CN104885939A - 一种甘薯化学消毒组培方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种甘薯的化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、茎尖诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽。本发明的甘薯化学消毒组培方法，利用化学试剂达到灭菌或抑菌的目的，在配制培养基的过程中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了甘薯组培环节；并且操作简单，只要按不同的培养基配方配制即可；实用性强，推广性好，还可以有效降低甘薯的组培成本，一般可降低成本10％以上。

Description

一种甘薯化学消毒组培方法
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种甘薯化学消毒组培方法，属生物技术领域。
背景技术
甘薯(Ipomoea batatas Lam.)属旋花科一年生草本植物，是一种无性繁殖作物。在我国广泛种植。至今在我国南方省份如广东、福建等省仍是仅次于水稻等第二大粮食作物。甘薯含有人体必需的碳水化合物、蛋白质、维生素、膳食纤维等全部七大类营养物质，特别是富含膳食纤维、胡萝卜素、维生素A、B、C、E以及钾、铁、铜、硒、钙等10余种微量元素，营养价值很高，被营养学家们称为营养最均衡的保健食品。也被世界卫生组织推荐为十三种健康蔬菜之首。由于甘薯是无性繁殖作物，像大多数等无性繁殖作物一样，一旦感染病毒就会导致病毒在体内增殖、积累，引起种性退化，使得其产量和品质逐年下降，严重的甚至绝收。目前，生产上普遍感染的甘薯羽状斑驳病毒(SWFMV)、甘薯潜隐病毒(SPLV)，甘薯黄矮病毒(SPYDV)等严重影响甘薯的产量和品质，威胁甘薯生产可持续发展。为解决甘薯病毒病等危害，近年来甘薯界科研人员借鉴其他无性作物脱毒技术生产经验，建立了甘薯脱毒种苗的生产体系。该项技术的核心就是建立了甘薯茎尖组培再生技术和单节段试管苗快繁技术以及病毒快速检测技术。甘薯脱毒种苗的生产体系应用较好解决甘薯病毒病危害导致的种性退化问题。
但是，甘薯脱毒苗的总体成本偏高，制约了该技术的应用。特别是甘薯脱毒组培苗的生产和试管苗单节段快繁殖是总体成本的决定环节，大幅度地降低甘薯脱毒组培苗的生产成本必须从此环节着手。由于常规的甘薯茎尖组织培养是在无菌条件下进行的，组织培养的各个环节均需配置相应的设施设备及常规耗材，成本较高，能源消耗较大，同时整个流程要在无菌条件下操作，人工操作成本高。如果能通过培养基改造，获得既保证甘薯脱毒种苗正常生长，又具有杀菌、抗菌或抑菌功能的培养基，，这样可以大幅度节约脱毒苗等生产成本，解决甘薯脱毒种苗的生产体系应用成本高等难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘薯化学消毒组培方法。
本发明的目的是通过以下方法实现的。
本发明的一种甘薯化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、茎尖诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：
1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L乳酸链球菌素+100mg/L丙酸钙的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；
2.培养基配制：茎尖诱导培养基为MS+0.2～0.8mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/L IAA+50～100mg/L次氯酸钠+1～2mg/L青霉素+10～50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；增殖培养基为：1/2MS+50～100mg/L次氯酸钠+1～2mg/L青霉素+10～50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.1～0.8mg/L NAA+50～100mg/L次氯酸钠+1～2mg/L青霉素+10～50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，指6-苄氨基嘌吟；所述NAA，指〆-萘乙酸；所述IAA，指吲哚乙酸；配制培养基时，先称各培养基配方中蔗糖和琼脂粉，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
3.茎尖诱导培养：选取健康无病斑的薯块洗净后，用消毒湿砂覆埋于25℃黑暗催芽，当芽露出砂面后38一40℃热处理7d；剪取生长旺盛的茎尖3—5cm；在室内切去叶片，用自来水冲洗20～30min，在体积比为75％的酒精中浸泡30s，用重量比为0.1％的升汞溶液消毒8min，取出后，用无菌水冲洗3次，然后在解剖镜下剥取带1～2个叶原基、长0.2～0.3mm的茎尖，接种于茎尖诱导培养基上培养30d，获得的无菌苗；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为2000～3000lx；
4.增殖培养：将诱导培养获得的无菌苗切成长1.0～1.5cm、带单个腋芽的茎段，接种到增殖培养基中，培养4周成为不具根的小苗，每30d转接一次；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为2000～3000lx；
5.生根培养：将增殖苗切成长1.0～1.5cm、带单个腋芽的茎段，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为25℃，光照16h，光照强度为2000～3000lx；
6.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后移栽至大棚的耕作土中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。
本发明的应用效果：由于本发明的化学消毒组培方法，是利用化学试剂添加到各种培养基中，达到灭菌或抑菌的作用，所以，配制的培养基无需高温高压灭菌。因此，在甘薯茎尖 诱导培养、壮苗培养、生根培养各个阶段的影响，除了要考虑常用的评价指标外，还要考虑污染率的问题。
1.茎尖诱导培养：通过实验证实，本发明的一种甘薯的化学消毒组培方法与常规的甘薯组培方法相比，在茎尖诱导培养阶段的外植体培养的成活率、污染率和死亡率，如表1所示，都没有太大差异，同时，由于本发明的化学消毒组培方法的培养基不经过高温高压灭菌，激素和营养元素损失较少，其甘薯组培苗生长更绿，更壮。
表1 本发明的化学消毒组培方法对甘薯茎尖诱导培养的影响
组培方式 平均成活率(％) 平均污染率(％) 平均死亡率(％)
常规组培方法 65 29 6
化学消毒组培方法 69 26 5
2.增殖培养：从表2可以看出，本发明的甘薯化学消毒组培方法的每瓶平均壮苗数明显高于常规的甘薯组培方法，污染率更低，瓶苗也更壮、更绿。
表2 本发明的化学消毒组培方法对甘薯增殖倍数和污染率的影响
组培方式 平均增殖倍数 平均污染率(％) 生长状况
常规组培方法 4.5 0.5 苗浅绿、弱
化学消毒组培方法 4.8 0.1 苗绿、壮
3.本发明的化学消毒组培方法对甘薯生根率和污染率的影响：在生根过程中，本发明的化学消毒组培方法与常规的甘薯组培方法相比，结果如表3所示，生根率和污染率都没有太大差异；从瓶苗的生长状况看，用本发明的方法，甘薯组培苗茎更粗，叶片更大，叶色浓绿。
表3 本发明的化学消毒组培方法的甘薯瓶苗生根情况
4.成本分析：本发明的化学消毒组培方法与常规组培的成本分析见表4。
本发明的化学消毒组培方法省去了高压灭菌环节，简化了组培程序，提高了工作效率。从可以直接计算出来的费用来算，每年可以节约5万元左右(以每天配制50L培养基计算)。另外，还有一些不容易计算的项目，如高压锅维修，安全，节约空间等：
表4 本发明的甘薯化学消毒组培方法与常规组培的成本分析表
由于本发明的培养基不需要进行高温高压灭菌，一方面可以降低甘薯组织培养对设施设备的要求，尤其不需要高温高压灭菌所需配置的高压锅设备，节约了投资成本，电能消耗也将大幅度降低；另一方面，采用这种培养基开展甘薯脱毒种苗生产，组培环节大为简化，人工操作的速度大幅提高，从而降低了人工成本。此外，由于改造后的培养基自身具有杀菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制组织培养过程中的污染问题，又不会对甘薯生长产生毒害或抑制，即不影响甘薯的正常生长，从根本上简化了甘薯组织培养。
本发明具有如下有益效果：
1.本发明的甘薯化学消毒组培方法中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了甘薯组培环节，降低了甘薯组培成本。
2.本发明的甘薯化学消毒组培方法，操作简单，只要按不同的培养基配方配制后即可，实用性强，推广性好。
3.本发明的甘薯化学消毒组培方法与常规的甘薯组培方法对比，可以降低成本10％以上。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。
实施例一：一种甘薯化学消毒组培方法
一种甘薯化学消毒组培方法，包括以下步骤：
1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L乳酸链球菌素+100mg/L丙酸钙的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；
2.培养基配制：茎尖诱导培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+50mg/L次氯酸钠+1.5mg/L青霉素+20mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；增殖培养基为：1/2MS+50mg/L次氯酸钠+1.5mg/L青霉素+20mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.5mg/L NAA+50mg/L次氯酸钠+1.5mg/L青霉素+20mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；配制培养基时，先称各培养基配方中蔗糖和琼脂粉，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
3.茎尖诱导培养：选取健康无病斑的薯块洗净后用30mg/L GA3漫种30min，用消毒湿砂覆埋，于25℃黑暗催芽，当芽露出砂面后用38一40℃热处理7d。剪取生长旺盛的茎尖3—5cm。在室内切去叶片，用自来水冲洗20～30min，在体积比为75％的酒精中浸泡30s，用重量比为0.1％的升汞溶液消毒8min，取出后，用无菌水冲洗3次，然后在解剖镜下剥取带1～2个叶原基、长0.2～0.3mm的茎尖，接种于茎尖诱导培养基上培养30d，获得的无菌苗；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为2000～3000lx；
4.增殖培养：将诱导培养的无菌苗切成长1.0～1.5cm、带单个腋芽的茎段，接种到增殖培养基中，培养4周成为不具根的小苗，每30d转接一次；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为2000～3000lx；
5.生根培养：将增殖苗切成长1.0～1.5cm、带单个腋芽的茎段，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为25℃，光照16h，光照强度为2000～3000lx；
6.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后移栽至大棚的耕作土中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。

Claims (4)

1.一种甘薯化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、茎尖诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：
(1)培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L乳酸链球菌素+100mg/L丙酸钙的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；
(2)培养基配制：茎尖诱导培养基为MS+0.2～0.8mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/L IAA+50～100mg/L次氯酸钠+1～2mg/L青霉素+10～50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；增殖培养基为：1/2MS+50～100mg/L次氯酸钠+1～2mg/L青霉素+10～50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.1～0.8mg/L NAA+50～100mg/L次氯酸钠+1～2mg/L青霉素+10～50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，指6-苄氨基嘌吟；所述NAA，指〆-萘乙酸；所述IAA，指吲哚乙酸；配制培养基时，先称各培养基配方中蔗糖和琼脂粉，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
(3)茎尖诱导培养：选取健康无病斑的薯块洗净后，用消毒湿砂覆埋于25℃黑暗催芽，当芽露出砂面后38一40℃热处理7d；剪取生长旺盛的茎尖3—5cm；在室内切去叶片，用自来水冲洗20～30min，在体积比为75％的酒精中浸泡30s，用重量比为0.1％的升汞溶液消毒8min，取出后，用无菌水冲洗3次，然后在解剖镜下剥取带1～2个叶原基、长0.2～0.3mm的茎尖，接种于茎尖诱导培养基上培养30d，获得的无菌苗；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为2000～3000lx；
(4)增殖培养：将诱导培养获得的无菌苗切成长1.0～1.5cm、带单个腋芽的茎段，接种到增殖培养基中，培养4周成为不具根的小苗，每30d转接一次；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为2000～3000lx；
(5)生根培养：将增殖苗切成长1.0～1.5cm、带单个腋芽的茎段，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为25℃，光照16h，光照强度为2000～3000lx；
(6)瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后移栽至大棚的耕作土中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。
2.根据权利要求1所述的一种甘薯化学消毒组培方法，其特征在于所述茎尖诱导培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+50mg/L次氯酸钠+1.5mg/L青霉素+20mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8。
3.根据权利要求1所述的一种甘薯化学消毒组培方法，其特征在于所述增殖培养基为：1/2MS+50mg/L次氯酸钠+1.5mg/L青霉素+20mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8。
4.根据权利要求1所述的一种甘薯化学消毒组培方法，其特征在于所述生根培养基为1/2MS+0.5mg/L NAA+50mg/L次氯酸钠+1.5mg/L青霉素+20mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8。
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