CN1810978A

CN1810978A - 微藻培养生产同位素葡萄糖的方法

Info

Publication number: CN1810978A
Application number: CN 200510006694
Authority: CN
Inventors: 李健; 毛延发; 刘小玲
Original assignee: DONGXIFANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd SHENZHEN
Current assignee: DONGXIFANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd SHENZHEN
Priority date: 2005-01-27
Filing date: 2005-01-27
Publication date: 2006-08-02

Abstract

本发明公开了一种利用封闭式光生物反应器微藻培养生产同位素葡萄糖的方法，包括封闭式光生物反应器的构造和微藻培养的生产工艺。采用封闭的真空气泵循环使用同位素二氧化碳，避免了昂贵的同位素二氧化碳的流失，使同位素二氧化碳的利用率可达到100％。采用适宜的微藻品种和优化的微藻培养基，提高了微藻葡萄糖含量，含量高达细胞干重的60－80％。

Description

微藻培养生产同位素葡萄糖的方法

技术领域

本发明涉及一种利用微藻生物合成生产同位素葡萄糖的方法，包括培养基的配置，光生物反应器的构建，微藻的接种和扩种以及微藻在光生物反应器中的培养等环节。

背景技术

同位素葡萄糖是指由碳或氢等元素的同位素构成的葡萄糖。例如标记有碳13，碳14，氘或氚等同位素的葡萄糖。

同位素葡萄糖是生物技术研究用新型试剂，在生物工程和新医药产业有特殊的应用。一般的葡萄糖广泛地用于生物工程和新医药产业，几乎是所有的数以万计的生物过程的主要原材料。有了同位素葡萄糖，就可以非常容易地利用现有的成熟的生物工程工艺生产数以万计的同位素生化分子。这些同位素生化分子在当代生命科学产业中有着特殊的，甚至在某些情况下不可替代的应用。例如用碳13葡萄糖制备的稳定性同位素蛋白质，核酸和多糖等大分子可以用于大分子结构研究。

同位素葡萄糖的制备有化学合成和生物合成两种方法。同位素葡萄糖的生物合成一般用微藻培养的方法。在微藻培养基里提供无机同位素的碳或氢同位素，微藻通过进行光合作用，合成淀粉，蛋白质和脂肪等生物大分子。将这样培养的微藻中的淀粉分离纯化，再水解则可获得同位素葡萄糖。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物合成同位素葡萄糖的方法。包括培养基的配置，光生物反应器的构建，微藻的接种和扩种以及微藻在光生物反应器中的培养等环节。本发明的方法实现同位素100％的利用和高产率同位素葡萄糖的生产。

本发明的方法具体步骤如下：

1.选择藻种和配置同位素微藻培养基

本发明采用螺旋藻作为藻种来生产同位素葡萄糖。

本发明采用如下所述的两种培养基，分别用于螺旋藻的扩种和在光生物反应器中的培养。

用于扩种的培养基配方是：

¹³C碳酸氢钠 16.8g/L

硝酸钠 2.5g/L

硫酸钾 1.0g/L

氯化钠 1.0g/L

磷酸氢二钾 0.5g/L

硫酸镁 0.2g/L

氯化钙 0.04g/L

硫酸亚铁 0.01g/L

乙二胺四乙酸二钠 0.08g/L

硼酸 2.8×10-3g/L

氯化锰 1.8×10-3g/L

硫酸锌 2.2×10-4g/L

硫酸铜 8.0×10-5g/L

钼酸钠 3.9×10-5g/L

矾酸铵 2.2×10-5g/L

硫酸铬钾 9.6×10-5g/L

硫酸镍 4.8×10-5g/L

钨酸钠 1.7×10-5g/L

硫酸钛 4.0×10-5g/L

硝酸钴 4.4×10-5g/L

用于光生物反应器培养的培养基配方是：

氢氧化钠 0.1g/L

硝酸钠 0.5g/L

硫酸钾 1.0g/L

氯化钠 1.0g/L

磷酸氢二钾 0.5g/L

硫酸镁 0.2g/L

氯化钙 0.04g/L

硫酸亚铁 0.01g/L

乙二胺四乙酸二钠 0.08g/L

硼酸 2.8×10-3g/L

氯化锰 1.8×10-3g/L

硫酸锌 2.2×10-4g/L

硫酸铜 8.0×10-5g/L

钼酸钠 3.9×10-5g/L

矾酸铵 2.2×10-5g/L

硫酸铬钾 9.6×10-5g/L

硫酸镍 4.8×10-5g/L

钨酸钠 1.7×10-5g/L

硫酸钛 4.0×10-5g/L

硝酸钴 4.4×10-5g/L

2.构建全封闭式光生物反应器

本发明采用特殊的全封闭式光生物反应器来培养微藻。全封闭式光生物反应器由以下装置组成：

A、反应器主单元，为20L塑料透明桶，开有3个可以传输气体或液体的进出口，还开有一个可以密封放置pH电极的开口。

B、反应器光源，为6盏25W T5日光灯，在反应器主单元周围均匀放置。

C、氧气吸收装置，为10L容器内置20g/L 硫酸钠溶液。

D、真空气泵，为10L/min的真空气泵，从反应器主单元吸取尾气，将气体通过氧气吸收装置再泵回反应器主单元。

E、pH控制系统，包括pH探头，pH计，自控电磁阀和同位素二氧化碳供给装置。

F、温控装置，为一温控水浴装置，置于反应器底部。

请参见光生物反应器的示意图。

3.微藻的接种和扩种

取5ml普通螺旋藻液加入到用于200ml扩种的同位素培养基中，培养一段时间，在螺旋藻浓度达到大约0.6g/L的时候，转移到1L的用于扩种的同位素培养基中，待螺旋藻浓度达到大约0.6g/L的时候，接种到光生物反应器。

4.微藻光生物反应器的培养

向微藻光生物反应器中放19L的用于培养的微藻培养基，控制光照600-1000uE，控制温度26-28度，控制通气量0.4-0.6L/min，通过向培养基输入同位素二氧化碳控制pH 8.8-9.2。待系统平衡后，接种1L螺旋藻液到光生物反应器。维持光生物反应器的生长条件，大约8天，螺旋藻浓度会达到1.0-1.2g/L。这时停止光反应器运行，采收藻液，分析葡萄糖含量。

附图说明

附图是本发明的光生物反应器的结构示意图。图中：1是反应器主单元2是反应器光源3是氧气吸收装置4是真空气泵5是pH电极6是pH控制器7是同位素二氧化碳气瓶8是气体导管9是亚硫酸钠溶液10是微藻培养液

具体实施方式

1.配制扩种用同位素微藻培养基：向烧杯中倒入5L蒸馏水，向其中加入各种营养成分如下：

¹³C碳酸氢钠 84g

硝酸钠 12.5g

硫酸钾 5.0g

氯化钠 5.0g

磷酸氢二钾 2.5g

硫酸镁 1.0g

氯化钙 0.2g

硫酸亚铁 0.05g

乙二胺四乙酸二钠 0.4g

硼酸 14mg

氯化锰 9mg

硫酸锌 1.1mg

硫酸铜 400ug

钼酸钠 200ug

矾酸铵 110ug

硫酸铬钾 480ug

硫酸镍 240ug

钨酸钠 85ug

硫酸钛 200ug

硝酸钴 220ug

2.配制培养用同位素微藻培养基：向塑料桶中加入蒸馏水20L，向其中加入各种营养成分如下：

氢氧化钠 2g

硝酸钠 10g

硫酸钾 20g

氯化钠 20g

磷酸氢二钾 10g

硫酸镁 4g

氯化钙 0.8g

硫酸亚铁 0.2g

乙二胺四乙酸二钠 0.4g

硼酸 560mg

氯化锰 36mg

硫酸锌 4.4mg

硫酸铜 1.6mg

钼酸钠 800ug

矾酸铵 440ug

硫酸铬钾 1.9mg

硫酸镍 960ug

钨酸钠 340ug

硫酸钛 800ug

硝酸钴 880ug

3.螺旋藻扩种：取5ml普通螺旋藻液加到装有200ml扩种用同位素微藻培养基的500ml三角瓶中，放置日光灯下培养8天，测量藻液浓度为0.65g/L。将藻液转移到有1000ml扩种用同位素微藻培养基的2L三角瓶中，放置日光灯下培养4天，测量微藻浓度为0.68g/L.

4.构建光生物反应器：将反应器主单元，反应器光源，氧气吸收装置，真空气泵，pH控制系统，和温控装置按示意图所示组装(标点)，加入19L培养用同位素微藻培养基，调整温度控制设定为26-28度，pH控制为8.8-9.2，检查气泵的鼓气量在0.4-0.6期间，调整日光灯和反应器主单元的距离，使反应器主单元表面的光量子通量为600-1000uE。

5.微藻在光生物反应器中的培养：将步骤3扩大的螺旋藻液接种到光生物反应器里，控制反应条件不变，培养8天，观察到螺旋藻颜色转黄，取藻液测量微藻浓度为1.2g/L，测量淀粉浓度为0.8个/L，葡萄糖含量约68％。

参考文献

1.Zvi E.Kahana and Aviva Lapidot.Adaption of Biotechnological Processes forPreparation of Compounds Labeled with Stable Isotopes.Synthesis and Application ofIsotopically Labeled Compounds 1985.Proceedings of the Second InternationalSymposium，Kansas City，MO，USA.，3-6 September 1985，R.R.Muccino(Ed.)，511-512.

2.Paul W.Behrens，Valerie J.Sicotte and Jacques Delente.Microalgae as a Source ofStable Isotopically Labeled Compounds.Journal of Applied Phycology 6：113-121，1994.

3.Richard J.Radmer and Bruce C.Parker.Commercial Application of Algae：Opportunitiesand Constraints.Journal of Appl ies Phycology 6：93-98，1994.

4.Xia Jinlan，Nie Zhenyang，and J.M.Levert.Biosynthesis of ¹³C-labeled Amino Acid andSugars by Spirulina(Arthrospira)in a Parallelepiped Photobioreactor.Chinese Journalof Chemical Engineering 10(5)592-596(2002)

5.Francisco G.Acien Fernandez，Celeste Brindley Alias，Maria C.Carcia-Malea Lopez，Jose M.Fernandez Sevilla，Maria J.Ibanez Gonzalez Rafael Nunez Gomez，Emilio MolinaGrima.Assessment of the Production of ¹³C-labeled Compounds from PhototrophicMicroalgae at Laboratory Scale.Biomolecular Engineering 20(2003)149-162.

6.Heiner K Berthold，David L.Hachey，Peter J.Reeds P.Thomas，Scot Hoeksema and PeterD.Klein.Uniformly ¹³C-labeled Algal Protein Used to Determine Amino Acid Essentialityin vivo.Proceedings of National Academy of Sciences USA 88(9)8091-8095 1991.

7.Gernaldine Brandner，Vincent Phalip，Esther Kellenberger and Cheng-cai Zhang.Optimization of a Cyanobacterial Culture used for Production of Isotopes-labelledRecombinant Proteins.Biotechnology Techniques 13：177-180，1999

8.Takanori Kigawa，Takashi Yabuhi，Yasuhilo Yoshida，Michio Tsutsui，Yutaka Ito，Takehiko Shibata，Shigeyuki Yokoyama.Cell-free Production and Stable-IsotopeLabeling of Milligram Quantities of Proteins.FEBS Letters 442(1999)15-19

9.Elizabeth Boyle-Roden，J.B.German，and B.J.B.Wood.The Production of LipidsAlternatively Labelled with Carbon-13.Biomolecular Engineering 20(2003)285-289

10.Ross，W.Kessler，D.Krumme，U.Menge，J.Wissing，J.van den Heuvel，and L Flohe.Optimized Fermentation Strategy for 13C/15N Recombinant Protein Labelling InEscherichia coli for NMR-structure Analysis.Journal of Biotechnology 108(2004)31-39

Claims

1.一种利用封闭式光生物反应器微藻培养生产同位素葡萄糖的方法，包括以下步骤：

A、选择微藻藻种和配置同位素微藻培养基

选择一种适宜的微藻作为生产用藻种，配置两种培养基，分别用于微藻的扩种和培养。

B、光生物反应器的构建

利用透明的细胞培养设备，加上人工光源、温度控制、pH值控制、真空气泵、氧气吸收器等装置，构建用于培养微藻的全封闭式光生物反应器。

C、微藻的扩种

将微藻接种到用于扩种的培养基里，用三角瓶扩大培养微藻，使其达到一定的浓度和体积。

D、藻的光生物反应器培养

将达到一定浓度和体积的微藻液接种到生物反应器内，在一定的光线温度、pH值条件和鼓气量的条件下，培养微藻，并在一定浓度下采收藻液。

2.如权力要求1所述的一种微藻培养生产同位素葡萄糖的方法，其特征是采用螺旋藻作为生产藻种。

3.如权力要求1所述的一种微藻培养生产同位素葡萄糖的方法，其特征是采用含有以下成分的培养基用于微藻的扩种：

¹³C碳酸氢钠 16.8g/L

硝酸钠 2.5g/L

硫酸钾 1.0g/L

氯化钠 1.0g/L

磷酸氢二钾 0.5g/L

硫酸镁 0.2g/L

氯化钙 0.04g/L

硫酸亚铁 0.01g/L

乙二胺四乙酸二钠 0.08g/L

硼酸 2.8×10-3g/L

氯化锰 1.8×10-3g/L

硫酸锌 2.2×10-4g/L

硫酸铜 8.0×10-5g/L

钼酸钠 3.9×10-5g/L

矾酸铵 2.2×10-5g/L

硫酸铬钾 9.6×10-5g/L

硫酸镍 4.8×10-5g/L

钨酸钠 1.7×10-5g/L

硫酸钛 4.0×10-5g/L

硝酸钴 4.4×10-5g/L

4.如权力要求1所述的一种微藻培养生产同位素葡萄糖的方法，其特征是采用含有以下成分的培养基用于微藻的培养：

氢氧化钠 0.1g/L

硝酸钠 0.5g/L

硫酸钾 1.0g/L

氯化钠 1.0g/L

磷酸氢二钾 0.5g/L

硫酸镁 0.2g/L

氯化钙 0.04g/L

硫酸亚铁 0.01g/L

乙二胺四乙酸二钠 0.08g/L

硼酸 2.8×10-3g/L

氯化锰 1.8×10-3g/L

硫酸锌 2.2×10-4g/L

硫酸铜 8.0×10-5g/L

钼酸钠 3.9×10-5g/L

矾酸铵 2.2×10-5g/L

硫酸铬钾 9.6×10-5g/L

硫酸镍 4.8×10-5g/L

钨酸钠 1.7×10-5g/L

硫酸钛 4.0×10-5g/L

硝酸钴 4.4×10-5g/L

5.如权力要求1所述的一种微藻培养生产同位素葡萄糖的方法，其特征是采用特制的封闭的带有氧气吸收器的光生物反应器，在控制的光照、温度、pH值和鼓气量的条件下培养微藻生产同位素葡萄糖。

6.如权力要求1所述的一种微藻培养生产同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如权力要求3所述的用于扩种的培养基在三角瓶中扩大培养微藻，在浓度为0.6g/L细胞干重的情况下接种微藻细胞到如权利要求5所述的光生物反应器中。

7.如权利要求1所述的一种微藻培养生产同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如权利要求5所述光反应器进行培养时，控制光照条件为600-1000uE。

8.如权利要求1所述的一种微藻培养生产同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如权利要求5所述光反应器进行培养时，控制温度为26-28度。

9.如权利要求1所述的一种微藻培养生产同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如权利要求5所述的光反应器进行培养时，控制pH值为8.8-9.2。

10.如权利要求1所述的一种微藻培养生产同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如权利要求5所述的光反应器进行培养时，控制鼓气量为0.4-0.6L/L。

11.如权利要求1所述的一种微藻培养生产同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如权利要求5所述的光生物反应器进行培养时，在微藻浓度为1.0-1.2g/L时进行采收。