CN110283862A - 一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法，包括以下步骤：原料的预处理：以13C标记蛋白核小球藻为同位素原料，使用有机溶剂对13C标记蛋白核小球藻进行脱色处理，脱色菌体细胞破碎处理；淀粉液化、糖化反应：所述预处理后的13C标记蛋白核小球藻先经过液化酶发生液化反应、再经过糖化酶发生糖化反应，将反应液固液分离，收集上清液；13C标记的葡萄糖的分离：将所述上清液进行树脂脱色处理获得洗脱液，该洗脱液经过浓缩、活性炭脱色和结晶得到所述13C标记葡萄糖。与现有技术相比，本发明具有13C标记葡萄糖产品丰度和纯度高、工艺条件温和、对环境影响小以及小球藻的利用率高等优点。

Description

一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法
技术领域
本发明涉及一种制备葡萄糖的方法，尤其是涉及一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法，属于生物、医药、化工技术领域。
背景技术
葡萄糖(glucose)分子式C6H12O6，分子量为180，白色晶体，易溶于水，味甜，熔点146℃，结构式如下：
CH2OH-CHOH-CHOH-CHOH-CHOH-CHO。
它是自然界分布最广泛的单糖，被广泛用于医疗输液、生物原料等。
13C标记的葡萄糖是葡萄糖的标记化合物，不仅用于糖尿病、早期脑血管、障碍或痴呆病变的临床诊断；作为原料，生产标记葡萄糖衍生物以及其他标记产品；还可作为科研示踪剂，用途比较广泛。
普通葡萄糖主要采用玉米和马铃薯中所含的淀粉经酶转化制取。对于13C标记葡萄糖的合成，由于需要引入标记物，因此生产方法有所不同，目前已经探索出的有机合成法、微生物光合作用法、发酵法如下：
(1)有机合成法
Williams和Whaley以5-氧代-1，2-O-亚异丙基-D-木-五呋喃糖和Na13CN为原料，经反应、LiAlH4还原以及三氟乙酸溶液中水解，得到D-葡萄糖6-13C，产率48％(D.L.Williams,T.W.Whaley.Syntheses with stable isotopes:D-glucose-6-13C and1.6-anhydro-β-L-idopyranose--6-13C.Journal of Labelled Compounds and Radiophamaceuticals.1982,19(5):669-679)。
(2)微生物光合作用法
李健等以微藻为出发菌株，利用13CO2光合作用，获得1.2g/l的微藻，葡萄糖含量68％。(李健，毛延发，刘小玲.微藻培养生产同位素葡萄糖的方法.2005，申请号：200510006694.0)
(3)微生物发酵法
Robert L.Baxter等以酿酒酵母属菌株S41为出发菌株，在以酵母提取液、蛋白胨等成分的培养基中30℃，200rpm培养12h，然后将获得的菌体并悬浮在每100ml含有[1-13C]或[2-13C]醋酸盐1g为主的培养基中培养8h。菌体经高氯酸处理，树脂柱吸附，旋转蒸发浓缩等获得同位素海藻糖。海藻糖在硫酸溶液中100℃水解6h，树脂柱吸附洗脱，得到60％D-[3,4-13C2]葡萄糖，10％D-[3-13C]和[4-13C]葡萄糖以及30％未标记物质(Robert L.Baxter,Helen C.Baxter,Christopher J.Mcgregor.Microbiological preparation of D-[3,4-13C2]glucose.1992,31(12):981-985)。Luthra等在Ehrin E合成U-11C葡萄糖基础上加以改进，以丰度90％的13C碳酸盐为唯一碳源，获得了丰度为60％的U-13C-葡萄糖(S.K Luthra,V.W Pike,F.Brady,D.R.Turton,B.Wood,R.W Matthews,G.E Hawkes.The utility of 13C/11C-CO-labelling and subsequent 13C-NMR in the characterization of 11C-labelled products.J.Lab.Cpds Radiopharm.1980,23:1070-1072)。
全标记的葡萄糖基本采用发酵法和光合作用法，其中光合作用法更为可行，目前合成13C标记葡萄糖文献很少，国外六七十年代的有所报道基本都是以实验为主，但大批量合成却查阅不到相关文献。中国专利CN1810978A公布了一种利用封闭式光生物反应器微藻培养生产同位素葡萄糖的方法，包括以下步骤：A、选择微藻藻种和配置同位素微藻培养基选择一种适宜的微藻作为生产用藻种，配置两种培养基，分别用于微藻的扩种和培养。B、光生物反应器的构建利用透明的细胞培养设备，加上人工光源、温度控制、pH值控制、真空气泵、氧气吸收器等装置，构建用于培养微藻的全封闭式光生物反应器。C、微藻的扩种将微藻接种到用于扩种的培养基里，用三角瓶扩大培养微藻，使其达到一定的浓度和体积。D、藻的光生物反应器培养将达到一定浓度和体积的微藻液接种到生物反应器内，在一定的光线温度、pH值条件和鼓气量的条件下，培养微藻，并在一定浓度下采收藻液。后续通过菌体制取葡萄糖方面却没有，由藻类制取非标记葡萄糖也未见相关报道。
专利号为ZL 201010144928.9的中国专利公布了一种制备13C标记葡萄糖的方法，采用13C甲醇作为同位素原料，毕赤酵母作为出发菌株，合成13C标记的海藻糖，经酸解，合成13C标记的葡萄糖，该专利技术主要是通过酸解将提纯后的海藻糖生产为葡萄糖，采用酸解法，不仅对设备要求高、对环境影响大，而且13C甲醇成本高并且利用率较低，因此不利于工业上生产利用。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法，利用利用稳定同位素标记的蛋白核小球藻制备13C标记葡萄糖，获得高纯度以及高丰度的13C标记葡萄糖产品。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法，包括以下步骤：
原料的预处理：以13C标记蛋白核小球藻为同位素原料，使用有机溶剂对13C标记蛋白核小球藻进行脱色处理获得脱色菌体，将该脱色菌体进行细胞破碎处理；脱色处理是为了避免小球藻中存在的大量色素对后续制备过程中产品的分离、提纯过程的影响；对藻类进行细胞破碎处理，使胞内淀粉释放到体外，有助于淀粉液化和糖化反应以及分离；
液化、糖化反应：所述预处理后的13C标记蛋白核小球藻先经过液化酶发生液化反应、再经过糖化酶发生糖化反应，将反应液固液分离，收集上清液；
13C标记的葡萄糖的分离：将所述上清液进行树脂脱色处理获得洗脱液，该洗脱液经过浓缩、活性炭脱色和结晶得到所述13C标记葡萄糖。
所述脱色处理的方法具体为：将13C标记蛋白核小球藻和有机溶剂加入索氏萃取管中，萃取至液体无色，最后将萃取液过滤、加水洗涤、离心得到脱色菌体。
其中，所述有机溶剂选自乙醚、石油醚、乙醇或丙酮中的一种或几种，优选为丙酮。
所述细胞破碎的方法为冰箱冻融、超声波处理或者细胞破碎机处理。
所述液化酶的加入量为所述同位素原料质量的0.01～2％；所述糖化酶的加入量为所述同位素原料质量的0.01～2％。
优选地，所述液化酶的加入量为所述同位素原料的1％；所述糖化酶的加入量为所述同位素原料的0.1％。
液化、糖化反应的方法为：在预处理后的13C标记蛋白核小球藻中加水形成菌体溶液，加入液化酶，调节液体的pH为6.5，在90℃条件下液化反应1.5h，反应结束后将液体温度调至110℃，去除液化酶活性，降温；液化反应后，在反应液中加入糖化酶，调节液体的pH为4.5，在60℃条件下液化反应24h，将反应液离心，收集上清液。
所述13C标记的葡萄糖的分离步骤中采用的树脂选自Tulsion大孔阴离子交换树、D296、D730、A30或D301，优选为D296。
所述树脂脱色处理的方法为：调节上清液PH为6.5，以90ml/h的流速通入树脂柱进行色素吸附，经水洗后收集洗脱液。
该制备方法中采用盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH。
本发明采用13C标记蛋白核小球藻作为同位素原料，经菌体处理，溶剂脱色、酶转化、树脂分离、浓缩、活性炭脱色、结晶，可获得丰度和纯度大于98％的13C葡萄糖产品。该工艺不同于传统的利用玉米提取淀粉再糖化合成葡萄糖的工艺，上述工艺玉米中淀粉质量高，成分简单，淀粉易于提纯。本工艺由于藻类淀粉含量较低，菌体成分比较复杂，因此不易于提取淀粉，但直接进行糖化，即可获得葡萄糖。由于藻类色素较高，制取过程中色素较多，影响产品分离和结晶，因此增加了藻类脱色工艺。
相比于现有专利ZL 201010144928.9中的菌体经过乙醇溶液提取、脱色、结晶制备海藻糖，在将海藻糖酸解获得含葡萄糖的反应液的技术方案，本发明仅将菌体进行简单脱色处理，然后通过液化酶和水解酶处理即可获得含葡萄糖的反应液，本发明有利于提高小球藻的糖转化率，充分利用绿藻中的淀粉，使其转化为葡萄糖，提高了反应液中的葡萄糖的含量，从而提高了葡萄糖的收率。并且，相比于海藻糖酸解的方法，本发明中酶解方法具有反应条件温和，不需要耐高温高压以及耐腐蚀的设备，淀粉转化率高，由于酶反应的专一性，副反应少，有利于糖液的分离纯化。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明采用生物酶解法代替现有技术中的酸解法，反应条件更加温和，小球藻的利用率高，实现了小球藻的高价值转化，提高了发酵原液中葡萄糖的含量，有利于获得高纯度以及高丰度的13C标记葡萄糖产品；
(2)根据藻类的自身特性，对小球藻进行溶剂脱色预处理，进一步提高了葡萄糖产品的纯度；
(3)对藻类进行细胞破碎处理，使胞内淀粉释放到体外，有助于液化和糖化反应以及分离；
(4)整个工艺过程简单、安全、易于操作和控制，适合工业化大规模生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
将光合作用获得的13C标记蛋白核小球藻烘干，取10g菌体，加入200ml乙醇溶剂，利用索氏萃取至溶液无色，加水洗涤后将溶液离心直至液体无颜色，将离心后菌体-80℃冷冻过夜，取出40℃条件下融化，加入10mg液化酶，溶液调pH为6.5，90℃下反应1.5h，然后升温到110℃去酶活，降温，加入10mg糖化酶，溶液调pH为4.5，60℃下反应24h，离心获得上清液，将上清液pH调节为6.5，将液体上D301树脂柱，设置流速为90ml/h，水洗树脂柱，收集洗脱液，浓缩，活性炭脱色，结晶，干燥，得到5.1g的13C标记葡萄糖产品，纯度大于98％。本实施例中，采用盐酸或氢氧化钠调节液体的pH。
实施例2
将光合作用获得的13C标记蛋白核小球藻烘干，取10g菌体，加入200ml丙酮溶剂，利用索氏萃取至溶液无色，加水洗涤后将溶液离心直至液体无颜色，将离心后菌体经超声波处理30min，加入200mg液化酶，溶液调pH为6.5，90℃下反应1.5h，然后升温到110℃去酶活，降温，加入500mg糖化酶，溶液调pH为4.5，60℃下反应24h，离心获得上清液，将上清液pH调节为6.5，上D296树脂柱，设置流速为90ml/h，水洗树脂柱，收集洗脱液，浓缩，活性炭脱色，结晶，干燥，得到4.9g的13C标记葡萄糖产品，纯度大于98％。本实施例中，采用盐酸或氢氧化钠调节液体的pH。
实施例3
将光合作用获得的13C标记蛋白核小球藻烘干，取10g菌体，加入200ml乙醚溶剂，利用索氏萃取至溶液无色，加水洗涤后将溶液离心直至液体无颜色，将离心后菌体采用细胞破碎机进行细胞破碎30min，然后加入100mg液化酶，溶液调pH为6.5，90℃下反应1.5h，然后升温到110℃去酶活，降温，加入1000mg糖化酶，溶液调pH为4.5，60℃下反应24h，离心获得上清液，将上清液pH调节为6.5，将液体上A30树脂柱，设置流速为90ml/h，水洗树脂柱，收集洗脱液，浓缩，活性炭脱色，结晶，干燥，得到4.5g的13C标记葡萄糖产品，纯度大于98％。本实施例中，采用盐酸或氢氧化钠调节液体的pH。
实施例4
将光合作用获得的13C标记蛋白核小球藻烘干，取10g菌体，加入200ml乙醚溶剂，利用索氏萃取至溶液无色，加水洗涤后将溶液离心直至液体无颜色，将离心后菌体采用细胞破碎机进行细胞破碎30min，然后加入20mg液化酶，溶液调pH为6.5，90℃下反应1.5h，然后升温到110℃去酶活，降温，加入200mg糖化酶，溶液调pH为4.5，60℃下反应24h，离心获得上清液，将上清液pH调节为6.5，将液体上Tulsion大孔阴离子交换树脂柱，设置流速为90ml/h，水洗树脂柱，收集洗脱液，浓缩，活性炭脱色，结晶，干燥，得到4.8g的13C标记葡萄糖产品，纯度大于98％。本实施例中，采用盐酸或氢氧化钠调节液体的pH。
实施例5
将光合作用获得的13C标记蛋白核小球藻烘干，取10g菌体，加入200ml石油醚，利用索氏萃取至溶液无色，加水洗涤后离心直至液体无颜色，将离心后菌体-80℃冷冻过夜，取出40℃融化，加入50mg液化酶，溶液调pH为6.5，90℃下反应1.5h，然后升温到110℃去酶活，降温，加入300mg糖化酶，溶液调pH为4.5，60℃下反应24h，离心获得上清液，将上清液pH调节为6.5，将液体上D730树脂柱，流速90ml/h，水洗树脂柱，收集洗脱液，浓缩，活性炭脱色，结晶，干燥，得到4.7g的13C标记葡萄糖产品，纯度大于98％。本实施例中，采用盐酸或氢氧化钠调节液体的pH。
本实施例采用13C标记蛋白核小球藻作为同位素原料，经菌体处理，溶剂脱色、酶转化、树脂分离、浓缩、活性炭脱色、结晶，可获得丰度和纯度大于98％的13C葡萄糖产品。该工艺不同于传统的利用玉米提取淀粉再糖化合成葡萄糖的工艺，上述工艺玉米中淀粉质量高，成分简单，淀粉易于提纯。本工艺由于藻类淀粉含量较低，菌体成分比较复杂，因此不易于提取淀粉，但直接进行糖化，即可获得葡萄糖。由于藻类色素较高，制取过程中色素较多，影响产品分离和结晶，因此增加了藻类脱色工艺。
对比例1
将光合作用获得的13C标记蛋白核小球藻烘干，取10g菌体，加水离心，将离心后菌体-80℃冷冻过夜，取出40℃条件下融化，加入10mg液化酶，溶液调pH为6.5，90℃下反应1.5h，然后升温到110℃去酶活，降温，加入10mg糖化酶，溶液调pH为4.5，60℃下反应24h，离心获得上清液，将上清液pH调节为6.5，将液体上D301树脂柱，设置流速为90ml/h，水洗树脂柱，收集洗脱液，浓缩，活性炭脱色，结晶，干燥，得到4.2g的13C标记葡萄糖产品，纯度大于90％。本实施例中，采用盐酸和氢氧化钠调节液体的pH。
对比例2
将光合作用获得的13C标记蛋白核小球藻烘干，取10g菌体，加入200ml乙醇溶剂，利用索氏萃取至溶液无色，加水洗涤后将溶液离心直至液体无颜色，将离心后的菌体直接用于液化反应，加入10mg液化酶，溶液调pH为6.5，90℃下反应1.5h，然后升温到110℃去酶活，降温，加入10mg糖化酶，溶液调pH为4.5，60℃下反应24h，离心获得上清液，将上清液pH调节为6.5，将液体上D301树脂柱，设置流速为90ml/h，水洗树脂柱，收集洗脱液，浓缩，活性炭脱色，结晶，干燥，得到2.8g的13C标记葡萄糖产品，纯度大于98％。本实施例中，采用盐酸或氢氧化钠调节液体的pH。
将对比例与实施例1进行比较，对比例1中，小球藻没有经过脱色直接进行细胞破碎，最后葡萄糖产品仅为4.2g，远远小于实施例1中的5.1g，纯度仅为90％以上，远小于98％。因此，脱色处理直接影响了葡萄糖产品的收率以及最终葡萄糖产品的纯度；对比例2中，脱色处理后的小球藻没有经过细胞破碎，直接进行液化反应，最后葡萄糖产品仅为2.8g，也远远小于实施例1中的5.1g，这说明，对于小球藻类原料，细胞破碎处理十分必要。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (8)

1.一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
原料的预处理：以13C标记蛋白核小球藻为同位素原料，使用有机溶剂对13C标记蛋白核小球藻进行脱色处理获得脱色菌体，将该脱色菌体进行细胞破碎处理；
液化、糖化反应：所述预处理后的13C标记蛋白核小球藻先经过液化酶发生液化反应、再经过糖化酶发生糖化反应，将反应液固液分离，收集上清液；
13C标记的葡萄糖的分离：将所述上清液进行树脂脱色处理获得洗脱液，该洗脱液经过浓缩、活性炭脱色和结晶得到所述13C标记葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法，其特征在于，所述脱色处理的方法具体为：将13C标记蛋白核小球藻和有机溶剂加入索氏萃取管中，萃取至液体无色，最后将萃取液过滤、加水洗涤、离心得到脱色菌体。
3.根据权利要求2所述的一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自乙醚、石油醚、乙醇或丙酮中的一种或几种，优选为丙酮。
4.根据权利要求1所述的一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法，其特征在于，所述细胞破碎处理的方法为冰箱冻融、超声波处理或者细胞破碎机处理。
5.根据权利要求1所述的一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法，其特征在于，所述液化酶的加入量为所述同位素原料质量的0.01～2％；所述糖化酶的加入量为所述同位素原料质量的0.01～2％。
6.根据权利要求5所述的一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法，其特征在于，所述液化酶的加入量为所述同位素原料的1％；所述糖化酶的加入量为所述同位素原料的0.1％。
7.根据权利要求1所述的一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法，其特征在于，所述液化、糖化反应的方法具体为：在预处理后的13C标记蛋白核小球藻中加水形成菌体溶液，加入液化酶，调节液体的pH为6.5，在90℃条件下液化反应1.5h，反应结束后将液体温度调至110℃，去除液化酶活性，降温；液化反应后，在反应液中加入糖化酶，调节液体的pH为4.5，在60℃条件下液化反应24h，将反应液离心，收集上清液。
8.根据权利要求1所述的一种稳定同位素标记葡萄糖的制备方法，其特征在于，所述13C标记的葡萄糖的分离步骤中采用的树脂选自Tulsion大孔阴离子交换树、D296、D730、A30或D301。
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