CN104885945B - 一种香蕉化学消毒组培方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种香蕉化学消毒组培方法。香蕉化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽。本发明的香蕉化学消毒组培方法，利用化学试剂达到灭菌或抑菌的目的，在配制培养基的过程中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了香蕉组培环节；并且操作简单，只要按不同的培养基配方配制即可；实用性强，推广性好，还可以有效降低香蕉的组培成本，一般可降低成本10％以上。

Description

一种香蕉化学消毒组培方法
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种香蕉化学消毒组培方法，属生物技术领域。
背景技术
香蕉(Musa paradisiaca)是热带和亚热带的主要名果之一,长期以来,由于品种退化,病虫害多,商品化生产受到一定影响,.品质、规格不适应国际市场需要,导致出口数量锐减。因此,恢复和提高香蕉生产,选用良种、加速繁殖是当务之急。
目前具有商品价值的香蕉栽培品种几乎全部是三倍体，由于没有种子，给繁殖和育种带来困难。60年代国外就开始了香蕉组织培养技术的研究，70年代茎尖培养成功。我国香蕉组织培养的实际应用是在80年代中后期。香蕉组织培养技术对香蕉生产尤其是对国内近20年香蕉生产发展的突飞猛进起了十分关键的作用，香蕉组织培养技术的应用使短时间内以良种大面积替换淘汰品种得以实现，使大规模商品化香蕉生产成为可能，香蕉生产的快速发展首先得益于香蕉生物技术的应用。香蕉组培苗具有繁殖速度快、不带病毒、高产优质、生长成熟一致、性状稳定和便于运输等优点，所以目前生产上采用的香蕉种苗90％以上是组培苗。
香蕉组织培养，一方面可以扩大其繁殖系数，从而实现规模化繁殖；另一方面，可以在保存其原有的优良性状的基础上，实现香蕉的种质资源保存和转基因研究等。香蕉组织培养的成本主要包括组培苗生产所需的培养基、设施设备、供电成本、耗材和人工成本。常规的香蕉组织培养方法要求外植体接种在高温高压灭菌后的无菌培养基中才能正常生长，耗能大，人工操作成本高。
发明内容
本发明的目的是提供一种香蕉化学消毒组培方法。通过化学消毒的方法，使培养基不需要进行高温高压灭菌，就能够获得香蕉苗的正常生长。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
本发明的一种香蕉化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：
(1)培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/L次氯酸钠次氯酸钠+10mg/L乳酸链球菌素+100mg/L丙酸钙的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；
(2)培养基配制：诱导培养基为MS+1～5mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/L NAA+50～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；增殖培养基为：MS+1.0～3mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/L NAA+50～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.1～0.5mg/L KT+1～3mg/L NAA+50～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，指6-苄氨基嘌吟；所述NAA，指〆-萘乙酸；所述KT，为6-糠基氨基嘌呤；配制培养基时，先称各培养基配方中蔗糖和琼脂粉用量，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容、然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒后的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
(3)诱导培养：取香蕉吸芽，切去根和顶端，剥去外层包片，并切成高2cm、直径1.5cm的圆锥体；在超净工作台上，采用体积比为75％的酒精消毒2min，用重量比为0.1％的升汞溶液，消毒15～30min，然后用无菌水清洗4次，剥去外层叶鞘，切除基部褐化部分，置入诱导培养基中培养30～50d，诱导出丛生芽；培养温度为27～31℃，光照强度为800～1000Lx，每天光照的时间为12h；
(4)增殖培养：取步骤(3)诱导的丛生芽，切成含有2～4个芽的小块，转接到增殖培养基中培养，30d形成丛生芽；培养温度27～31℃，光照为800～1000Lx，每天光照的时间为12h；30天继代一次，继代培养次数不超过12代；
(5)生根培养：取步骤(4)高度不低于2cm的无根继代苗，转入生根培养基中培养，20～30d生根成苗；培养温度为27～31℃，光照2500～3000Lx，每天光照的时间为12h；
(6)瓶苗移栽：取步骤(5)高度不低于3cm的组培苗，转换至外界自然光温条件下培养7～10d，移栽的环境温度为22～28℃。
本发明的应用效果：
本发明的化学消毒组培方法，利用化学试剂达到灭菌或抑菌的目的，配制的培养基无需高温高压灭菌。因此，对香蕉诱导培养、增殖培养、生根培养各个阶段的影响，除了要考虑常用的评价指标外，还要考虑污染率的问题。
1、诱导培养：本发明的一种香蕉化学消毒组培方法与常规的香蕉组培方法相比，结果如表1所示，诱导培养阶段的外植体培养的成活率和污染率都没有太大差异。
表1本发明的化学消毒组培方法对香蕉诱导培养的影响
组培方式 平均成活率(％) 平均污染率(％)
常规组培方法 57 43
化学消毒组培方法 54 46
2、增殖培养：本发明的化学消毒组培方法对香蕉增殖倍数和污染率的影响如表2所示，试验结果表明，增殖倍数和污染率二个指标都没有太大差异。在瓶苗的生长状况看，本发明的化学消毒组培方法的培养基由于不经过高温高压灭菌，激素和营养元素损失较少，其香蕉组培苗更绿，更壮。
表2本发明的化学消毒组培方法对香蕉增殖倍数和污染率的影响
组培方式 平均增殖倍数 平均污染率(％) 生长状况
常规组培方法 4.5 1.2 苗浅绿、弱
化学消毒组培方法 4.2 0.8 苗绿、壮
3、本发明的化学消毒组培方法对香蕉生根率和污染率的影响：在生根过程中，本发明的化学消毒组培方法与常规的香蕉组培方法相比，结果如表3所示，生根率和污染率都没有太大差异；从瓶苗的生长状况看，用本发明的方法，香蕉组培苗茎更粗，叶片更大。
表3本发明的化学消毒组培方法对香蕉生根率和污染率的影响
4、成本分析：本发明的化学消毒组培方法与常规组培的成本分析，结果如表4所示。本发明的化学消毒组培方法省去了高压灭菌环节，简化了组培程序，提高了工作效率。以每天配制50L培养基计算，每年可以节约5万元左右。另外，还有一些不容易计算的项目，如高压锅维修，安全，节约空间等：
表4本发明的香蕉化学消毒组培方法培养与常规组培的成本分析表
本发明具有如下优点和有益效果：
1.本发明的香蕉化学消毒组培方法中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了香蕉组培环节，降低了香蕉组培成本。
2.本发明的香蕉化学消毒组培方法，操作简单，只要按不同的培养基配方配制即可，实用性强，推广性好。
3.本发明的香蕉化学消毒组培方法与常规的香蕉组培方法对比，可以降低成本10％以上。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。
实施例一：一种香蕉化学消毒组培方法
一种香蕉化学消毒组培方法，包括以下步骤：
(1)培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L乳酸链球菌素+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡10h，保存备用；
(2)培养基配制：诱导培养基为MS+4mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+60mg/L次氯酸钠+6mg/L乳酸链球菌素+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；增殖培养基为：MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+60mg/L次氯酸钠+5mg/L乳酸链球菌素+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.3mg/L KT+2mg/L NAA+60mg/L次氯酸钠+5mg/L乳酸链球菌素+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉+pH5.8；配制培养基时，先称各培养基配方中蔗糖和琼脂粉用量，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容、然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒后的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
(3)诱导培养：从产量高、无病害症状、健壮的母株取回来吸芽，用自来水冲洗干净后，用不锈钢刀将吸芽切去根和顶端，剥去外层包片并切成高2cm、直径1.5cm的圆锥体。在超净工作台上，用体积比为75％的酒精消毒2min，倒掉酒精，再用重量比为0.1％的升汞溶液，消毒20min，消毒过程中要经常摇动以便材料充分灭菌；再用无菌水清洗4次，用解剖刀剥去外层叶鞘，切除基部褐化部分，然后置入诱导培养基中培养30～50d，诱导出丛生芽；培养温度为27～31℃，光照强度为800～1000Lx，每天光照的时间为12h；
(4)增殖培养：取步骤(3)诱导出的丛生芽，切成含有2～4个芽的小块，转接到增殖培养基中，培养30d形成大量的丛生芽；培养温度27～31℃，光照为800～1000Lx，每天光照的时间为12h；30天继代一次，继代培养次数不超过12代；
(5)生根培养：取步骤(4)不低于2cm的无根继代苗，转入生根培养基中，培养20～30d，生根成苗；培养温度为27～31℃，光照2500～3000Lx，每天光照的时间为12h；
(6)瓶苗移栽：将步骤(5)生根培养后高度不低于3cm的组培苗，转换至外界自然光温条件下培养7～10d，移栽的环境温度为22～28℃。

Claims (4)

1.一种香蕉化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：
(1)培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L乳酸链球菌素+100mg/L丙酸钙的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；
(2)培养基配制：诱导培养基为MS+1～5mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/L NAA+50～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；增殖培养基为：MS+1.0～3mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/L NAA+50～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.1～0.5mg/L KT+1～3mg/L NAA+50～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，为6-苄氨基嘌呤；所述NAA，为〆-萘乙酸；所述KT，为6-糠基氨基嘌呤；配制培养基时，先称各培养基配方中蔗糖和琼脂粉用量，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒后的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
(3)诱导培养：取香蕉吸芽，切去根和顶端，剥去外层包片，并切成高2cm、直径1.5cm的圆锥体；在超净工作台上，采用体积比为75％的酒精消毒2min，用重量比为0.1％的升汞溶液，消毒15～30min，然后用无菌水清洗4次，剥去外层叶鞘，切除基部褐化部分，置入诱导培养基中培养30～50d，诱导出丛生芽；培养温度为27～31℃，光照强度为800～1000Lx，每天光照的时间为12h；
(4)增殖培养：取步骤(3)诱导的丛生芽，切成含有2～4个芽的小块，转接到增殖培养基中培养，30d形成丛生芽；培养温度27～31℃，光照为800～1000Lx，每天光照的时间为12h；30天继代一次，继代培养次数不超过12代；
(5)生根培养：取步骤(4)高度不低于2cm的无根继代苗，转入生根培养基中培养，20～30d生根成苗；培养温度为27～31℃，光照2500～3000Lx，每天光照的时间为12h；
(6)瓶苗移栽：取步骤(5)高度不低于3cm的组培苗，转换至外界自然光温条件下培养7～10d，移栽的环境温度为22～28℃。
2.根据权利要求1所述的一种香蕉化学消毒组培方法，其特征在于所述诱导培养基为MS+4mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+60mg/L次氯酸钠+6mg/L乳酸链球菌素+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8。
3.根据权利要求1所述的一种香蕉化学消毒组培方法，其特征在于所述增殖培养基为：MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+60mg/L次氯酸钠+5mg/L乳酸链球菌素+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8。
4.根据权利要求1所述的一种香蕉化学消毒组培方法，其特征在于所述生根培养基为1/2MS+0.3mg/L KT+2mg/L NAA+60mg/L次氯酸钠+5mg/L乳酸链球菌素+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉+pH5.8。
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