CN104938341B - 一种利用茎尖组织繁殖大花蕙兰种苗的方法 - Google Patents

一种利用茎尖组织繁殖大花蕙兰种苗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用茎尖组织高效繁殖大花蕙兰种苗的方法，所述方法包括外植体的选取；侧芽消毒；原球茎诱导培养；原球茎增殖培养；原球茎分化培养和生根壮苗培养。本发明诱导阶段提高原球茎诱导率；增殖阶段降低原球茎变异率和玻璃化率；分化阶段降低芽变异率，生根壮苗阶段种苗生长发育更加健壮，新根缠结比率降低，根系更加分散与伸展，同时种苗变异率降低。

Description

一种利用茎尖组织繁殖大花蕙兰种苗的方法
技术领域
本发明涉及一种利用茎尖组织高效繁殖大花蕙兰种苗的方法，特别涉及一种可以使种苗生长发育更加健壮，新根缠结比率降低，种苗变异率降低的组织培养方法。
背景技术
大花蕙兰(Cymbidium hubridum)是以兰属中一些大花型附生种为亲本经过多代杂交选择培育出来的花型大、色彩鲜艳、生长健壮的优良品种群。大花蕙兰姿态优美，叶长碧绿，花姿粗犷，花期长达2-3个月，是极重要的室内观赏植物，是世界著名的“兰花新星”，兼具国兰的幽香典雅和洋兰的丰富多彩，在国际花卉市场十分畅销，深受世界各地人们的喜爱。
目前，生产上主要以无病毒健壮母株侧芽的茎尖为外植体，通过原球茎和丛生芽途径大量繁殖大花蕙兰种苗。工厂化生产大花蕙兰种苗主要存在以下四个问题:
一是，采用侧芽的茎尖进行繁殖时，若茎尖组织太大，消毒往往不彻底、消毒成功率极低，同时茎尖组织吸收营养物质较慢，培养期间容易褐化。若茎尖组织太小，生活力大大降低，培养后期易死亡，导致原球茎诱导率较低。
二是，大花蕙兰增殖阶段原球茎极易变异，玻璃化现象较严重，这种原球茎后期难以分化芽。
三是，大花蕙兰分化阶段一部分原球茎会逐渐僵化，主要表现为基部假鳞茎会异常肥大，不分化叶，或者即使能分化叶，但叶片较小，不能进一步生长发育，导致原球茎分化的芽变异，产生大量的僵化苗。
四是，大花蕙兰生根壮苗阶段种苗变异率较高，种苗不够健壮，会产生较多不同类型的变异种苗，比如叶片互生或丛生排列的十字架苗、茎节间过长的竹竿苗。另外，种苗新根缠结比率高，不易分开，不利于后期温室移栽驯化。
发明内容
本发明针对以上缺点，对其进行大规模的技术革新，提供一种利用茎尖组织高效繁殖大花蕙兰种苗的方法，优化外植体消毒方法及外植体选择切割技术，设计高效的诱导、增殖、分化、生根壮苗阶段的培养基配方，从而达到提高茎尖组织消毒成功率、原球茎诱导率；降低原球茎变异率与玻璃化率；降低分化芽变异率；使得种苗生长发育更加健壮，新根缠结比率降低，根系更加分散与伸展，同时种苗变异率降低的目的。
为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现：
一种利用茎尖组织高效繁殖大花蕙兰种苗的方法，包括以下步骤：
步骤a，外植体的选取，切取大花蕙兰母株基部长出的6-12cm的健壮侧芽；
步骤b，侧芽消毒，对切取的侧芽进行消毒，切下茎尖组织作为培养的外植体；
步骤c，原球茎诱导培养，将外植体接种到原球茎诱导培养基上，培养30-60天，诱导得到原球茎；所述诱导培养基的成分包括：花宝3号1-3g/L，水解酪蛋白2-4g/L，腺嘌呤0.5-1.5g/L，活性炭0.5-1.5g/L，琼脂6-8g/L，蔗糖15-24g/L；
步骤d，原球茎增殖培养，将诱导形成的原球茎团切割成小块，每块含3-5个原球茎，接种到增殖培养基中，逐渐形成新的原球茎，反复切割增殖，每30-40天继代转接一次；所述增殖培养基的成分与诱导培养基成分相同；
步骤e，原球茎分化培养，将增殖阶段形成的原球茎团切割成小块，每块含5-10个原球茎，接种到分化培养基中进行分化培养，原球茎分化出新叶新根；所述分化培养基的成分包括：花宝3号1-3g/L，水解酪蛋白2-4g/L，腺嘌呤0.4-1.0g/L，TDZ(噻苯隆)0.05-0.15mg/L，活性炭0.5-1.5g/L，琼脂5-9g/L，蔗糖13-26g/L。
步骤f，生根壮苗培养，切取分化培养后高5-6cm的芽，接种到生根壮苗培养基中进行培养，得到生长健壮的种苗，其中生根壮苗培养基的成分包括：花宝1号1-4g/L，硝酸钾0.7-2.1g/L，七水硫酸亚铁18-32mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠30-43g/L，水解酪蛋白2-4g/L，腺嘌呤0.5-1.5g/L，土豆泥12-28g/L，香蕉泥35-65g/L，椰子汁50-150mL，活性炭0.5-1.5g/L，琼脂6-8g/L，蔗糖14-27g/L。
进一步，步骤b中，对侧芽进行消毒的方法包括以下步骤：
将切取的侧芽用流水冲洗干净，层层剥去侧芽外层叶片，切除侧芽基部木质化组织，直到剩下6-8片叶，继续用流水冲洗干净，然后用12％的次氯酸钙消毒15min，用吸水纸吸干表面水分，拿到无菌工作台上进一步消毒；
继续剥去茎尖外层叶片，直到剩下3-5片叶，然后用5％的次氯酸钙消毒12min，无菌水冲洗3-5次；
继续剥外层叶片，直到剩下1-2片叶，然后用1％次氯酸钙消毒6min，无菌水冲洗3-5次，用吸水纸吸干表面水分；
在显微镜下面，小心剥去生长点外层的幼叶，直到露出生长点；
切下含生长点的茎尖组织，约2-3mm大小，作为培养的外植体。
进一步，将含生长点的茎尖组织从中心均匀切成4小块(十字切法)，或者2小块(一分为二法)，每块单独接种到诱导培养基中。
进一步，所述诱导培养基和增殖培养基的成分包括：花宝3号2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤1g/L，活性炭1g/L，琼脂7g/L，蔗糖20g/L。
进一步，所述分化培养基的成分包括：花宝3号2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤1g/L，TDZ0.1mg/L，活性炭1g/L，琼脂7g/L，蔗糖20g/L。
进一步，生根壮苗培养基的成分包括：花宝1号1-4g/L，硝酸钾0.7-2.1g/L，七水硫酸亚铁18-32mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠30-43mg/L，水解酪蛋白2-4g/L，腺嘌呤0.5-1.5g/L，土豆泥12-28g/L，香蕉泥35-65g/L，椰子汁100ml/L，活性炭0.5-1.5g/L，琼脂6-8g/L，蔗糖14-27g/L。
优选的，生根壮苗培养基的成分包括：花宝1号2g/L，硝酸钾1.5g/L，七水硫酸亚铁27.8mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤1g/L，土豆泥20g/L，香蕉泥50g/L，椰子汁100ml/L，活性炭1g/L，琼脂7g/L，蔗糖20g/L。
总之，本发明的有益效果为：
本发明提供的大花蕙兰组织培养方法，首先，增殖阶段，采用本发明配制的培养基，能显著降低原球茎变异率、玻璃化率。
分化阶段，采用本发明配制的培养基，能显著降低分化芽的变异率，减少僵化苗数量。
生根壮苗阶段，采用本发明配制的培养基，可使种苗生长发育更加健壮，新根缠结比率降低，根系更加分散与伸展，同时降低种苗变异率。
进一步，采用本发明的消毒方法及外植体选择切割技术可以提高茎尖组织消毒成功率，同时增加茎尖组织与培养基接触面积，促进营养物质吸收，降低褐化率，提高原球茎诱导率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
诱导培养基和增殖培养基的成分如下：
花宝3号2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤1g/L，活性炭1g/L，琼脂7g/L，蔗糖20g/L。
实施例2
诱导培养基和增殖培养基的成分包括：
花宝3号1g/L，水解酪蛋白2g/L，腺嘌呤0.5g/L，活性炭0.5g/L，琼脂6g/L，蔗糖15g/L。
实施例3
诱导培养基和增殖培养基的成分包括：
花宝3号3g/L，水解酪蛋白4g/L，腺嘌呤1.5g/L，活性炭1.5g/L，琼脂8g/L，蔗糖24g/L。
实施例4
分化培养基的成分包括：
花宝3号2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤1g/L，TDZ0.1mg/L，活性炭1g/L，琼脂7g/L，蔗糖20g/L。
实施例5
分化培养基的成分包括：
花宝3号1g/L，水解酪蛋白2g/L，腺嘌呤0.4g/L，TDZ0.05mg/L，活性炭0.5g/L，琼脂5g/L，蔗糖13g/L。
实施例6
分化培养基的成分包括：
花宝3号3g/L，水解酪蛋白4g/L，腺嘌呤1.0g/L，TDZ0.15mg/L，活性炭1.5g/L，琼脂9g/L，蔗糖26g/L。
实施例7
生根壮苗培养基的成分包括：
花宝1号2g/L，硝酸钾1.5g/L，七水硫酸亚铁27.8mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠37.3g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤1g/L，土豆泥20g/L，香蕉泥50g/L，椰子汁100ml/L，活性炭1g/L，琼脂7g/L，蔗糖20g/L。
实施例8
生根壮苗培养基的成分包括：
花宝1号1g/L，硝酸钾0.7g/L，七水硫酸亚铁18mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠30mg/L，水解酪蛋白2g/L，腺嘌呤0.5g/L，土豆泥12g/L，香蕉泥35g/L，椰子汁50ml/L，活性炭0.5g/L，琼脂6g/L，蔗糖14g/L。
实施例9
生根壮苗培养基的成分包括：
花宝1号4g/L，硝酸钾2.1g/L，七水硫酸亚铁32mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠43mg/L，水解酪蛋白4g/L，腺嘌呤1.5g/L，土豆泥28g/L，香蕉泥65g/L，椰子汁150ml/L，活性炭1.5g/L，琼脂8g/L，蔗糖27g/L。
实施例10
第一，切取大花蕙兰母株基部长出的6-12cm的健壮侧芽。
第二，将切取的侧芽用流水冲洗干净，层层剥去侧芽外层叶片，切除侧芽基部木质化组织，直到剩下6片左右叶，继续用流水冲洗干净，然后用12％的次氯酸钙消毒15min，用吸水纸吸干表面水分，拿到无菌工作台上进一步消毒；
继续剥去茎尖外层叶片，直到剩下3片左右叶，然后用5％的次氯酸钙消毒12min，无菌水冲洗3-5次；
继续剥去外层叶片，直到剩下1-2片左右叶，然后用1％次氯酸钙消毒6min，无菌水冲洗3-5次，用吸水纸吸干表面水分；
在显微镜下面，小心剥去生长点外层的幼叶，直到露出生长点；
切下含生长点的茎尖组织，约2-3mm大小，将含生长点的茎尖组织从中心均匀切成4小块(十字切法)，每块作为外植体单独接种到诱导培养基中。
采用本发明的消毒方法可以提高茎尖组织消毒成功率。同时，保持外植体活性，不至于消毒时间过长导致死亡。
采用本发明的消毒方法可以使消毒成功率达到85％以上，优选的本实施例中消毒成功率可以达到90％以上。
而消毒后将含生长点的茎尖组织从中心均匀切成4小块，是因为若外植体太大，吸收营养物质较慢，培养期间容易褐化。若外植体太小，培养后期易死亡，导致原球茎诱导率较低。
通过本发明的外植体选择切割技术，增加了外植体与培养基的接触面积，营养物质吸收效果更好，能降低外植体褐化率，提高原球茎诱导率。第三，原球茎诱导培养，将切好的外植体接种到原球茎诱导培养基上后，10d左右开始膨大，表面逐渐诱导产生许多浅绿色的点状颗粒，25d左右发育成绿色原球茎。原球茎颗粒饱满，表面布满白色绒毛。所述诱导培养基选择实施例1中的培养基。培养周期为30-60d，培养温度为25-28℃，光照时间为8-14h/d，光照强度为1000-2000lux。采样本发明的诱导培养基成分和培养方法，原球茎诱导率大于95％。
第四，原球茎增殖培养，将诱导形成的原球茎团切割成小块，每块含3-5个原球茎，接种到增殖培养基中，逐渐形成新的原球茎，反复切割增殖；每30-40d继代转接1次，形成大量的原球茎；所述增殖培养基成分与诱导培养基成分相同，同样选择实施例1中的培养基。培养条件与诱导培养阶段相同。
增殖阶段发育正常的原球茎为淡绿色，表面不光滑且有细小突起，表面覆短白色绒毛，原球茎后期易分化芽。
而变异的原球茎为深绿色或墨绿色，表面光滑且有光泽。同时，有些原球茎发生玻璃化现象，呈透明状。变异的原球茎表面无白色绒毛，生长速度虽然很快，但活力很低，后期分化芽比率低，甚至不能分化芽。
而采用本发明的增殖培养基成分和培养方法可以显著降低原球茎变异率、玻璃化率。增殖系数在4-5之间，变异率小于3％，玻璃化率小于1％，优选的本实施例中变异率小于2％。
第五，原球茎分化培养，将增殖阶段形成的原球茎团切割成小块，每块含5-10个原球茎，接种到分化培养基中进行分化培养，原球茎分化出新叶新根；所述分化培养基选择实施例4的培养基。培养周期为40-60d，培养温度为25-28℃，光照时间为8-14h/d，光照强度为2000-3000lux。
分化阶段一部分原球茎会逐渐僵化，表现为基部假鳞茎会异常肥大，不分化叶，或者即使能分化叶，但叶片较小，不能进一步生长发育，导致原球茎分化的芽变异，产生大量的僵化苗。这种苗叶片较硬、表面像脱水一样，后期无法正常生根与发育。
采用本发明的分化培养基成分和培养方法可以极大降低僵化苗比率，僵化苗比率在2％-4％之间，优选的，小于2％。
第六，选取分化培养后株高5-6cm的芽，接种到生根壮苗培养基中进行培养，其中生根壮苗培养基选择实施例7。培养周期为60-80d，培养温度为25-28℃，光照时间为8-14h/d，光照强度为2500-3000lux。
大花蕙兰生根壮苗阶段种苗变异率较高，种苗不够健壮，一部分种苗叶片松散不挺直、脆弱、植株较纤弱。此外，生根壮苗阶段还会产生两种类型的变异种苗，比如叶片互生或丛生排列的十字架苗、茎节间过长的竹竿苗。采用本发明的生根壮苗培养基成分和培养方法可以极大降低十字架苗、竹竿苗等变异苗的比率，变异苗率小于3％。而且，种苗叶片直立、茎粗壮、株型挺拔。平均株高为8-10cm，叶片数大于4片，根数大于4根。
此外，生根壮苗阶段理想的种苗，根系比较分散、根系伸展良好，出瓶清洗方便、不易造成损伤。
而发育状态不好的种苗，根系缠结在一起，不易分开，有的根系尖端会膨大结成球状，不利于后期温室移栽驯化。
采用本发明的生根壮苗培养基成分和培养方法可以显著降低根系缠结比率，缠结比率小于3％。
本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (7)

1.一种利用茎尖组织繁殖大花蕙兰种苗的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤a，外植体的选取，切取大花蕙兰母株基部长出的6-12cm的健壮侧芽；
步骤b，侧芽消毒，对切取的侧芽进行消毒，切下茎尖组织作为培养的外植体；
步骤c，原球茎诱导培养，将外植体接种到原球茎诱导培养基上，培养30-60天，诱导得到原球茎；所述诱导培养基由以下成分组成：花宝3号1-3g/L，水解酪蛋白2-4g/L，腺嘌呤0.5-1.5g/L，活性炭0.5-1.5g/L，琼脂6-8g/L，蔗糖15-24g/L；
步骤d，原球茎增殖培养，将诱导形成的原球茎团切割成小块，每块含3-5个原球茎，接种到增殖培养基中，逐渐形成新的原球茎，反复切割增殖，每30-40天继代转接一次；所述增殖培养基的成分与诱导培养基成分相同；
步骤e，原球茎分化培养，将增殖得到的原球茎团切割成小块，每块含5-10个原球茎，接种到分化培养基中进行分化培养，原球茎分化出新叶新根；所述分化培养基由以下成分组成：花宝3号1-3g/L，水解酪蛋白2-4g/L，腺嘌呤0.4-1.0g/L，TDZ0.05-0.15mg/L，活性炭0.5-1.5g/L，琼脂5-9g/L，蔗糖13-26g/L；
步骤f，生根壮苗培养，切取分化培养后高5-6cm的芽，接种到生根壮苗培养基中进行培养，得到生长健壮的种苗，其中生根壮苗培养基由以下成分组成：花宝1号1-4g/L，硝酸钾0.7-2.1g/L，七水硫酸亚铁18-32mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠30-43g/L，水解酪蛋白2-4g/L，腺嘌呤0.5-1.5g/L，土豆泥12-28g/L，香蕉泥35-65g/L，椰子汁50-150mL，活性炭0.5-1.5g/L，琼脂6-8g/L，蔗糖14-27g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中，对侧芽进行消毒的方法包括以下步骤：
将切取的侧芽用流水冲洗干净，层层剥去外层叶片，切除侧芽基部木质化组织，直到剩下6-8片叶，12％的次氯酸钙消毒15min，然后拿到无菌工作台上进一步消毒；
继续剥去茎尖外层叶片，直到剩下3-5片叶，5％的次氯酸钙消毒12min；
继续剥外层叶片，直到剩下1-2片叶，1％次氯酸钙消毒6min；
在显微镜下面，小心剥去生长点外层的幼叶，直到露出生长点；
切下含生长点的茎尖组织，作为培养的外植体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将含生长点的茎尖组织从中心均匀切成4小块，或者2小块，每块单独接种到诱导培养基中。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基和增殖培养基由以下成分组成：花宝3号2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤1g/L，活性炭1g/L，琼脂7g/L，蔗糖20g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化培养基由以下成分组成：花宝3号2g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤1g/L，TDZ0.1mg/L，活性炭1g/L，琼脂7g/L，蔗糖20g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，生根壮苗培养基由以下成分组成：
花宝1号1-4g/L，硝酸钾0.7-2.1g/L，七水硫酸亚铁18-32mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠30-43g/L，水解酪蛋白2-4g/L，腺嘌呤0.5-1.5g/L，土豆泥12-28g/L，香蕉泥35-65g/L，椰子汁100ml/L，活性炭0.5-1.5g/L，琼脂6-8g/L，蔗糖14-27g/L。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，生根壮苗培养基由以下成分组成：花宝1号2g/L，硝酸钾1.5g/L，七水硫酸亚铁27.8mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠37.3g/L，水解酪蛋白3g/L，腺嘌呤1g/L，土豆泥20g/L，香蕉泥50g/L，椰子汁100ml/L，活性炭1g/L，琼脂7g/L，蔗糖20g/L。
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