CN1628507A - 一种非无菌条件下的植物组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域中的植物组织培养技术，具体地说是在非无菌自然环境条件下的植物组织培养方法。其特征在于植物组织培养的全过程是在非无菌自然环境条件下实施的；它包括：在培养基中添加消毒杀菌剂，制备抑菌培养基；在非无菌自然环境条件下接种；将培养材料置于满足植物组织培养的温度、光照条件的房间或设施内在自然环境条件下进行培养。本发明可以省略掉占总投资比例较大的消毒灭菌设置、工具、材料以及繁琐的环境和各操作环节的严格消毒灭菌手续，从而形成了一种简单、易行、投资少而且可以在非无菌自然环境和条件下的植物组织培养方法，该方法不但能使植物组织正常生长，而且长势明显优于不使用抑菌培养基的常规培养。

Description

一种非无菌条件下的植物组织培养方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域中的植物组织培养技术，具体地说是在非无菌自然环境条件下的植物组织培养方法。

背景技术：

植物组织培养是本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项技术。它是应用无菌操作方法，培养植物的一个离体器官、组织或细胞。经过各国科学家80多年的辛勤探索，几乎所有植物都成功实现了其器官、组织和细胞的离体培养。大多数还能从细胞的一部分，甚至没有细胞壁的裸露的原生质体中，再生出无数的小植株。

植物组织培养技术已成为农业高新技术中最重要、最活跃的领域之一，它不仅是农业继续发展的基础，而且是生物技术中应用最广、最具现实意义的领域，被世人誉为农业发展史上的第四次绿色革命，对解决经济和社会发展所面临的人口增长、农业资源贫乏、环境污染等重大问题，具有十分重要的战略意义。

当前，世界各国政府，都十分重视组培技术研究。在欧美、日本等发达国家把植物组织培养技术用于商品种苗生产，大规模的植物工厂化生产技术已日趋成熟。无论是发达的美国、日本，还是第三世界的印度，都巨额投资。世界已有1000多个‘组培公司’。如美国政府，1989年投资60亿美元的研究开发经费，1992年投入科研经费达42亿美元。美国孟山都公司投资1.65亿美元兴建了生命科学研究中心，英国也投巨资建立了植物研究中心。日本政府建立了“管、产、学”三位一体联合开发体制。仅1990年政府拨款100亿日元，企业资助200亿日元。1996年，日本生物技术研究预算达2050亿日元。欧洲从1985年实施“生物技术行动计划”“新框架计划”等，投资总额为330亿美元。印度政府“八五”计划中，投入45亿卢比。我国政府也制定了“863”高技术发展计划，投资强度较高。“八五”期间每年2亿人民币。“九五”投资强度更大，为我国发展高科技创造了条件。植物组织培养已在快速繁殖、去除病毒、加速育种进程、次生代谢物生产和种质资源的保存等各方面取得巨大的经济效益、社会效益和生态效益。

由于富含营养的培养基既适合植物组织生长发育，更适合杂菌的滋生。在传统的组织培养中，严格的无菌环境、无菌操作、无菌培养成为必备条件，也使该技术成为投资大、成本高、难以普及的主要原因。虽然几十年来，无数科学家在减少污染、降低成本，简化工艺方面做了艰苦努力，均未获得显著突破。因此，现有的植物组织培养技术基本掌握在科研人员手中，大量的科研成果难以走出实验室。在发达国家也仅有100多个以高档名贵花卉、蔬菜为主的植物品种实现了组培产业化。我国仅有香蕉、马铃薯、草莓、兰花等少数实现了组培产业化。

制约植物组织培养技术普及的主要问题是：

1、高投资：为了创造无菌操作和无菌环境，价格昂贵的高压灭菌锅、超净工作台、无菌培养室及培养器皿等成为必备。一个年产10万株组培苗设施投入就高达十几万元。所以，形成了现有组培单位的组培设施基本靠国家投入的局面，而众多种苗生产单位无应用组培技术的财力。

2、高风险：在现有的组培中，尽管有完备的无菌操作环境和设施，尽管有技术熟练的科研人员或操作人员的操作，组培苗被污染的情况仍时常发生，控制较好的，污染率在10％左右，稍有不慎，污染率可达20-30％，有的高达50％以上。因全军覆没而导致珍贵植物材料损失的情况也时有发生。因此组培苗被污染成为科研和生产人员最为担心的问题。

3、炼苗期长、成活率低：常规技术组培苗要成为生产用苗必须经过室内炼苗、温室炼苗阶段。由于在密闭无菌环境长成的组培苗普遍弱小，导致了在炼苗阶段的缓苗期长、死亡率高，通常因炼苗而死亡的组培苗草本植物为20-30％，木本植物为30-40％。

由于上述原因，导致组培苗生产成本过高，也限制了该技术的普及应用。减少和控制污染成为解决问题的关键

为了解决污染问题，几十年来，各国科学家做了不懈的努力，也曾做过在培养基中添加各种抗生素、杀菌剂的试验，例如，Philips，R.等，Piant Sci.Lett，21：235-240(1981)；Pullock，K.等Plant Cell Reports，2：36-39(1983)；Gilbert，J.E.等，Ann.Appl.Biol，119：113-120(1991)；Macek，T.等，Biotechnology Techniques，8(12)：885-888(1994)；Franck，D.A.，Aquatic Botany，26：113-117(1986)；Haldeman，J.H.等，Hortscience，22(2)：306-307(1987)；Kneifel，W.和Leonhardt，W，Plant Cell，Tissue andOrgan Culturer，29：139-144(1992)。利用杀菌剂解决组培污染的专利有日本的4-311326，9-235208，7-255305，7-255306，3-297331，10-313717；国内的有专利申请号为00128614.5，87104410A，98121867.9等。这些试验和专利虽然在一定程度上可以减少和防止污染的发生，但均未形成在非无菌条件下，不改变常规培养基配方的全过程的植物组织培养。

日本日清纺绩株式会社的00128614.5专利通过添加抗菌剂、去除琼脂和糖分有利于实施非无菌培养，但定量施加二氧化碳补充碳源和用蛭石、纤维替代琼脂的方式又增加了新的技术难点和投资，与目前国内外通用的人们已普遍掌握的组培技术差距太大，难于推广应用。

昆明环境科学研究所在国家科委的支持下，引进了日本的这项技术，并形成了“一种无糖箱式植物组织的培养方法”的专利申请(申请号为98121867.9)，该专利申请由于必须有有机玻璃箱、二氧化碳净化供应系统的高投入，特别是依然没有脱离无菌环境和操作，只能用于科研，无法为生产应用。

发明内容：

为了解决在植物组织培养中，因微生物污染而导致的高投入、高风险、炼苗期长、成活率低、成本过高等问题，为了使这项生物技术能够在中国普及、特别是能为广大农民所用，本发明人提出了一种可以在接近于作物自然生长的自然条件、即在无需进行任何严格消毒灭菌处理的非无菌自然环境条件下，进行植物组织培养的方法。

本发明所述植物组织培养方法的全过程是在非无菌自然环境条件下实施的；该方法特点包括：在培养基中添加消毒杀菌剂，制备抑菌培养基；在非无菌自然环境条件下接种；将培养材料置于无需进行特别无菌处理的，任何能满足培养材料生长发育的温度、光照条件的房间或设施内在自然环境条件下进行培养。

本发明提供了在常规植物组织培养基中添加消毒杀菌剂制备抑菌培养基的技术，添加消毒杀菌剂制得的抑菌培养基可以有效地防止细菌、真菌的生长，因此可以省略掉占总投资比例较大的消毒灭菌设置、工具、材料以及繁琐的环境和各操作环节的严格消毒灭菌手续，从而形成了一种简单、易行、投资少而且可以在非无菌自然环境和条件下的植物组织培养方法，该方法不但能使植物组织正常生长，而且长势明显优于不使用抑菌培养基的常规培养。

本发明所述的用于制作抑菌培养基的常规培养基的配方是指在常规植物组织培养中常用的固体或液体培养基的配方，它含有一定无机盐、植物激素、维生素、糖类、琼脂等。其具体配方可参照现有有关常规组织培养的手册和书刊。

本发明所述的植物组织培养方法中所说的制作抑菌培养基过程中添加的消毒杀菌剂，可以是苯甲酸类或山梨酸类或醛类或酚类或含氯化合物类或季胺盐类或脲类或胍类或恶唑烷类或聚阳离子类或含银制剂类或两性表面活性剂类或天然消毒杀菌剂。

消毒杀菌剂在常规培养基中的添加用量范围一般为0.001～10g/L(指每立升培养基中添加杀菌剂的克数。以下同。)个别的如苯甲酸钠、山梨酸钾等上限可扩大至25g/L。

依据添加不同量的杀菌剂的抑菌培养基的抗污染能力和对种子发芽率、组培苗分化、生根等影响的综合评价分析，本发明人确认消毒杀菌剂的优选的用量范围为0.01～5g/L。

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是氯胺B，它的分子式是C₆H₅CINO₂SNa·2H₂O，其添加量为0.001～4g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是氯胺T，它的分子式是C₇H₇CINO₂SNa₃·3H₂O，其添加量为0.005～5g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是二氯异氰尿酸钠，它的分子式是C₃O₃N₃Cl₂Na，其添加量为0.01～3g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是三氯异氰尿酸，它的分子式是C₃O₃N₃CL₃，其添加量为0.001～1g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是二氯二甲基乙内酰脲，它的分子式是C₅H₆Cl₂N₂O₂，其添加量为0.001～1g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是甲酚，它的分子式是C₇H₉O，其添加量为0.05～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是氯代酚，它的分子式是C₆H₅ClO，其添加量为0.05～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是洁而灭，它的分子式是C₂₁H₃₈NCl，其添加量为0.02～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是新洁而灭，它的分子式是C₂₁H₃₈NBr，其添加量为0.02～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是度米芬，它的分子式是C₂₂H₄₀BrNO，其添加量为0.02～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是消毒净，它的分子式是C₂₀H₃₆NBr，其添加量为0.02～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是氯化二甲基二癸基铵，它的分子式是C₂₂H₄₈NCl，其添加量为0.002～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是溴化二甲基二癸基铵，它的分子式是C₂₂H₄₈NBr，其添加量为0.002～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是十二烷基二氨基乙基甘氨酸，它的分子式是C₁₂H₂₅NHC₂H₄NHC₂H₄NHCH₂COOH，其添加量为0.01～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是洗必泰，它的分子式是

C₂₂H₃₀N₁₀Cl₂·2HCl，其添加量为0.005～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是聚六亚甲基双胍盐酸盐，它是高聚物，其添加量为0.01～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是磺胺嘧啶银，它的分子式是C₁₀H₉O₂N₄SAg，其添加量为0.5～10g/L；或

本发明添加的可以是对氨基苯磺酸银，它的分子式是C₆H₇O₃N₂Ag，其添加量为0.1～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是苯甲酸，它的分子式是C₇H₆O₂，其添加量为0.5～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是苯甲酸钠，它的分子式是C₇H₅NaO₂，0.2～25g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是山梨酸，它的分子式是C₆H₈O₂，其添加量为0.1～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是山梨酸钾，它的分子式是C₆H₇O₂K，其添加量为0.1～25g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是尼泊金甲酯，它的分子式是C₈H₈O₃，其添加量为0.01～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是尼泊金乙酯，它的分子式是C₉H₁₀O₃，其添加量为0.01～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是尼泊金丙酯，它的分子式是C₁₀H₁₂O₃，其添加量为0.01～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是尼泊金丁酯，它的分子式是C₁₁H₁₄O₃，其添加量为0.01～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是咪唑烷基脲，它的分子式是C₁₁H₁₆N₈O₈，其添加量为0.05～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是双咪唑烷基脲，它的分子式是C₈H₁₄N₄O₇，其添加量为0.05～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是布罗波尔，它的分子式是C₃H₆O₄NBr，其添加量为0.01～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是道维希尔-200，它的分子式是C₆H₁₂N₄(CH₂CHCHCl)Cl，其添加量为0.005～5g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是三氯生又名玉洁新DP300，它的分子式是C₁₂H₇C₁₃O₂，其添加量为0.01～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是甘宝素(又名活性甘宝素、二唑酮)，它的分子式是C₁₅H₁₇O₂Cl，其添加量为0.001～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是三氯卡巴又名三氯碳酸苯胺，它的分子式是C₁₃H₉Cl₃N₂O，0.001～2g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是DMDM乙内酰脲，它的分子式是C₇H₁₂N₂O₄，其添加量为0.05～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是Germall-Plus又名乔曼-Plus，它是C₈H₁₄N₄O₇与C₈H₁₂INO₂的混合物，其添加量为0.02～5g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是对氯间二甲苯酚，它的分子式是C₈H₉ClO，添加量为0.05～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是富马酸二甲酯，它的分子式是C₆H₈O₄，添加量为0.05～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是琼脂低聚糖，其添加量为0.01～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是蜂胶黄酮防腐抗氧化剂，它是白杨素，良姜素，高良姜素，金合欢素，洋芹素，山萘素，鼠李素的混合物，其添加量为0.01～10/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是鱼精蛋白，它是碱性蛋白质，常与核酸结合，其添加量为0.01～10g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是肉桂醛，它的分子式是C₉H₈O，其添加量为0.01～5g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是乳酸链球菌素，它是34个氨基酸组成的多肽，0.01～2g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是二甲基恶唑烷或7-乙基二环恶唑烷，其添加量为0.01～5g/L；或

本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是聚苯乙烯基聚阳离子或聚环氧丙烷基聚阳离子化合物，其结构如式I和式II

其中

或

R₁＝-CH₃，-CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₂CH₃，-CH₂C₆H₅，-CH₂CH＝CH₂，-CH₂CH＝CHX，-CH₂CH₂OH，-CH₂CH(OH)CH₃；

R₂＝-CH₃，-CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₂CH₃，-CH₂C₆H₅，-CH₂CH＝CH₂，-CH₂CH＝CHX，-CH₂CH₂OH，-CH₂CH(OH)CH₃；

R₃＝-CH₃，-CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₂CH₃，-CH₂C₆H₅，-CH₂CH＝CH₂，-CH₂CH＝CHX，-CH₂CH₂OH，-CH₂CH(OH)CH₃

或者

R₁＝-CH₃，-CH₂CH₃

R₂，R₃＝-COCH＝CHS-，-COCH＝CClS-；

X＝Cl或Br；

n＝2～500单元。当n值小于50个单元时，相应材料有较好的水溶性。

该类化合物在培养基中的添加量为0.01～8g/L。

该类化合物分子和分子量大，不易内吸，对植物组织的生长无抑制作用，同时具有相

当高的抑菌效果。

在上述式II中，当

R₁＝-CH₃，R₂，R₃＝-CH₂CH＝CHCl

或者R₁＝-CH₃，R₁＝-CH₃，R₂，R₃＝-COCH＝CHS-

或者R₁＝-CH₃，R₂，R₃＝-COCH＝CClS-时，分别为化合物1，化合物2，化合3。

该三个化合物可以单独使用，也可以复合使用，其在培养基中的总添加量为0.01～8g/L；当复合使用时，其用量比例为化合物1∶化合物2∶化合物3＝0～0.5∶1∶1～3。

依据添加不同量的该杀菌剂的抑菌培养基的抗污染能力和对种子发芽率、组培苗分化、生根等影响的综合评价分析，本发明人确认，该类杀菌剂总添加量的优选范围为0.1～5g/L。

化合物1、化合物2、化合物3的具体化学名称和化学结如下：

化合物1：含氯化-甲基二(3’氯烯丙基)铵盐基团的聚环氧丙烷

化合物2：含氯化N-甲基-N，N-硫烯丙酰基铵盐基团的聚环氧丙烷

化合物3：含氯化N-甲基-N，N-硫氯烯丙酰基铵盐基团的聚环氧丙烷

上述三个化合物结构式中n＝30～70。

化合物1、化合物2、化合物3的制备方法如下：

1)制备聚环氧氯丙烷

以少许酸作引发剂，将环氧氯丙烷慢慢滴入反应器中，在50℃下进行开环阳离子聚核反应，待加料毕，继续保温反应4h即可。

2)制备聚阳离子化合物

将聚环氧氯丙烷与甲基二(3’-氯烯丙基)胺在50℃下反应10h，再将料液处理至中性，然后以水做介质进行超微过滤(滤膜分子截取值为200)，除去小分子，再浓缩产品浓度至30％左右即可得化合物1。

将聚环氧氯丙烷与N-甲基-N，N-硫烯丙酰基胺在70℃下反应16h，再将料液处理至中性，然后以水做介质进行超微过滤(滤膜分子截取值为200)，除去小分子，再浓缩产品浓度至30％左右即可得化合物2。

将聚环氧氯丙烷与N-甲基-N，N-硫氯烯丙酰基胺在70℃下反应20h，再将料液处理至中性，然后以水做介质进行超微过滤(滤膜分子截取值为200)，除去小分子，再浓缩产品浓度至30％左右即可得化合物3。

本发明所述的抑菌培养基包括固体抑菌培养基和液体抑菌培养基。

本发明所述的固体抑菌培养基的制作工艺是：按培养植物需要的常规培养基配方，配制加有无机盐、糖、激素和琼脂的混合液，将其加热至琼脂完全溶化，然后添加所选用的一定量的杀菌剂，搅拌均匀后，分装至培养容器中。

本发明所述的液体抑菌培养基的制作工艺是：按培养植物需要的常规培养基配方，配制加有无机盐、糖、激素的水溶液，然后添加所选用的一定量的杀菌剂，搅拌均匀后，分装至培养容器中。

使用本发明所提供的方法制备的抑菌培养基，可以有效的防止和减少植物组织培养过程中微生物的污染，并保证种子正常发芽和植物组织、器官、细胞以及培养苗的正常发育生长。

本发明所提供的抑菌培养基可用于植物的叶、茎、根、芽、花、胚、分生组织、愈伤组织等的接种和培养。

本发明所说的接种是在非无菌自然环境条件下将上述植物组织接种在抑菌培养基中，除无需进行严格无菌处理程序外，具体接种操作手续与常规组培的接种手续相同。

接种后，可将装有接种培养材料的培养容器，置于无需进行无菌处理的任何能满足培养材料生长发育的温度、光照等条件的房间或设施内在自然环境条件下进行培养，具体温度、光照等条件与培养材料与常规组培时所需的条件相同。

由于使用了抑菌培养基，因而本发明所述的植物组织培养方法中的接种及培养操作过程中无需再进行严格的无菌处理，改变了常规植物组织培养全过程中必须进行严格无菌处理的传统观念，可以省略投资较高的超净工作台、紫外灯等设备及严格无菌的环境设施，并省略了繁琐的消毒手续。

本发明所提供的植物组织培养方法是一种全新的低投入、低成本、高效率、高效益的在非无菌的自然环境条件下的植物组织培养方法，也可以称为是一种开放式的植物组织培养方式。

传统的植物组织培养方式均是在严格控制无菌的封闭条件下进行的，将自然环境生长的植物置于人为创造的光照、温度和密闭无菌的环境，极易产生特殊的玻璃化、褐化、黄化等难以解决的问题，必然出现生长缓慢、瘦弱、炼苗期长、死亡率高等不良后果。另外，无菌操作是所有常规植物组培的一项严格要求，如要对培养基、培养容器高压、高温灭菌，任何用于操作和处理植物组织的器具都要消毒，其操作过程都必须在无菌环境如超净工作台内进行。即使熟练的技术员最严格地使用无菌技术，细菌、真菌污染几乎无法避免，甚至出现灾难性的损失。因此，寻找一种使组培植物在适宜的自然环境生长，免除繁杂的无菌培养过程、大幅度降低生产成本，使组培技术走出实验室并为农民所掌握的方法将是极为重要的。

本发明与“传统无菌组培”相比，具有以下特点：

简化环节，节省投资

“非无菌组培”无需高压灭菌、无菌接种和无菌培养，省去昂贵的高压灭菌锅和超净工作台，将操作困难、易损的玻璃器皿更换为价格低廉、操作简便的塑料杯、塑料盒或塑料袋，一次性投资节省80％以上，降低了应用组织培养技术的门槛。

幼苗质量好，生产成本低

本发明“非无菌组培”是在有杂菌存在的自然环境中接种、自然阳光光照培养环境中进行培养，组培苗生长势强，常见的玻璃化、褐变等影响正常生长问题大为缓解；组培苗向商品苗过度期的炼苗、缓苗时间短，成活率高达95％以上。

本发明“非无菌组培”的生产费用比常规“无菌组培”节省78％。“无菌组培”的单苗成本为0.2106元，“非无菌组培”的单苗成本仅为0.0671元(详见附表)。

植物组织培养将向产业化分工协作转化

传统的组培方式，无论科研或生产单位，都要完成从培养基配方研究到制作生产，从外植体处理、增殖扩繁到炼苗出苗的全过程。这种“小而全”的方式已经阻碍了植物组培的进步与发展。

“非无菌组培”方式可将‘抑菌培养基’从“小而全”的传统方式中逐渐分离成专业化、系列化、商品化生产，也促使组培苗生产和商品苗生产相互独立，最终使组培技术能按产业化模式运行。

广泛应用于资源保护、利用

只有依靠种子、整株植物、适宜季节才能完成的濒危植物抢救、野生资源收集、种质资源保存、优良品种国内外交换、杂交亲本的繁殖等繁杂工作，将被本发明非无菌组培技术取代。此前，一个濒危植物、珍贵野生物种、国外优良品种、甚至杂交种子亲本必须在适宜的季节，由其所产种子获得；而今，在任何季节都可以依靠非无菌组培技术以任何方式采集和交换植物的组织、茎尖等繁殖材料。

以下以列表对比的方式说明本发明所述的植物组织培养方法与在严格无菌条件下的常规组织培养技术的不同点及其优异效果

表一：常规组培与本发明非无菌组培操作技术要点和步骤对照

操作步骤	常规组培操作要点	本发明组培操作要点
			1、培养基制备	1)、首先配制和保存母液，母液浓度较高，用时按比例稀释。2)、按照所需的培养基配方，把水、母液、糖、琼脂等按比例配好，加热使琼脂完全溶解。琼脂必须完全溶解，以免造成浓度不均匀。3)、调PH值。用PH试纸或酸度计调整培养基的PH值后，即可分装。一般用氢氧化钠和盐酸调节培养基的PH。培养基的PH值直接影响培养物对离子的吸收，从而影响植物的生长，此外PH值还影响到培养基的凝固。因此，要严格培养基的PH值调节。	1)、同常规组培。2)、同常规组培。3)、同常规组培。4)、添加消毒杀菌剂。在琼脂加热溶解后，加入消毒杀菌剂，搅拌均匀。
2、培养器皿洗涤、干燥	不干燥的培养器皿容易造成杂菌污染，因此洗涤后的培养器皿一般放到烘箱里，120℃的高温烘干，以减少污染。	培养器皿不需要严格的高温烘干，干净干燥即可。
			3、培养基分装	1)、培养基加热溶解后，趁热分装。配置好的培养基要趁热分装，琼脂一般在40℃时凝固。分装时要注意不能将培养基沾到培养瓶的壁上，以免引起污染。2)、分装后立即加上棉塞或盖子。由于未经灭菌的培养基带有各种杂菌而且也是各种杂菌的良好生长场所，因此分装后应立即灭菌。不能及时灭菌时，培养基最好放在冰箱里以防杂菌污染。	1)、培养基加热溶解后，趁热分装。配置好的培养基要趁热分装，琼脂一般在40℃时凝固。2)、分装后的培养基加上棉塞、盖子或用塑料薄膜封口，冷却后即可接种。
4、高压蒸汽灭菌	培养基分装后，进行高压灭菌。灭菌温度一般维持121℃20分钟即可。灭菌消毒时间不宜过长，也不能超过规定的压力范	培养基不用高温高压灭菌，可直接接种。减少了有机营养物质的分解。

	围，否则，蔗糖、有机酸、维生素等有机物质就会分解，使培养基变色、变质、甚至难以凝固。
			5、培养材料的选择和灭菌	初次培养的植物，要从植物体上取下一块组织，先进行消毒灭菌，再进行培养，获取无菌培养材料。材料多取自田间，带有大量病菌。消毒是为了消灭病菌，以保证无菌组织培养的进行。常用的消毒药品为：漂白粉(饱和溶液，5-30分钟)、2-10％次氯酸钠(10-15分钟)、0.1-1％的升汞(2-10分钟)、75％酒精0.2-2分钟)、10％双氧水(5-15分钟)等。不同种类的植物组织对不同种类、不同浓度的消毒剂敏感度不一样，一般要进行摸索才能达到最佳效果，即要把材料上的病菌消灭，又要保证培养材料的活性。消毒后用无菌水冲洗3次后方可接种。	同常规组培。
6、培养材料接种	1、培养基冷却凝固后即可接种。首先是工具物品的准备和消毒。材料的接种是严格的无菌操作过程，要用专用的接种工作台。接种用的工具，如解剖刀、剪子、镊子等要随培养基同时高温灭菌，接种工作台等接种环境要用70％酒精和紫外线严格灭菌，接种过程要严格遵守无菌操作过程。2、其次是接种室的消毒。常规植物组织培养技术是无菌培养操作技术。接种过程中污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子。因此，每次接种前应进行地面的清洁卫生工作，并用70％的酒精喷雾使空气中的灰尘沉降，并用紫外线照射20分钟。3、接种时，工作人员要使用工作服、帽子、口罩等，要经常保持干净，并定期进	常规接种的每个环节都是在严格的无菌环境条件下进行。本发明组培在一个简单消毒的桌面上即可，不用专门的接种工作台。

	行消毒；接种前要用70％的酒精擦洗。工作人员呼吸、说话、咳嗽等都可能产生污染，因此要带口罩，并禁止谈话。4、材料的分离、切取和接种也要遵守严格的无菌操作要求。较大的材料用肉眼观察即可操作分离，较小的材料需要再解剖镜下操作。切割等操作要快，尽量减少组织损伤和组织氧化现象发生。接种时要防止交叉污染的发生，通常再无菌滤纸上切取材料。用过的刀、镊子等工具使用一次后都应放入70％的酒精中浸泡，然后灼烧放凉备用。5、接种过程必须在无菌的接种工作台上进行。接种的具体操作为：左手拿三角瓶或试管，右手轻轻打开封口纸，将三角瓶或试管倾斜，使瓶口靠近酒精灯火焰，将瓶口在火焰上燎数秒钟，以防止瓶口杂菌污染，然后用右手的小指和无名指配合轻轻取出瓶塞。再将瓶口再火焰上旋转烧数秒，然后用镊子将外植体送入瓶中。外植体材料在培养容器内要分布均匀，茎尖、茎段等基部要插入固体培养基内固定，叶片通常背面接触培养基。镊子等工具接种后要消毒。接种后，培养瓶瓶口在火焰上旋转烧数秒，后在靠近火焰处封口，做好标记。
			7、初代培养	初代培养的特点是污染率高成功率低。初代培养是诱导田间采的培养材料朝我们预先设计的方向发展，为进一步继代培养、扩繁增殖奠定基础。组织培养的成功，首先在于初代培养，建立起无菌外植体。初代培养的成功需要严格的无菌环境、合适的组织器官和适宜的培养基。要找出最佳的培养基和培养条件，需要熟练而严格	严格无菌环境有利于初代培养，但开放式培养对环境的要求不用那么严格。因此本发明培养使得初代培养变的更加容易，可显著降低污染率，大大提高成功率。

	的无菌操作。它是继代培养和扩繁增殖的基础。初代培养也要遵守严格的无菌操作过程。
			8、增殖和继代培养	这是一个不停的“接种—培养—再接种—再培养”的过程。在获取无菌的初代培养物后，根据需求进行继代培养。这一过程要不停的改进培养基达到最佳，提高繁殖速度，达到大量繁殖的目的。这也要遵守严格的无菌操作过程。	就象前面的培养材料接种一样，不需要严格的无菌环境。
9、组培苗生根培养	生根的方式可简单分为试管内生根和试管外生根。试管内生根需要专门的生根培养基和完整的培养基灭菌、接种、培养等过程，培养过程复杂费用高，一些商业性实验室认为生根过程成本占总成本的35～75％。因此，采用瓶外生根成为发展趋势。瓶外生根培养主要有种两种方式：一是在试管内诱导根原基后移栽生根，二是在生根小室内直接生根和炼苗。	同常规组织培养。
			10、生根苗移栽	试管苗移栽过程复杂移栽工序和方法对成活率影响很大，一般要从水分、空气湿度、光照和温度等多方面考虑栽培措施。	由于本发明非无菌组织培养不需要严格的无菌环境，因此它可以边培养边炼苗，培养的组培苗苗壮，移栽成活率高。

表二：本发明非无菌组培与常规组培经济效益对比表(以生产100万组培苗为例)

	常规组培		本发明组培
					数量	金额(万元)	数量	金额(万元)
	1.生产种苗成本	100万株	21.06单株成本0.2106元	100万株					6.71单株成本0.0671元
2.主要投资高压灭菌锅超净工作台容器培养室						16.2	——	3.00
	1台	3.00	——	——
					4台	3.20	——	——
	100000	7.00	100000	1.00
					60	3.00	40	2.00

3.运行费用运送费洗涤费仓储费损耗费人工搬运灭菌电费光照电费空调电费污染损失折旧费		21.22		6.71
						3.00		0.2
		1.00		--
						0.60		0
	30％	3.00	5％	0.01
						0.50		0
		0.6		0.20
						8.40		4.20
		1.50		0.30
					5％	1.00		--
	10％	1.62		0.15
					4.环境	无菌		可以有菌
5.过程	15个环节		10个环节
					6.应用范围	几种脱毒育苗，高档名贵植物快繁繁育，濒危物种抢救，育种等。		多种脱毒育苗，各种植物快繁繁育，濒危物种抢救，野生资源采集，育种，遗传克隆教具等。
7.产业化分工协作	各单位独立完成组培全过程，不能相互协作、交流，重复投资、重复劳动、重复生产、技术封锁情况严重。		标准化的抑菌培养基将促使组培形成产业化的分工协作：科研单位主要研究新配方、新领域，抑菌培养基将由专业公司生产，种苗单位仅设培养室就可以大量生产组培苗

表三：常规组培与本发明非无菌组培的产业化生产工艺流程及机械设备配置对比。

作业线		作用内容		设备设施配置
						常规组培	本发明非无菌组培	常规组培	本发明非无菌组培
		1	培养基生产	玻璃器皿、衣物洗涤	无					洗瓶机、洗衣机、干燥箱	无
培养基配置	培养基配置					蒸馏水器、天平、冰箱、分装机	天平、冰箱、分装机
				培养基灭菌消毒	无			高温、高压消毒器	无

2	组培苗生产	无菌接种	非无菌接种	超净工作台	无
						组培苗人工温、光培养	组培苗自然、半自然、人工温、光培养均可

表四：常规组培与本发明非无菌组培接种工序对比。

步骤	常规无菌操作	本发明非无菌操作
			1接种室	房间要洁净密闭，必须安装紫外灯或臭氧发生器和超净工作台等灭菌、除菌设备，接种前有对房间进行严格灭菌。	房间整洁即可
2超净工作台检查与消毒	①定期检查超净工作台的灭菌效果。②操作前，用紫外灯照射15-20分钟，然后启动超净工作台，吹风10-15分钟后使用。	无
			3接种过程	①接种前，工作人员必须肥皂洗手，操作中随时用75％酒精擦手②将培养瓶、刀、镊子、酒精灯等置于超净工作台内。③打开培养瓶盖或拔棉塞前，要用酒精灯火焰烧瓶口，接种后也要在火焰上方盖瓶盖或瓶塞。④在无菌纸或经灭菌的垫板切割接种材料，每接完一瓶材料，要更换新的无菌纸或垫板。⑤切割材料的刀、镊子要	①接种前，工作人员必须肥皂洗手②将培养瓶、刀、镊子、酒精灯等置于实验台、工作台或桌子等均可。③在无菌纸或经灭菌的垫板切割接种材料，每接完一瓶材料，要更换新的无菌纸或垫板。④切割材料的刀、镊子要浸泡在75％的酒精中。⑤操作人员不必穿工作服、戴口罩、戴帽子

浸泡在75％的酒精中，每接种一瓶材料前、后，都要在酒精灯灼烧消毒。⑥在超净工作台的前1/3-1/2处自右至左摆放浸泡刀镊子的酒精瓶、酒精灯、无菌纸(垫板)。⑦操作人员要穿工作服、戴口罩、戴帽子，避免头部伸入超净工作台的台面上方。

本发明所述的非无菌组织培养的市场前景：

1.目前，进口的优质特种蔬菜、瓜果成为市场抢手货，而这些品种种子价格昂贵，如樱桃番茄、彩色辣椒等部分杂交品种的价格超过了黄金，卖到农民手中价格高达每克100多元人民币，一粒种子能卖到一元多。应用本发明“开放式组培”，只需少量种子或从田间采摘部分茎尖，就可以克隆出几十万、几百万、上千万市场急需的、质优价廉的种苗。而这一技术乡镇、村甚至一家一户都能掌握。面对庞大的蔬菜、瓜果市场，无论是大量克隆种苗，还是转让“非无菌组培”技术都有巨大的潜力。

2.我国花卉产业每年以35-40％速度递增，1999年栽培面积已达12.2万公顷(居世界第一)，产值达540亿元人民币。由于产品质量差，出口交易额为2.8亿美元，仅占世界交易额的0.4％(而同期荷兰花卉出口交易额达337.2亿美元，占世界贸易的45％)，每公顷产值仅为荷兰的1.7％、以色列的5.9％、哥伦比亚的7.7％。在花卉质量构成中，种苗因素占到50％以上，而荷兰花卉种苗基本靠组织培养生产。因此，“非无菌组培”可迅速提高我国花卉种苗质量，缩小与发达国家的差距，增强产品的国际市场竞争力。

3.中国是一个低森林覆盖率的国家，每年都投入巨资植树造林。2002年，全国造林绿化突破1亿亩，对林业的投资达到347亿元，比2001年增加167亿元。今年全国计划营造林任务1.6亿亩，需各种苗木226亿株。从全国苗木拥有量看，已供过于求，但地区性、结构性矛盾仍很突出，许多适宜的优良树种在短期内依靠扦插、嫁接无法满足数量需要；依靠常规的“无菌组培”又无法满足价格低廉的要求。因此，本发明“非无菌组培”有可能成为植树造林、退耕还林、还草等国家级绿化工程、生态环境治理的重点应用技术。

4.进入21世纪，“让森林走进城市、让城市融入森林”已成为提升城市形象和竞争力、推动区域经济持续健康发展的新理念，城区绿岛、城边绿带、城郊森林将成为各城市竟相发展的基本模式。国务院有关部门已经做出规划：到2050年，全国70％以上的城市林木覆盖率要达到45％以上，实现“城在林中、路在绿中、房在园中、人在景中”，建成以森林为主体，分布合理、植物多样、景观优美的城市森林生态网络体系。“绿色奥运”的生态理念将使北京成为人均绿地面积最高的城市；上海每年将投入40亿元用于绿化和造林，到2020年全市森林面积将达到1900平方公里；到2005年，深圳城市绿化覆盖率将达到48％以上，人均公共绿地面积达到16平方米；安徽省有十个县完成了森林生态网络规划；江苏省启动了“绿色江苏行动”，大幅度增加森林植被。在全国各地，以“城市森林”计划为投资主体的建设高潮已经形成。

5、次生代谢物提取

药用植物有效成分的产量、质量、受其遗传性、生长条件、收获时间及贮藏和运输等因素影响很大，采用组织培养，生产有效成分，就可克服这些缺点，这对生长条件要求严格、生长缓慢、产量低、价值贵重的植物药更有意义。目前药用植物的组培主要有两个方面：一是快繁大量种苗以满足人工栽培需要；二是通过愈伤组织或悬浮细胞的大量培养，直接提取药物，或通过生物转化、酶促反应生产药物。我国有5000多种野生药用植物，但传统的获取方式是以采集和消耗大量野生资源为代价，当采集量超过自然再生时，必然导致物种的濒危甚至灭绝，加之自然环境恶化，许多药用植物已呈匮乏之势。《中国植物红皮书》收载了388种国产珍稀濒危野生植物，其中有药用价值的约100余种。目前，我国从药用植物培养中产生的有效成分已有200多种，如人参组培提取人参皂甙已进入产业化；因紫杉醇奇特药效而濒临灭绝的红豆杉正在依靠组培获得保护。

具体实施方式

现以列表的方式介绍本发明的具体实施方式和效果。

一：抑菌培养基制作

植物组培所使用的培养基种类很多，如MS、VW、WH、N6、WS等，其中MS培养基应用最为广泛，以下为MS培养基的配制过程：

1、配制工作母液。将大量元素和微量元素配制成所需浓度的100倍工作母液。如表五

表五

母液编号	药品名称	含量g几
			1	硝酸铵磷酸二氢钾硼酸硫酸锰硫酸锌碘化钾钼酸钠	165170.622.230.860.0830.025

	硫酸铜氯化钴	0.00250.0025
			2	硝酸钾	190
3	氯化钙	44
			4	硫酸镁	37
5	硫酸亚铁EDTA二钠	2.783.73
			6	肌醇烟酸盐酸吡哆醇盐酸硫胺素甘氨酸	1000.050.050.010.2

2、配制培养基。在干净的容器中加入表五中1-6号MS培养基母液各10毫升，然后加入所需的植物生长调节剂、糖、琼脂，最后加入洁净水至1L。

3、调整PH值。用1mo1/L盐酸或氢氧化钠调整pH值，大多数植物适宜pH值为5.3-6.0的培养基。

4、加热溶化琼脂。将调整好pH值的培养基加热至琼脂溶化。加热时需不断搅拌，以防琼脂、糖沉淀而烧焦或溢出。

5、加入消毒杀菌剂。琼脂充分溶化后，停止加热，并添加所选定的一定量的杀菌剂。可选用的杀菌剂及其用量的具体实施例见表六：

表六抑菌培养基中添加的消毒杀菌剂品种及用量的实施例

实施例序号	消毒杀菌剂名称	消毒杀菌剂用量
			1	洁而灭	0.2
2	洁而灭	5
			3	溴化二甲基二癸基铵	0.01
4	溴化二甲基二癸基铵	4
			5	氯化二甲基二癸基铵	0.01
6	氯化二甲基二癸基铵	4
			7	十二烷基二氨基乙基甘氨酸	0.02
8	十二烷基二氨基乙基甘氨酸	5
			9	聚六亚甲基双胍盐酸盐	0.03
10	聚六亚甲基双胍盐酸盐	2
			11	苯甲酸钠	0.5

12	苯甲酸钠	10
			13	山梨酸钾	0.3
14	山梨酸钾	10
			15	咪唑烷基脲	0.1
16	咪唑烷基脲	5
			17	双咪唑烷基脲	0.1
18	双咪唑烷基脲	5
			19	布罗波尔	0.05
20	布罗波尔	5
			21	道维希尔	0.01
22	道维希尔	5
			23	甘宝素	0.05
24	甘宝素	5
			25	乳酸链球菌素	0.02
26	乳酸链球菌素	2
			27	聚阳离子类化合物1	0.1
28	聚阳离子类化合物1	4
			29	聚阳离子类化合物2	0.1
30	聚阳离子类化合物2	5
			31	聚阳离子类化合物3	0.1
32	聚阳离子类化合物3	4
			33	聚阳离子类化合物2+聚阳离子类化合物3	0.1+3
34	聚阳离子类化合物2+聚阳离子类化合物3	2+2
			35	聚阳离子类化合物1+聚阳离子类化合物2+聚阳离子类化合物3	0.2+2+2
36	聚阳离子类化合物1+聚阳离子类化合物2+聚阳离子类化合物3	0.1+1+3

6、培养基分装。将已配制好的培养基在没有冷却之前分装到培养容器中，分装时可以手工进行，也可以机械分装。对培养时间长，培养材料较高的，培养基厚度应厚一些；如果培养时间短，培养材料稍矮的，培养基厚度可以薄一些；

培养容器可以选用任何透明、无毒的材料制作，只要能保证光照和对组织培养无副作用，任何廉价材料都可选用。

7、将分装好培养基的容器盖上盖子或用保鲜膜封口，以保持水份。培养基冷凉后即可接种植物。

二、抑菌培养基的抑菌效果实验和对培养组织分化、根系生长的影响

表七抑菌培养基的抗污染实验

实验条件：采用空白MS培养基，每升添加白砂糖30g，琼脂4g。培养基分别添加不同抑菌药品后，调PH至5.8，分装于培养皿中，在室内敞口放置15分钟，自然感菌，然后加盖培养皿盖，进行培养。设置对照为相同培养基，不添加抑菌药品，调PH至5.8，直接分装灭菌。然后室内自然敞口15分钟然后封闭。每个组合做15个处理。观察结果如下：

添加的杀菌剂品种	溴化二甲基二癸基铵	山梨酸钾	聚阳离子类化合物3	布罗波尔	洁尔灭	味唑烷基脲	CK
								添加量g/L	4	5	4	4	5	3	0
5天后污染率(％)	0	0	0	0	0	0	12
								10天后污染率(％)	0	0	0	0	0	0	15
15天后污染率(％)	0	0	0	0	0	1	15
								20天后污染率(％)	1	2	0	0	1	2	15
25天后污染率(％)	1	3	0	1	1	3	15
								30天后污染率(％)	2	3	0	1	2	4	15

表八马铃薯组培苗在抑菌培养基中的分化、生长实验

试验条件：采用空白MS培养基，每升添加白砂糖30g，琼脂4g，B90.05mg/L。培养基分别添加不同抑菌药品后，调PH至5.8，分装于培养瓶中，用保鲜膜封口。以马铃薯组培苗茎段在室内自然条件下接种，封盖，进行培养。培养光周期为16/8。设置对照为相同培养基，不添加抑菌药品，调PH至5.8，直接分装灭菌。然后在超净工作台上进行马铃薯组培苗茎段接种操作。每个组合做8个处理。观察结果如下：

添加的杀菌剂品种和添加量	供试茎段数/个	芽的分化		4～6cm小苗总数	1～3cm小苗总数	生长状况
							总数	每块组织芽数
		聚阳离子类化合物33g/L	8						75	9.38	41	34	小苗壮，绿色
溴化二甲基二癸基铵4g/L	8			56	7.0	33	23	小苗健壮，挺拔，深绿
		洁尔灭5g/L	8						69	8.63	57	12	小苗健壮，挺拔，深绿
凯松3g/L	8			44	5.5	29	15	小苗细弱，色淡
		山梨酸钾5g/L	8						37	4.63	20	17	小苗壮，绿色
CK	8			34	4.25	14	30	小苗细弱，色淡

       表九抑菌培养基对樱桃组培苗根系生长影响

培养条件：采用生根培养基MS+6BA0.3+ZT0.09+NAA0.2，每升添加白砂糖30g，琼脂4g。培养基分别添加不同抑菌药品后，调PH至5.8，分装于培养瓶中，用保鲜膜封口。以樱桃组培苗茎段在室内自然条件下接种，封盖，进行培养。光周期16/8。设置对照为相同培养基，不添加抑菌药品，调PH至5.8，直接分装灭菌。然后在超净工作台上进行樱桃组培苗茎段接种操作。观察结果如下：

添加杀菌剂

组培苗数

生根株数

生根率％

生根数(条/

生长状况

品种用量				株)
						山梨酸钾5g/L	100	83	83	4.22	较粗壮
聚阳离子类化合物33g/L	100	91	91	4.6	粗壮
						洁尔灭5g/L	100	84	84	5.7	粗壮
溴化二甲基二癸基铵4g/L	100	76	76	3.25	一般
						CK	100	51	51	1.04	较弱

表十杀菌剂的添加量对种子发芽率、组培苗分化、生根的影响

试验条件：采用空白MS培养基，每升添加白砂糖30g，琼脂4g。培养基分别添加不同量的由阳离子化合物1、2和3按0.1∶1∶3的比例配制的复合杀菌剂后，调PH至5.8，分装于培养瓶中，用保鲜膜封口。洋香瓜种子开水浸5分钟，然后用清水冲洗30分钟，75％酒精处理30秒，0.01％升汞处理10分钟，然后用0.4％聚阳离子杀菌剂冲洗，在室内自然条件下接种，封盖，进行培养。培养光周期为16/8。设置对照为相同培养基，不添加抑菌药品，调PH至5.8，直接分装灭菌。然后在超净工作台上进行种子接种操作(种子处理相同)。每个组合做15个处理。观察结果如下：

聚阳离子杀菌剂添加量	0.01g/L	0.1g/L	1.0g/L	2.0g/L	3.0g/L	4.0g/L	4.5g/L	5.0g/L	6.0g/L	CK
											发芽	8污染1个	9	9	13	15	15	15	12	10	4污染9个
分化	7	8	9	13	15	15	15	10	6	3
											生根	8	9	9	13	15	15	15	11	9	3

Claims (11)

1.一种非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于植物组织培养的全过程是在非无菌自然环境条件下实施的；它包括：在培养基中添加消毒杀菌剂，制备抑菌培养基；在非无菌自然环境条件下接种；将培养材料置于满足植物组织培养的温度、光照条件的房间或设施内在自然环境条件下进行培养。

2.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于制备抑菌培养基过程中添加的消毒杀菌剂可以是苯甲酸类或山梨酸类或酚类或含氯化合物类或季胺盐类或脲类或胍类或恶唑烷类或聚阳离子类或含银制剂类或两性表面活性剂类或天然消毒杀菌剂。

3.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于在培养基中添加的消毒杀菌剂的用量范围为0.001～10g/L，(指每立升培养基中添加杀菌剂的克数，以下同)。

4.如权利要求1所的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于培养基中添加的消毒杀菌剂的优选的用量范围为0.01～5g/L。

5.如权利要求1或2所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于制备抑菌培养基过程中添加的消毒杀菌剂品种及用量为：

氯胺B，它的分子式是C₆H₅CINO₂SNa·2H₂O，其添加量为0.001～4g/L；或

氯胺T，它的分子式是C₇H₇CINO₂SNa₃·3H₂O，其添加量为0.001～5g/L；或

二氯异氰尿酸钠，它的分子式是C₃O₃N₃Cl₂Na，其添加量为0.01～3g/L；或

三氯异氰尿酸，它的分子式是C₃O₃N₃CL₃，其添加量为0.01～1g/L；或

二氯二甲基乙内酰脲，它的分子式是C₅H₆Cl₂N₂O₂，其添加量为0.001～1g/L；或

甲酚，它的分子式是C₇H₉O，其添加量为0.05～10g/L；或

氯代酚，它的分子式是C₆H₅ClO，其添加量为0.05～10g/L；或

洁而灭，它的分子式是C₂₁H₃₈NCl，其添加量为0.02～10g/L；或

新洁而灭，它的分子式是C₂₁H₃₈NBr，其添加量为0.02～10g/L；或

度米芬，它的分子式是C₂₂H₄₀BrNO，其添加量为0.02～10g/L；或

清毒净，它的分子式是C₂₀H₃₆NBr，其其添加量为0.02～10g/L；或

氯化二甲基二癸基铵，它的分子式是C₂₂H₄₈NCl，其添加量为0.002～10g/L；或C₂₀H₃₆NBr₂H₃₀N₁₀Cl₂O₂C₂₂C₂₂

溴化二甲基二癸基铵，它的分子式是C₂₂H₄₈NBr，其添加量为0.002～10g/L；或

十二烷基二氨基乙基甘氨酸，它的分子式是C₁₂H₂₅NHC₂H₄NHC₂H₄NH·CH₂COOH，其添加量为0.01～10g/L；或

洗必泰，它的分子式是C₂₂H₃₀N₁₀Cl₂·2HCl，其添加量为0.005～10g/L；或

聚六亚甲基双胍盐酸盐，它是高聚物，其添加量为0.01～10g/L；或

磺胺嘧啶银，它的分子式是C₁₀H₉O₂N₄SAg，其添加量为0.5～10g/L；或

对氨基苯磺酸银，它的分子式是C₆H₇O₃N₂Ag，其添加量为0.1～10g/L；或

苯甲酸，它的分子式是C₇H₆O₂，其添加量为0.5～10g/L；或

苯甲酸钠，它的分子式是C₇H₅NaO₂，其添加量为0.2～25g/L；或

山梨酸，它的分子式是C₆H₈O₂，其添加量为0.1～10g/L；或

山梨酸钾，它的分子式是C₆H₇O₂K，其添加量为0.1～25g/L；或

尼泊金甲酯，它的分子式是C₈H₈O₃，其添加量为0.01～10g/L；或

尼泊金乙酯，它的分子式是C₉H₁₀O₃，其添加量为0.01～10g/L；或

尼泊金丙酯，它的分子式是C₁₀H₁₂O₃，其添加量为0.01～10g/L；或

尼泊金丁酯，它的分子式是C₁₁H₁₄O₃其添加量为0.01～10g/L；或

咪唑烷基脲，它的分子式是C₈H₁₄N₄O₇，其添加量为0.05～10g/L；或

双咪唑烷基脲，它的分子式是C₁₁H₁₆N₈O₈，其添加量为0.05～10g/L；或

布罗波尔，它的分子式是CH₃H₆O₄NBr，其添加量为0.01～10g/L；或

道维希尔-200，它的分子式是C₆H₁₂N₄(CH₂CHCHCl)Cl，其添加量为0.05～5g/L；或

三氯生又名玉洁新DP300，它的分子式是C₁₂H₇C₁₃O₂，其添加量为0.01～10g/L；或

甘宝素(又名活性甘宝素、二唑酮)，它的分子式是C₁₅H₁₇O₂Cl，其添加量为0.001～10g/L；或

三氯卡巴又名三氯碳酸苯胺，它的分子式是C₁₃H₉Cl₃N₂O，其添加量为0.001～2g/L；或DMDM乙内酰脲，它的分子式是C₇H₁₂N₂O₄，其添加量为0.05～10g/L；或

Germall-Plus又名乔曼-Plus，它是C₈H₁₄N₄O₇与C₈H₁₂INO₂的混合物，其添加量为0.02～5g/L；或

对氯间二甲苯酚，它的分子式是C₈H₉ClO，其添加量为0.05～10g/L；或

富马酸二甲酯，它的分子式是C₆H₈O₄，其添加量为0.05～10g/L；或

琼脂低聚糖，其添加量为0.01～10g/L；或

胶黄酮防腐抗氧化剂，它是白杨素，良姜素，高良姜素，金合欢素，洋芹素，山奈素，鼠李素的混合物，其添加量为0.01～10g/L；或

鱼精蛋白，它是碱性蛋白质，常与核酸结合，其添加量为0.01～10g/L；或

肉桂醛，它的分子式是C₉H₈O，其添加量为0.01～5g/L；或

乳酸链球菌素，它是34个氨基酸组成的多肽，其添加量为0.01～2g/L；或

二甲基恶唑烷或7一乙基二环恶唑烷，其添加量为用量为0.01～5g/L。

6.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于制作抑菌培养基过程中添加的消毒杀菌剂为：

聚苯乙烯基聚阳离子或聚环氧丙烷基聚阳离子化合物，其结构式如下：

此类结构中，

或

R₁＝-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₃、-CH₂C₆H₅、-CH₂CH＝CH₂、-CH₂CH＝CHX、-CH₂CH₂OH或-CH₂CH(OH)CH₃；

R₂＝-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₃、-CH₂C₆H₆、-CH₂CH＝CH₂、-CH₂CH＝CHX、-CH₂CH₂OH或-CH₂CH(OH)CH₃；

R₃＝-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₃、-CH₂C₆H₅、-CH₂CH＝CH₂、-CH₂CH＝CHX、-CH₂CH₂OH或-CH₂CH(OH)CH₃

或者

R₁＝-CH₃、-CH₂CH₃；

R₂，R₃＝-COCH＝CHS-、-COCH＝CClS-；

X＝Cl或Br；

n＝2～500单元。当n值小于50个单元时，相应材料有较好的水溶性；

该聚阳离子类杀菌剂在培养基中的添加量为0.01～8g/L。

7.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于：制作抑菌培养基过程中添加的消毒杀菌剂为

化合物1；含氯化-甲基二(3’-氯烯丙基)铵盐基团的聚环氧丙烷

化合物2：含氯化N-甲基-N，N-硫烯丙酰基铵盐基团的聚环氧丙烷

化合物3：含氯化N-甲基-N，N-硫氯烯丙酰基铵盐基团的聚环氧丙烷

上述三个化合物结构式中n＝30～70；

该三个化合物可单独使用或复合使用，当复合使用时，其用量比例为化合物1∶化合物2∶化合物3∶＝0～0.5∶1∶1～3；

其添加量为0.01～8g/L

8.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于：制备固体抑菌培养基的工艺为：按照培养样品所需要的常规培养基配方，配制加有无机盐、糖、激素和琼脂的混合液，将其加热至琼脂完全熔化，然后添加所选用的一定量的杀菌剂，搅拌均匀后，分装至培养容器中；制备液体抑菌培养基的工艺为：按照培养样品所需要的常规培养基配方，配制加无机盐、糖、激素的水溶液，然后添加所选用的一定量的杀菌剂，搅拌均匀后，分装至培养容器中。

9.如权利要求1或7所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于：所说的培养容器是用透明无毒材料制备的。

10.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于所说的接种是在非无菌自然环境条件下将植物组织接种在抑菌培养基中。

11.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于将接种后的培养容器置于满足培养材料生长发育的温度、光照条件的房间或设施内在自然环境条件下进行培养。