CN103609449A - 一种13c水稻愈伤组织制备方法 - Google Patents

一种13c水稻愈伤组织制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103609449A
CN103609449A CN201310617358.4A CN201310617358A CN103609449A CN 103609449 A CN103609449 A CN 103609449A CN 201310617358 A CN201310617358 A CN 201310617358A CN 103609449 A CN103609449 A CN 103609449A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mgl
callus
rice
medium
subculture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310617358.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103609449B (zh
Inventor
宋亚娜
王�锋
苏军
付艳萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Biotechnology of Fujian Academy of Agricultural Science
Original Assignee
Institute of Biotechnology of Fujian Academy of Agricultural Science
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Biotechnology of Fujian Academy of Agricultural Science filed Critical Institute of Biotechnology of Fujian Academy of Agricultural Science
Priority to CN201310617358.4A priority Critical patent/CN103609449B/zh
Publication of CN103609449A publication Critical patent/CN103609449A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103609449B publication Critical patent/CN103609449B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于评价转基因水稻对土壤微生物多样性影响的水稻愈伤组织制备方法。本发明以13C葡萄糖(D-GLUCOSE(U-13C6,99%))作为培养基的碳源，对转基因及非转基因水稻的愈伤组织进行继代培养，通过13C稳定性同位素丰度检测确定得到了含一定丰度13C的转基因及非转基因水稻愈伤组织。上述水稻愈伤组织可用于快速准确评价转基因水稻植株降解对土壤微生物多样性的影响，对研究转基因水稻土壤微生物群落结构及其生态安全性评价具有重要意义。

Description

一种13C水稻愈伤组织制备方法
技术领域
本发明涉及组织培养、同位素技术和土壤微生物分子生态学领域，具体提供了一种获得用于水稻土壤微生物群落研究的13C水稻愈伤组织的方法。
背景技术
土壤微生物群落结构的变化反映土壤环境状况，是衡量土壤质量及土壤生态系统功能的重要指标。在根际环境中，根系分泌物及脱落物的数量和种类直接影响微生物的数量和组成，而根系分泌物的数量和种类很大程度上是由植物种类和基因型决定的，因此不同种类植物的根际往往具有其特有的优势微生物群落结构。
转基因植物是经过物理、化学或生物学方法将由动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物组织中而被赋予某种预期性状的基因工程植物。随着转基因技术的发展，越来越多的植物被赋予新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产和优质等。但在转基因作物推广提高效益的同时对农业生态环境也可能存在一些潜在影响，其中对农田土壤微生物群落结构组成和功能的影响就是一个重要方面。
转基因作物主要通过根系分泌物和植物残体影响土壤微生物的群落组成。转基因作物所含有的外源基因及其表达产物可通过根系分泌物和作物残留物进入农田土壤，与土壤微生物发生互作后可能改变土壤微生物群落的多样性及其功能。
由于土壤微生物的复杂性及其功能冗余性和作物品种及转入的外源基因的不同，使得国内外关于转基因作物对土壤微生物群落结构影响的研究结果零散不一，缺乏说服力。尽管DNA分子指纹图谱技术大大推进了环境微生物分子生态学的发展，但是要从整体水平上清楚认识复杂环境中微生物群落生理代谢过程的分子机制仍具有较大困难。在转基因作物对土壤微生物多样性的影响的研究中，同样也存在无法有效区分转基因作物自身和其它环境因素的影响等问题。稳定性同位素核酸技术（DNA-based stable isotope probing DNA-SIP）则能有效克服上述难点，定向发掘复杂环境中微生物群落生理代谢功能，回收同位素标记DNA开展环境基因组学研究，能够研究特定条件下的微生物群落结构及其作用。该技术的核心是获得明确无疑的微生物标记基因组DNA，如13C-DNA，再通过DGGE、克隆文库、高通量测序等下游分析研究微生物群落结构及功能。
若获得了含有13C的水稻愈伤组织，并对其进行土壤培养实验，便可快速检测转基因水稻组织在降解过程中对土壤微生物群落结构和功能的影响状况。因此13C水稻愈伤组织的获得是实现了利用DNA-SIP技术快速准确评价转基因水稻对土壤微生物多样性影响的必要条件，即首先要建立13C水稻愈伤组织的制备方法。该方法的建立对研究转基因水稻土壤微生物群落结构及其生态安全性评价具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻愈伤组织制备方法，该方法能够制备出含有一定13C丰度的水稻愈伤组织，以便用于转基因水稻对土壤微生物群落结构影响的研究。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
其制备方法包括以下步骤：
1）水稻种子的消毒；
2）用NB培养基进行水稻种子愈伤的诱导及继代培养；
3）用NBc培养基进行水稻愈伤组织的继代培养；
4）检测水稻愈伤组织中的13C丰度。
所述的水稻愈伤组织是含有13C丰度的愈伤组织。
其具体步骤为：
1）取水稻种子，分别用质量分数为70%乙醇、0.1% Tween20、10% NaClO和无菌水进行种子消毒；
2）消毒后的种子滤干后接种到NB培养基上，于27-29℃生化培养箱暗培养10-20天，幼胚生出愈伤组织，去掉幼胚将愈伤组织转接到NB培养基上继代2-3次，每代培养10-20天；
3）挑取一定量愈伤组织接种到NBc培养基上进行继代培养1-2次，每代培养10-20天；
4）挑取用NBc培养基继代培养后的愈伤组织，用蒸馏水洗净愈伤组织上残留的培养基，然后将愈伤组织烘干磨碎后进行13C稳定性同位素丰度检测。
NB培养基配方：硝酸钾 (KNO3) 2830 mg L-1、硫酸铵 ((NH4)2SO4) 463 mg L-1、磷酸二氢钾 (KH2PO4) 400 mg L-1、硫酸镁 (MgSO4) 185 mg L-1、氯化钙(CaCl2×2H2O) 166 mg L-1、硼酸 (H3BO4) 3 mg L-1、硫酸锰(MnSO4×H2O) 47.58 mg L-1、硫酸锌(ZnSO4×7H2O) 2 mg L-1、碘化钾 (KI) 0.75 mg L-1、钼酸钠 (Na2MoO4×2H2O) 0.25 mg L-1、硫酸铜 (CuSO4×5H2O)    0.025 mg L-1、氯化钴 (CoCl×6H2O) 0.025 mg L-1、硫酸亚铁 (FeSO4×7H2O) 27.8 mg L-1、乙二胺四乙酸二钠 (Na2EDTA) 37.3 mg L-1、肌醇 (Myo-inositol) 100 mg L-1、盐酸硫胺素(ThiamineHCl) 10 mg L-1、盐酸吡哆醇 (PyridoxineHCl) 1 mg L-1、尼克酸 (Niacin)1 mg L-1、水解酪蛋白 (Casamino acids)  300 mg L-1、谷氨酰胺 (Glutamine) 250 mg L-1、脯氨酸 (Proline)500mg L-1、甘氨酸(Glycine) 2 mg L-1、2, 4-D 2 mg L-1、蔗糖(Sucrose)30000 mg L-1、琼脂 (Phytagel) 2400 mg L-1、pH5.8-5.9。
NBc培养基配方：硝酸钾(KNO3)2830 mg L-1、硫酸铵((NH4)2SO4)463 mg L-1、磷酸二氢钾(KH2PO4)400 mg L-1、硫酸镁(MgSO4)185 mg L-1、氯化钙(CaCl2×2H2O)166 mg L-1、硼酸(H3BO4)3 mg L-1、硫酸锰(MnSO4×H2O)47.58 mg L-1、硫酸锌(ZnSO4×7H2O)2 mg L-1、碘化钾(KI)0.75 mg L-1、钼酸钠(Na2MoO4×2H2O)0.25 mg L-1、硫酸铜(CuSO4×5H2O)0.025 mg L-1、氯化钴(CoCl×6H2O)0.025 mg L-1、硫酸亚铁(FeSO4×7H2O)27.8 mg L-1、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)37.3 mg L-1、肌醇(Myo-inositol)100 mg L-1、盐酸硫胺素(ThiamineHCl)10 mg L-1、盐酸吡哆醇(PyridoxineHCl)1 mg L-1、尼克酸(Niacin)1 mg L-1、水解酪蛋白(Casamino acids)300 mg L-1、谷氨酰胺(Glutamine)250 mg L-1、脯氨酸(Proline)500 mg L-1、甘氨酸(Glycine)2 mg L-1、2, 4-D 2 mg L-1、13C葡萄糖(D-GLUCOSE(U-13C6, 99%))30000 mg L-1、琼脂(Phytagel)2400 mg L-1，pH5.8-5.9。
通过检测13C丰度确定获得了含有一定丰度13C的水稻愈伤组织，该愈伤组织可作为试验材料用于评价转基因水稻对土壤微生物多样性影响。
本发明的有益效果：
本发明用13C葡萄糖(D-GLUCOSE(U-13C6, 99%))作为培养基的碳源，对水稻愈伤组织进行继代培养，通过13C稳定性同位素丰度检测可确定获得13C水稻愈伤组织。用该种水稻愈伤组织进行土壤降解培养试验后，可利用稳定性同位素核酸技术（DNA-based stable isotope probing DNA-SIP）分析愈伤组织降解对土壤微生物多样性的直接影响。通过对转基因与非转基因水稻的13C愈伤组织土壤降解过程中微生物群落的DNA-SIP分析，即可快速准确评价转基因水稻植株降解对土壤微生物多样性的影响。这将对研究转基因水稻土壤微生物群落结构及其生态安全性评价具有重要意义。且本方法具有简单、快速的优点，具有很高的经济效益。
附图说明
图1 非转基因亲本水稻（CK）在不同培养基上形成的愈伤组织。图中NB-CK表示为非转基因亲本水稻（CK）在NB培养基上形成的愈伤组织，NBc-CK为非转基因亲本水稻（CK）在NBc培养基上形成的愈伤组织。
图2 转cry1Ac/cpti基因抗虫水稻（GM）在不同培养基上形成的愈伤组织。图中NB-GM为转cry1Ac/cpti基因抗虫水稻（GM）在NB培养基上形成的愈伤组织，NBc-GM为转cry1Ac/cpti基因抗虫水稻（GM）在NBc培养基上形成的愈伤组织。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。以下实施例用于说明本发明而不限制本发明的范围。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实例 1 转基因与非转基因水稻 13 C愈伤组织的获得
以转cry1Ac/cpti基因抗虫水稻（GM）及其对应的非转基因亲本水稻（CK）的种子为材料进行了13C愈伤组织的培养。用NB培养基诱导水稻愈伤组织形成后，再继代培养2次，每次培养15天。然后将一部分愈伤组织接种到NBc培养基上、一部分仍接种到NB培养基上继代培养一次，培养15天后两种培养基上均得到长势良好的愈伤组织（图1、2）。
挑取不同培养基上的愈伤组织，清洗、烘干、磨碎后进行13C稳定性同位素丰度检测，如表1所示。结果表明通过NBc培养基的一次继代培养后，无论转基因与非转基因水稻均可获得含较高13C丰度的愈伤组织。该愈伤组织便可作为试验材料用于评价转基因水稻对土壤微生物多样性影响的土壤降解试验。
表1 碳同位素分析结果
Figure 2013106173584100002DEST_PATH_IMAGE002
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.一种水稻愈伤组织制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
水稻种子的消毒；
用NB培养基进行水稻种子愈伤的诱导及继代培养；
用NBc培养基进行水稻愈伤组织的继代培养；
检测水稻愈伤组织中的13C丰度。
2.根据权利要求1所述的一种水稻愈伤组织制备方法，其特征在于：所述的水稻愈伤组织是含有13C的愈伤组织。
3.根据权利要求1所述的一种水稻愈伤组织制备方法，其特征在于：其具体步骤为：
取成熟的水稻种子，分别用质量分数为70%乙醇、0.1% Tween20、10% NaClO和无菌水进行种子消毒；
消毒后的种子滤干后接种到NB培养基上，于27-29℃生化培养箱暗培养10-20天，幼胚生出愈伤组织，去掉幼胚将愈伤组织转接到NB培养基上继代2-3次，每代培养10-20天；
选取长势良好的愈伤组织接种到NBc培养基上进行继代培养1-2次，每代培养10-20天；
挑取用NBc培养基继代培养后的愈伤组织，用蒸馏水洗净愈伤组织上残留的培养基，然后将愈伤组织烘干磨碎后进行13C稳定性同位素丰度检测。
4.根据权利要求1或2所述一种水稻愈伤组织制备方法，其特征在于：
NBC培养基配方为：硝酸钾2830 mg·L-1、硫酸铵463 mg·L-1、磷酸二氢钾400 mg·L-1、硫酸镁185 mg·L-1、氯化钙166 mg·L-1、硼酸3 mg·L-1、硫酸锰47.58 mg·L-1、硫酸锌2 mg·L-1、碘化钾0.75 mg·L-1、钼酸钠0.25 mg·L-1、硫酸铜0.025 mg·L-1、氯化钴0.025 mg·L-1、硫酸亚铁27.8 mg·L-1、乙二胺四乙酸二钠37.3 mg·L-1、肌醇100 mg·L-1、盐酸硫胺素10 mg·L-1、盐酸吡哆醇1 mg·L-1、尼克酸1 mg·L-1、水解酪蛋白300 mg·L-1、谷氨酰胺250 mg·L-1、脯氨酸500 mg·L-1、甘氨酸2 mg·L-1、2, 4-D 2 mg·L-1、13C葡萄糖30000 mg·L-1、琼脂2400 mg·L-1，pH5.8-5.9；
NB培养基配方：硝酸钾2830 mg·L-1、硫酸铵463 mg·L-1、磷酸二氢钾400 mg·L-1、硫酸镁185 mg·L-1、氯化钙166 mg·L-1、硼酸3 mg·L-1、硫酸锰47.58 mg·L-1、硫酸锌2 mg·L-1、碘化钾0.75 mg·L-1、钼酸钠0.25 mg·L-1、硫酸铜0.025 mg·L-1、氯化钴0.025 mg·L-1、硫酸亚铁27.8 mg·L-1、乙二胺四乙酸二钠37.3 mg·L-1、肌醇100 mg·L-1、盐酸硫胺素10 mg·L-1、盐酸吡哆醇1 mg·L-1、尼克酸1 mg·L-1、水解酪蛋白300 mg·L-1、谷氨酰胺250 mg·L-1、脯氨酸500mg·L-1、甘氨酸2 mg·L-1、2, 4-D 2 mg·L-1、蔗糖30000 mg·L-1、琼脂2400 mg·L-1、pH5.8-5.9。
5.一种如权利要求1或2所述方法制备的水稻愈伤组织的应用，其特征在于：13C水稻愈伤组织可作为评价转基因水稻对土壤微生物多样性影响的试验材料。
CN201310617358.4A 2013-11-29 2013-11-29 一种13c水稻愈伤组织制备方法 Active CN103609449B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310617358.4A CN103609449B (zh) 2013-11-29 2013-11-29 一种13c水稻愈伤组织制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310617358.4A CN103609449B (zh) 2013-11-29 2013-11-29 一种13c水稻愈伤组织制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103609449A true CN103609449A (zh) 2014-03-05
CN103609449B CN103609449B (zh) 2015-07-29

Family

ID=50160186

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310617358.4A Active CN103609449B (zh) 2013-11-29 2013-11-29 一种13c水稻愈伤组织制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103609449B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107793209A (zh) * 2016-08-30 2018-03-13 泰生科技香港有限公司 稳定性同位素标记植物的专用培养基、其制备方法及用途
CN109042336A (zh) * 2018-09-30 2018-12-21 天津大学 用含内源菌的水稻种子培养水稻无菌愈伤的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5350688A (en) * 1988-03-31 1994-09-27 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method for regeneration of rice plants
JP2013102698A (ja) * 2011-11-10 2013-05-30 Niigata Univ 高温登熟性イネ
CN103355175A (zh) * 2013-08-07 2013-10-23 无锡求是生物农业有限公司 一种水稻花药愈伤组织的培养方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5350688A (en) * 1988-03-31 1994-09-27 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method for regeneration of rice plants
JP2013102698A (ja) * 2011-11-10 2013-05-30 Niigata Univ 高温登熟性イネ
CN103355175A (zh) * 2013-08-07 2013-10-23 无锡求是生物农业有限公司 一种水稻花药愈伤组织的培养方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHOL GYU LEE ET.AL.,: "Bacterial populations assimilating carbon from 13C-labeled plant residue in soil:Analysis by a DNA-SIP approach", 《SOIL BIOLOGY & BIOCHEMISTRY》, vol. 43, 12 January 2011 (2011-01-12), pages 815 - 3 *
CHOL GYU LEE ET.AL.,: "Growth of methanogens in an oxic soil microcosm: Elucidation by a DNA-SIP experiment using 13C-labeled dried rice callus", 《APPLIED SOIL ECOLOGY》, vol. 58, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 37 - 44 *
JUN MURASE ET.AL.,: "Incorporation of plant residue–derived carbon into the microeukaryotic community in a rice field soil revealed by DNA stable-isotope probing", 《FEMS MICROBIOL ECOL》, vol. 79, 9 November 2011 (2011-11-09), pages 371 - 379 *
TAKESHI WATANABE ET.AL.,: "Carbon flow into ammonia-oxidizing bacteria and archaea during decomposition of 13C-labeled plant residues in soil", 《SOIL SCIENCE AND PLANT NUTRITION》, vol. 57, 16 December 2011 (2011-12-16), pages 775 - 785 *
YONG LI ET.AL.,: "Growth of hydrogenotrophic and acetoclastic methanogens on substrate from rice plant callus cells in anaerobic soil: an estimation to the role of slough-off root cap cells to their growth", 《SOIL SCIENCE AND PLANT NUTRITION》, vol. 59, 21 August 2013 (2013-08-21), pages 548 - 558 *
郭晓丽: "旱稻愈伤组织培养研究", 《湖北农业科学》, vol. 49, no. 2, 28 February 2010 (2010-02-28), pages 271 - 273 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107793209A (zh) * 2016-08-30 2018-03-13 泰生科技香港有限公司 稳定性同位素标记植物的专用培养基、其制备方法及用途
CN109042336A (zh) * 2018-09-30 2018-12-21 天津大学 用含内源菌的水稻种子培养水稻无菌愈伤的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103609449B (zh) 2015-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Rare fungus, Mortierella capitata, promotes crop growth by stimulating primary metabolisms related genes and reshaping rhizosphere bacterial community
JP6796126B2 (ja) 植物形質を向上するための方法および組成物
Chen et al. Genetic improvement and breeding of tea plant (Camellia sinensis) in China: from individual selection to hybridization and molecular breeding
Uga Challenges to design-oriented breeding of root system architecture adapted to climate change
Li et al. Cell wall pectin and its methyl-esterification in transition zone determine Al resistance in cultivars of pea (Pisum sativum)
CN103602743B (zh) 一种用于分子标记辅助育种检测棉花植株对黄萎病抗性的方法
Shi et al. Toxicity mechanisms of nanoplastics on crop growth, interference of phyllosphere microbes, and evidence for foliar penetration and translocation
Meng et al. Application of biodegradable seedling trays in paddy fields: Impacts on the microbial community
Li et al. Infection process of Burkholderia glumae before booting stage of rice
Cui et al. Periphyton effects on bacterial assemblages and harmful cyanobacterial blooms in a eutrophic freshwater lake: a mesocosm study
CN103609449B (zh) 一种13c水稻愈伤组织制备方法
CN102960271B (zh) 一种合浦珠母贝群组旋转交配育种方法
CN107190011A (zh) 一个棉花品质性状关联的编码肌球蛋白的基因
Wu et al. Comparative analysis of the effects of conventional and biodegradable plastic mulching films on soil-peanut ecology and soil pollution
Wang et al. Legume biological nitrogen fixation improves but chemical nitrogen fertilizer suppresses soil nematode communities in a Camellia oleifera plantation
Ao et al. Differentially enriched fungal communities in root rot resistant and susceptible varieties of tobacco (Nicotiana tabacum L.) under continuous monoculture cropping
CN111088390B (zh) 与陆地棉叶片绒毛相关的snp分子标记及其应用
Hong et al. Effects of initial density, nutrient, and water level regime on the seedling survival and growth of Typha orientalis Presl
CN108486273A (zh) 5号染色体上与水稻耐盐qtl紧密连锁的ssr标记的挖掘及应用
Zhou et al. Intercropping system modulated soil–microbe interactions that enhanced the growth and quality of flue-cured tobacco by improving rhizospheric soil nutrients, microbial structure, and enzymatic activities
CN102517398B (zh) 一种快速鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法
CN105504033B (zh) 水稻细胞周期蛋白OsCYCP4；1的应用及提高水稻耐低磷胁迫的方法
CN112889664B (zh) 一种聚合互补抗稻瘟病基因培育广谱、持久抗性水稻育种材料的方法
Pan et al. Long term monocropping effects tobacco yield by regulating rhizosphere allelochemicals and microbial community
Khasanova et al. Quantitative genetic-by-soil microbiome interactions in a perennial grass affect functional traits

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant