5.6，采用高压灭菌后，得到稳定性同位素标记植物的专用培养基。
备注：如需制备固体培养基，需在采用高压灭菌后，每500mL培养基加入4g洋菜。
专用培养基制备方法实施例6
配方：
按照上述组分及其终浓度，用超纯水配置，并调pH至5.8，采用高压灭菌后，得到稳定性同位素标记植物的专用培养基。
备注：如需制备固体培养基，需在采用高压灭菌后，每500mL培养基加入4g洋菜。
验证例
一、稳定性同位素标记植物专用培养基标记植物(拟南芥)
1、种子消毒
实验室常用的基因工程改造的植物，如拟南芥、藻类等均可用本发明的培养条件进行培养。本实施例仅以拟南芥为例进行说明：
挑选新鲜的的拟南芥种子，将0.2mL种子放入一个1.5mL微量离心管内，加入1mL70％乙醇然后涡流一分钟，再离心分离出种子。
将上清液倒去，加入1mL 30％漂白液和0.1％TritonX-100的混合液，培养5-10分钟，再离心分离出种子，然后将上清液倒去，重复以上步骤5次。
洗净种子后，把种子浸在4度超纯水中，放在黑暗环境中3天。
2、稳定性同位素标记
预备足够数量的经过高压灭菌后的玻璃瓶、透气封膜和橡皮圈，在防菌层流罩内，倒入由专用培养基制备方法实施例1制备得到的稳定性同位素培养基，直至水高1.5cm。
待稳定性同位素培养基凝固后，防菌层流罩内，将消毒后的种子接种于稳定性同位素培养基上。
接种种子后，将玻璃瓶吹乾1小时，然后重新用透气封膜和橡皮圈包住。
将封好的种子玻璃瓶放在室温带光的植物生长室，大约经过1周时间，种子发芽；经四周时间，成长至一株成熟拟南芥。
3、检测
1)收取植物组织
倒入约50mL液体氮于拟南芥玻璃瓶内，等待约1分钟，直至培养基完全冻结，然后用预先冷藏的金属勺收取拟南芥组织。
2)总蛋白的提取
以150mM pH 7.6的Tris缓冲液、8M尿酸、0.5％SDS、1.2％TritonX-100、50mMNaF和1mM PMSF作为蛋白提取液，将冻结的拟南芥组织磨成细粉，将适量的蛋白提取液加在细粉中。
用每分钟28000转率离心分离2小时，保留上清液。以甲醇和丙酮比例为1:12的液体沉淀上清液中的总蛋白(上清液与沉淀液的比例大概为1:3)，之后收集总蛋白。
3)SDS胶蛋白分离和胶内酶解
将上述收集的总蛋白利用30％丙烯酰胺/双丙烯酰胺水溶液、1.5M pH 8.8的Tris-HCl缓冲液、0.5M pH 6.8的Tris-HCl缓冲液和10％新鲜预备的过硫酸铵进行SDS-PAGE分离。
将染色的胶段清洗，以500uL pH 8.0的50％乙腈/25mM碳酸氢铵、200uL100％乙腈和50uL 5％蚁酸进行脱色、脱水，用10ng/uL的胰蛋白酶37℃消化14小时，得到肽段。具体参照文献Helmann,U.,Wernstedt,C.,Gonez,J.,and Heldin,C.(1995)Improvement of anIn Gel Digestion Procedure for the Micropreparation of Internal ProteinFragments forAmino Acid Sequencing.Anal.Biochem.224,451-455中记载的方法。
4)色谱－质谱联用分析
将上述所得的肽段以C18柱脱盐，以10uL的5％乙腈和0.1％蚁酸的色谱－质谱联用上样缓冲液进行溶解，取2uL进行色谱－质谱联用分析，具体参照文献Xu,P.；Duong,D.；Peng,J.,(2009)Systematical optimization of reverse-phase chromatogramphy forshortgunproteomics.J Proteome Res,8(8),2944-50中记载的方法。
4、稳定性同位素标记植物的标记效率测定
按照上述第一部分中1和2的方法标记植物(拟南芥)，将其蛋白经上述方法提取和酶解后利用water Q-TOF液相色谱串联质谱仪检测，得到图1所示质谱图，可见其质谱图中有超过95％为氮15稳定性同位素标记的蛋白(按照积分面积计算)。
可见，采用本发明提供的稳定性同位素标记植物的专用培养基进行拟南芥全蛋白质组标记时，具有植物全蛋白质组标记效率高的优点。
采用同样的实验方式，对藻类植物进行标记，最终得到的质谱图中有超过95％为氮15稳定性同位素标记的蛋白。
对本发明专用培养基制备方法实施例2-6制备得到的专用培养基进行了同样的试验，试验结果表明，其对拟南芥和藻类植物进行标记时，最终得到的质谱图中均有超过95％为氮15稳定性同位素标记的蛋白。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种稳定性同位素标记植物的专用培养基，其特征在于，包括以下组分：无机盐、稳定性同位素标记NH4NO3、稳定性同位素标记KNO3、辅助添加剂和水。
2.根据权利要求1所述的稳定性同位素标记植物的专用培养基，其特征在于，所述无机盐在所述专用培养基中的终浓度为0.025-400mg/L；
所述稳定性同位素标记NH4NO3在所述专用培养基中的终浓度为500-2500mg/L；
所述稳定性同位素标记KNO3在所述专用培养基中的终浓度为500-2500mg/L。
3.根据权利要求2所述的稳定性同位素标记植物的专用培养基，其特征在于，所述无机盐为CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、H3BO3、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、ZnSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O中的一种或几种的混合物。
4.根据权利要求3所述的稳定性同位素标记植物的专用培养基，其特征在于，所述辅助添加剂包括肌醇、淤酸、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺素中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求4所述的稳定性同位素标记植物的专用培养基，其特征在于，所述CaCl2·2H2O在所述专用培养基中的终浓度为300-500mg/L；
所述MgSO4·7H2O在所述专用培养基中的终浓度为300-500mg/L；
所述KH2PO4在所述专用培养基中的终浓度为100-200mg/L；
所述H3BO3在所述专用培养基中的终浓度为5-10mg/L；
所述CoCl2·6H2O在所述专用培养基中的终浓度为0.01-0.05mg/L；
所述CuSO4·5H2O在所述专用培养基中的终浓度为0.01-0.05mg/L；
所述FeSO4·7H2O在所述专用培养基中的终浓度为20-30mg/L；
所述MnSO4·4H2O在所述专用培养基中的终浓度为20-30mg/L；
所述KI在所述专用培养基中的终浓度为0.5-1mg/L；
所述Na2MoO4·2H2O在所述专用培养基中的终浓度为0.20-0.40mg/L；
所述ZnSO4·7H2O在所述专用培养基中的终浓度为5-10mg/L；
所述Na2EDTA·2H2O在所述专用培养基中的终浓度为35-50mg/L；
所述肌醇在所述专用培养基中的终浓度为100mg/L；
所述淤酸在所述专用培养基中的终浓度为1mg/L；
所述盐酸吡哆醇在所述专用培养基中的终浓度为1mg/L；
所述盐酸硫胺素的在所述专用培养基中的终浓度为10mg/L。
6.根据权利要求1-5任一项所述的稳定性同位素标记植物的专用培养基，其特征在于，所述专用培养基的pH值为5.6-5.8；
和/或所述稳定性同位素标记NH4NO3为15NH4 15NO3；
和/或所述稳定性同位素标记KNO3为K15NO3。
7.一种权利要求1-6任一项所述的稳定性同位素标记植物的专用培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，按配方量秤取无机盐、稳定性同位素标记NH4NO3、稳定性同位素标记KNO3、辅助添加剂和水；
S2，将S1秤取到的无机盐、稳定性同位素标记NH4NO3、稳定性同位素标记KNO3和辅助添加剂均加入到S1秤取到的水中，搅拌混合至固体完全溶解，即得到所述专用培养基。
8.一种权利要求1-6任一项所述的稳定性同位素标记植物的专用培养基的用途，其特征在于，所述专用培养基用于稳定性同位素标记植物蛋白质组。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，将植物在所述专用培养基中培养，得到稳定性同位素标记植物蛋白质组。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述培养的方式为室温25℃培养1代，培养时间为100-500小时。
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