CN105309312B - 一种中华石蝴蝶组织培养快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种中华石蝴蝶组织培养快速繁殖的方法,包括如下步骤:(1)取中华石蝴蝶幼嫩的叶片作为外植体进行消毒;(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导出无菌芽;(3)将无菌芽置于MS诱导培养基中进行壮苗培养获得健壮的植株;(4)将所述健壮植株置于MS生根培养基中进行培养得到完整的生根;(5)取完整的生根苗进行炼苗后在沙土壤中生长一个月,再移栽至大田。采用本发明所述方法得到的植株粗壮、成活率高,能够在短期内提供大量优质的、适合栽培的中华石蝴蝶种苗,有效的解决中华石蝴蝶规模化育苗的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养快速繁殖方法,特别是一种中华石蝴蝶组织培养快速繁殖方法。
背景技术
中华石蝴蝶(Petrocosmea sinensis Oliv.)系苦苣苔科石蝴蝶属多年生草本,产云南北部、四川和湖北西部,生于低山阴处的石上。目前,苦苣苔科(Gesneriaceae)植物在全世界约有140属,2000余种,中国有58属463种,从辽宁到海南均有分布,多数的属、种分布于分布于云南、广西和广东等省热带及亚热带的石灰岩的陡崖上。
中华石蝴蝶花色美丽,具有很高的观赏价值。同时也是一种中药材,以全草入药,具要清热解表、健脾和胃,用于治疗感冒,小儿疳积等症状。中华石蝴蝶地域分布的范围有限,生长于低山阴处的石上,近年来随着市场需求的不断增大,民间的采挖,使其生长环境受到不同程度的破坏,其资源濒临枯竭,而生产上难以实现大面积的栽培。
发明内容
本发明的目的是提供一种中华石蝴蝶组织培养快速繁殖方法,它可以有效的缩短中华石蝴蝶的生产周期,提高种苗的质量,减低生产的成本,从而大大的满足中华石蝴蝶生产上的需要。
本发明通过以下技术方案达到上述目的:一种中华石蝴蝶组织培养快速繁殖方法,包括以下步骤:
(1)外植体的选择和消毒:取中华石蝴蝶的幼嫩叶片作为外植体,将外植体在流水下缓慢冲洗,并去除外植体表面的污垢,放入烧杯中,用2v/v%的洗洁精液浸泡15min后,再用流水冲洗10min,将外植体移至超净工作台上,用75v/v%的酒精表面消毒15s,再用添加了1-2滴吐温-20的100ml浓度为0.1v/v%HgC12消毒8~15min,无菌水浸泡3次,用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种,其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水;
(2)不定芽的诱导:将步骤(1)得到的外植体接种到MS诱导培养基中,在培养温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养15d获得不定芽,所述MS诱导培养基中还加入0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA,30g/L蔗糖,4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(3)丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)得到的不定芽接种到丛生芽MS诱导培养基中,在培养温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养15d获得丛生芽,所述丛生芽MS诱导培养基中添加0.5~1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1~0.4mg/L的萘乙酸NAA、0.1~0.4mg/L的吲哚乙酸IAA,30g/L蔗糖,4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的丛生芽切割成单芽接种于MS壮苗培养基中,在温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养30d得到健壮植株,所述MS壮苗培养基中添加1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(5)健壮植株生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株接种到MS生根培养基中,在温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养30d,获得根系发达的生根苗,所述MS生根培养基中添加0.1~1.0mg/L的吲哚丁酸IBA、0.1~0.5mg/L的萘乙酸NAA、0~1g/L的活性炭AC、30g/L蔗糖和4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(6)生根苗的炼苗与移栽:将步骤(5)中得到的生根苗在25℃的大棚内打开瓶盖,炼苗3d,取出生根苗,洗净根部的培养基,移栽到沙土壤中进行生长30d,培养条件为温度23~30℃,光照为自然光,大棚上部覆盖一层遮阳网,遮光度为15~30%,相对湿度为85~90%,获得根系发达,适宜移栽的完整植株后移栽至育苗大田。
本发明的突出优点在于:
(1)通过叶片诱导培养出芽,在短时间内培育出大量长势良好的可供移栽的中华石蝴蝶幼苗,提供优质种苗,满足生产上的需要。
(2)采用6-BA、NAA、2,4-D、IAA植物外源激素,能够提高种苗的生产速率,缩短培养时间,采用活性炭可促进生根。
(3)在壮苗培养基上培养获得的无菌植株,健康粗壮、颜色翠绿、无玻璃化现象,接种到生根培养基上生根情况良好,生根率达到99.3%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
实施例1
本发明所述的中华石蝴蝶组织培养快速繁殖方法的一个实例,包括如下步骤:
(1)外植体的选择和消毒:取中华石蝴蝶的幼嫩叶片作为外植体,将外植体在流水下缓慢冲洗,并用软毛刷轻轻的擦拭去除表面的污垢,放入烧杯中,用2v/v%的洗洁精液浸泡15min后,再用流水冲洗10min。将外植体移至超净工作台上,75v/v%的酒精表面消毒15s,再用添加了1-2滴吐温-20的100ml浓度为0.1v/v%HgC12消毒8、12、15min,无菌水浸泡3次,用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种,其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)不定芽的诱导:将步骤(1)得到的外植体接种到MS诱导培养基中,在培养温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养15d获得不定芽,所述MS诱导培养基中添加0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA,30g/L蔗糖,4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
(3)丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)得到的不定芽接种到MS繁殖培养基中,在培养温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养15d获得丛生芽,所述MS繁殖培养基中添加0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA,30g/L蔗糖,4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,芽增殖的倍数为6.2。
(4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的丛生芽切割成单芽,接种于MS壮苗培养基中,在温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养30d得到健壮植株,所述MS壮苗培养基中添加1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
(5)健壮植株生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株接种到MS生根培养基中,在温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养30d,获得根系发达的生根苗,所述MS生根培养基中添加0.1mg/L的吲哚丁酸IBA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、1.0g/L的活性炭AC、30g/L蔗糖和4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
(6)生根苗的炼苗与移栽:将步骤(5)中得到的生根苗取出,在25℃的大棚内打开瓶盖,炼苗3d。洗净根部残留培养基后,移栽到沙土壤中进行生长30d,培养条件为温度23~30℃,光照为自然光,大棚上部覆盖一层遮阳网,遮光度为15~30%,相对湿度为85~90%。获得根系发达,适宜移栽的完整植株后移栽至育苗大田。
实施例2
本发明所述的中华石蝴蝶组织培养快速繁殖方法的一个实例,包括如下步骤:
(1)外植体的选择和消毒:取中华石蝴蝶的幼嫩叶片作为外植体,将外植体在流水下缓慢冲洗,并用软毛刷轻轻的擦拭去除表面的污垢,放入烧杯中,用2v/v%的洗洁精液浸泡15min后,再用流水冲洗10min。将外植体移至超净工作台上,75v/v%的酒精表面消毒15s, 再用添加了1-2滴吐温-20的100ml浓度为0.1v/v%HgC12消毒8、12、15min,无菌水浸泡3次,用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种,其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)不定芽的诱导:将步骤(1)得到的外植体接种到MS诱导培养基中,在培养温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养15d获得不定芽,所述MS诱导培养基中添加0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA,30g/L蔗糖,4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
(3)丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)得到的不定芽接种到MS繁殖培养基中,在培养温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养15d获得丛生芽,述MS繁殖培养基中添加1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、0.1mg/L的吲哚乙酸IAA,30g/L蔗糖,4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,芽增殖的倍数为7.8。
(4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的丛生芽切割成单芽接种于MS壮苗培养基中,温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养30d得到健壮植株,所述MS壮苗培养基中添加1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
(5)健壮植株生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株接种到MS生根培养基中,温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养30d,获得根系发达的生根苗,所述MS生根培养基中添加0.5mg/L的吲哚丁酸IBA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、1.0g/L的活性炭AC、30g/L蔗糖和4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
(6)生根苗的炼苗与移栽:将步骤(5)中得到的生根苗取出20瓶,每瓶15株,共300株,在25℃的大棚内打开瓶盖,向瓶中加入适量的水,炼苗3d。洗净根部残留培养基后统计生根植株为298株,生根率为99.3%,立即移栽到沙土壤中进行生长30d,培养条件为温度23~30℃,光照为自然光,大棚上部覆盖一层遮阳网,遮光度为15~30%,相对湿度为85~90%。获得根系发达,适宜移栽的完整植株后移栽至育苗大田。
实施例3
本发明所述的中华石蝴蝶组织培养快速繁殖方法的一个实例,包括如下步骤:
(1)外植体的选择和消毒:取中华石蝴蝶的幼嫩叶片作为外植体,将外植体在流水下缓慢冲洗,并用软毛刷轻轻的擦拭去除表面的污垢,放入烧杯中,用2v/v%的洗洁精液浸泡15min后,再用流水冲洗10min。将外植体移至超净工作台上,75v/v%的酒精表面消毒15s,再用添加了1-2滴吐温-20的100ml浓度为0.1v/v%HgC12消毒8、12、15min,无菌水浸泡3次,用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种,其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)不定芽的诱导:将步骤(1)得到的外植体接种到MS诱导培养基中,在培养温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养15d获得不定芽,所述MS诱导培养基中添加0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA,30g/L蔗糖,4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
(3)丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)得到的不定芽接种到MS繁殖培养基中,在培养温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养15d获得丛生芽,述MS繁殖培养基中添加1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.4mg/L的萘乙酸NAA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA,30g/L蔗糖,4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,芽增殖的倍数为7.1。
(4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的丛生芽切割成单芽接种于MS壮苗培养基中,温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养30d得到健壮植株,所述MS壮苗培养基中添加1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
(5)健壮植株生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株接种到MS生根培养基中,温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养30d,获得根系发达的生根苗,所述MS生根培养基中添加0.5mg/L的吲哚丁酸IBA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
(6)生根苗的炼苗与移栽:将步骤(5)中得到的生根苗取出20瓶,每瓶15株,共300株,在25℃的大棚内打开瓶盖,向瓶中加入适量的水,炼苗3d。洗净根部残留培养基后统计生根植株为285株,生根率为90.5%,立即移栽到沙土壤中进行生长30d,培养条件为温度23~30℃,光照为自然光,大棚上部覆盖一层遮阳网,遮光度为15~30%,相对湿度为85~90%。获得根系发达,适宜移栽的完整植株后移栽至育苗大田。
实施例4
本发明所述的中华石蝴蝶组织培养快速繁殖方法的一个实例,包括如下步骤:
(1)外植体的选择和消毒:取中华石蝴蝶的幼嫩叶片作为外植体,将外植体在流水下缓慢冲洗,并用软毛刷轻轻的擦拭去除表面的污垢,放入烧杯中,用2v/v%的洗洁精液浸泡15min后,再用流水冲洗10min。将外植体移至超净工作台上,75v/v%的酒精表面消毒15s,再用添加了1-2滴吐温-20的100ml浓度为0.1v/v%HgC12消毒8、12、15min,无菌水浸泡3次,用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种,其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)不定芽的诱导:将步骤(1)得到的外植体接种到MS诱导培养基中,在培养温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养15d获得不定芽,所述MS诱导培养基中添加0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA,30g/L蔗糖,4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
(3)丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)得到的不定芽接种到MS繁殖培养基中,在培养温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养15d获得丛生芽,述MS繁殖培养基中添加1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.4mg/L的萘乙酸NAA、0.1mg/L的吲哚乙酸IAA,30g/L蔗糖,4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,芽增殖的倍数为5.1。
(4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的丛生芽切割成单芽接种于MS壮苗培养基中,温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养30d得到健壮植株,所述MS壮苗培养基中添加1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
(5)健壮植株生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株接种到MS生根培养基中,温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养30d,获得根系发达的生根苗,所述MS生根培养基中添加1.0mg/L的吲哚丁酸IBA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、1.0g/L的活性炭AC、30g/L蔗糖和4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8。
(6)生根苗的炼苗与移栽:将步骤(5)中得到的生根苗取出20瓶,每瓶15株,共300株,在25℃的大棚内打开瓶盖,向瓶中加入适量的水,炼苗3d。洗净根部残留培养基后统计生根植株为290株,生根率为96.7%,立即移栽到沙土壤中进行生长30d,培养条件为温度23~30℃,光照为自然光,大棚上部覆盖一层遮阳网,遮光度为15~30%,相对湿度为85~90%。获得根系发达,适宜移栽的完整植株后移栽至育苗大田。
Claims (1)
1.一种中华石蝴蝶组织培养快速繁殖方法,其特征在于:该方法包括以下步骤:
(1)外植体的选择和消毒:取中华石蝴蝶的幼嫩叶片作为外植体,将外植体在流水下缓慢冲洗,并去除外植体表面的污垢,放入烧杯中,用2v/v%的洗洁精液浸泡15min后,再用流水冲洗10min,将外植体移至超净工作台上,用75v/v%的酒精表面消毒15s,再用添加了1-2滴吐温-20的100ml浓度为0.1v/v%HgC12消毒8~15min,无菌水浸泡3次,用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种,其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水;
(2)不定芽的诱导:将步骤(1)得到的外植体接种到MS诱导培养基中,在培养温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养15d获得不定芽,所述MS诱导培养基中还加入0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA,30g/L蔗糖,4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(3)丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)得到的不定芽接种到丛生芽MS诱导培养基中,在培养温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养15d获得丛生芽,所述丛生芽MS诱导培养基中添加0.5~1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1~0.4mg/L的萘乙酸NAA、0.1~0.4mg/L的吲哚乙酸IAA,30g/L蔗糖,4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的丛生芽切割成单芽接种于MS壮苗培养基中,在温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养30d得到健壮植株,所述MS壮苗培养基中添加1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(5)健壮植株生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株接种到MS生根培养基中,在温度为25±3℃,平均光照为1500-2200lx,光照时间为12d/h条件下培养30d,获得根系发达的生根苗,所述MS生根培养基中添加0.1~1.0mg/L的吲哚丁酸IBA、0.1~0.5mg/L的萘乙酸NAA、0~1g/L的活性炭AC、30g/L蔗糖和4.0g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(6)生根苗的炼苗与移栽:将步骤(5)中得到的生根苗在25℃的大棚内打开瓶盖,炼苗3d,取出生根苗,洗净根部的培养基,移栽到沙土壤中进行生长30d,培养条件为温度23~30℃,光照为自然光,大棚上部覆盖一层遮阳网,遮光度为15~30%,相对湿度为85~90%,获得根系发达,适宜移栽的完整植株后移栽至育苗大田。
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