CN113455223A - 一种长春花高感柑橘黄龙病模型的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种长春花高感柑橘黄龙病模型的制备方法及其应用。本申请通过叶片的嫁接方式向健康的长春花植株中接种黄龙病病原菌，使用该方法时，通过控制接种叶片的感病级别和控制砧木的生长状态、通过后期的保湿管理使得长春花植株能快速的感染柑橘黄龙病，为批量获得长春花高感柑橘黄龙病模型提供了一个可靠有效的方法；通过比对，该方法相对于传统的膜嫁接方法效率提高了3倍，且植株感病率与现有的嫁接方法感病率相当；同时，还在该模型的基础上以氨苄青霉素作为阳性对照，得出本模型能用于筛选抑制柑橘黄龙病药物的应用，同时，还摸索出了氨苄青霉素的最佳施用条件。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种长春花高感柑橘黄龙病模型的制备方法及其应用。
【背景技术】
柑橘黄龙病是柑橘常见的一种细菌性病害，其具有病原细菌无法体外培养、在柑橘植株内潜伏期长、显症慢的特性，为此，柑橘植株本身并不适合用于黄龙病的研究。在现有技术中发现：长春花作为柑橘黄龙病菌的天然寄主，病原菌能在其体内进行快速繁殖，目前也有关于利用长春花制备柑橘黄龙病模式植物的报道，例如，申请号为：201310691324.X，发明名称为《利用长春花筛选抗韧皮部杆菌药物的方法》：该方法也是利用长春花为试材，进行快速筛选药物的方法，但是该方法是通过将菟丝子的吸器与寄主植物维管束相连接，嫁接速度慢而且接种成功率不高；通过大量的文献查阅发现，现有技术中，多数通过使用长春花枝条来进行接种，通过枝条接种其感染率可以得到保障，但是多数需要使用捆绑的方式来完成整个嫁接过程，嫁接效率慢，而且较为繁琐。
在进行柑橘黄龙病的药物筛选过程中，需要大量的模式植物，嫁接方法过于繁琐且复杂的话并不利于高感柑橘黄龙病模式植物的建立，不利于进行大规模的集约化、集群化、规模化的筛选，药物筛选进程进展缓慢，不利于对药物的开发，为此，有必要对接种方法进行改进，发明出一种高效、快速的接种方法，不仅能提高高感植株的嫁接效率，还能进一步提高对抗柑橘黄龙病药物的筛选效率，与此同时在利用高效嫁接感病植株基础上对有报道的有一定抑制作用氨苄青霉素药物进行测试，从而探究出以氨苄青霉素为阳性对照用药的最佳用药方式、用药时间、用药浓度从而较快地筛选获得具有显著抗病能力的小分子药物，为防治柑橘黄龙病提供理论依据，并探索小分子药物防治新途径。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要对接种方法进行改进，发明出一种高效、快速的接种方法，不仅能提高高感植株的嫁接效率，还能进一步提高对抗柑橘黄龙病药物的筛选效率。
为达到上述目的，本发明采用如下方法来实现：
长春花高感柑橘黄龙病模型的制备方法，所述方法为：选取黄龙病感病Ⅲ级的感病长春花植株叶片做为接穗；选取健康的长春花植株做为砧木，对砧木进行去顶处理后，从去顶处垂直向下劈开一个嫁接口，然后将接穗直接插入嫁接口中，通过嫁接夹固定，完成嫁接过程；之后将嫁接好的长春花植株放入薄膜棚中进行保湿，完成模型制备。
其中，感病Ⅲ级的感病长春花植株其判断指标为：植株40-70％叶片呈现黄龙病病症，双枝条或多枝条植株中嫁接枝条全部显症；另外的枝条也有30-50％左右的叶片呈现黄化病症，有些植株伴随有叶片凋落、不再长出新芽或新芽生长缓慢、不能成花或变小变畸形。
进一步的，所述砧木为长到5-9对真叶时的健康长春花植株；所述接穗为黄化面积占比1％-75％的感病长春花叶片。
进一步的，所述砧木为长到5对真叶时的健康长春花植株、接穗为黄化面积占比1％-50％的感病长春花叶片；
或所述砧木为长到7对真叶时的健康长春花植株、接穗为黄化面积占比1％-25％和/或接穗为黄化面积占比51％-75％的感病长春花叶片；
或所述砧木为长到9对真叶时的健康长春花植株、接穗为黄化面积占比1％-75％的感病长春花叶片。
本申请的黄化面积占比计算公式为：(长春花单片叶片黄化面积/长春花叶片总面积)×100％。
进一步的，所述保湿方法为：嫁接前将植株浇透水，嫁接后立即放入用塑料薄膜搭建的拱棚中进行保湿管理；保湿时，拱棚内的相对湿度保持在至少80％，保湿时间至少为10d。
进一步的，所述保湿时间为10-20d。
本发明还包括一种所述方法制备得到的长春花高感柑橘黄龙病模型在筛选抑制柑橘黄龙病药物中的应用。
本发明还包括一种应用氨苄青霉素防治柑橘黄龙病的方法，所述方法为：应用前述方法制备得到长春花高感柑橘黄龙病模型植株，然后将氨苄青霉素用水配制成浓度为100mg/L-200mg/L的溶液，之后对所述长春花高感柑橘黄龙病模型植株进行喷施；喷施的时间不能晚于接种病原菌后的第10d。
进一步的，所述氨苄青霉素的浓度为200mg/L。
本发明具有以下有益效果：
本申请通过叶片的嫁接方式向健康的长春花植株中接种黄龙病病原菌，使用叶片和嫁接夹嫁接时，其嫁接的速度更快，而且效率更高；能快速的将感病叶片的病原菌接种到植株上，但是由于采用叶片嫁接时，由于叶片的管束纤维不像枝条那么充足，其接种的感染率，并没有枝条的感染率突出，为此，在很长时间内并没有关于叶片嫁接的研究，但是申请人在实际工作中发现：枝条+膜嫁接的方法并不适合用于生产大规模的长春花感病植株，因此通过不断调整接穗、嫁接方法和管理方法摸索出了一套“叶片+嫁接夹”嫁接的快速生产感病长春花的方法，该方法通过严格选取接穗、砧木、并且控制嫁接管理的湿度达到显著提升叶片嫁接的感病率，同时该操作相比于膜嫁接的方法更为简便，有效提高了高感黄龙病长春花植株的建立能力，是一种快速、高效生产高感黄龙病长春花植株的方法，同时，通过对氨苄青霉素的合理应用证明该模式植物可用于筛选抗黄龙病药物；通过对氨苄青霉素施用条件的摸索得出氨苄青霉素在对抗柑橘黄龙病病菌的最佳施用条件。
【附图说明】
图1为嫁接三种不同感病程度病叶的长春花感病率结果图；
图2为膜嫁接感病叶片长春花的嫁接示意图；
图3为夹子嫁接感病叶片长春花的嫁接示意图；
图4为1级黄化面积占比的长春花叶片；
图5为2级黄化面积占比的长春花叶片；
图6为3级黄化面积占比的长春花叶片；
图7为4级黄化面积占比的长春花叶片；
图8为不同保湿时间的长春花叶片感病率；
图9为砧木长到5对叶时不同黄化面积占比为接穗的嫁接结果图；
图10为砧木长到7对叶时不同黄化面积占比为接穗的嫁接结果图；
图11为砧木长到9对叶时不同黄化面积占比为接穗的嫁接结果图；
图12为嫁接病原菌第32d后采用喷雾方法施药的结果图；图中，a为施药后第30d长春花的状态、b为施药后第60d长春花的状态、c为施药后第90d长春花的状态；
图13为嫁接病原菌第32d后采用滴灌方法施药的结果图；图中，a为施药后第30d长春花的状态、b为施药后第60d长春花的状态；
图14为嫁接病原菌第32d后CK组的结果图；图中，a为施药后第30d长春花的状态；
图15为嫁接病原菌第21d后采用喷雾方法施药的结果图；图中，a为施药后第30d长春花的状态、b为施药后第60d长春花的状态、c为施药后第90d长春花的状态；
图16为嫁接病原菌第21d后采用滴灌方法施药的结果图；图中，a为施药后第30d长春花的状态、b为施药后第60d长春花的状态、c为施药后第90d长春花的状态；
图17为嫁接病原菌第21d后CK组的结果图；图中，a为施药后第30d长春花的状态、b为施药后第60d长春花的状态、c为施药后第90d长春花的状态；
图18为嫁接病原菌第9d后采用喷雾方法施药的结果图；图中，a为施药后第30d长春花的状态、b为施药后第60d长春花的状态、c为施药后第90d长春花的状态；
图19为嫁接病原菌第9d后采用滴灌方法施药的结果图；图中，a为施药后第30d长春花的状态、b为施药后第60d长春花的状态、c为施药后第90d长春花的状态；
图20为嫁接病原菌第9d后CK组的结果图；图中，a为施药后第30d长春花的状态、b为施药后第60d长春花的状态、c为施药后第90d长春花的状态。
图21为嫁接病原菌第10d后喷施100mg/L氨苄青霉素的感病长春花第60d生长状态图；
图22为嫁接病原菌第20d后喷施100mg/L氨苄青霉素的感病长春花第60d生长状态图；
图23为嫁接病原菌第30d后喷施100mg/L氨苄青霉素的感病长春花第60d生长状态图；
图24为嫁接病原菌第10d后喷施200mg/L氨苄青霉素的感病长春花第60d生长状态图；
图25为嫁接病原菌第20d后喷施200mg/L氨苄青霉素的感病长春花第60d生长状态图；
图26为嫁接病原菌第30d后喷施200mg/L氨苄青霉素的感病长春花第60d生长状态图；
图27为不进行氨苄青霉素喷施的对照组感病长春花第60d生长状态图。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例为制备高感黄龙病长春花模型的方法，该方法包括如下步骤：
(1)栽培长春花植株：选择长春花种子进行灭菌、催芽，发芽栽培，栽培时选择生长良好、枝条粗壮的健康长春花植株作为砧木，去除砧木的顶芽，并在砧木上开口；
(2)选出已感染了黄龙病并显现出黄化、斑驳病症的长春花病株的叶片或顶芽作为接穗；
(3)将接穗叶片插入砧木切口并对齐贴紧之后，选择大小与枝条粗细合适的嫁接夹从接穗插入一侧夹住，避免因嫁接夹过小而压伤植株或将接穗挤出，或因嫁接夹过大而使接穗与砧木接触不严密；
(4)嫁接前植株浇透水，嫁接后立即放入提前搭好的小拱棚中进行保湿管理。
(5)嫁接后十天内将小拱棚严密封好，使拱棚内的相对湿度保持在至少90％，结束保湿操作后将小拱棚打开；
上述步骤(2)中的长春花感病叶片的感染情况按照如下方法分为如下几级：
感病0级：未显现症的植株；
感病Ⅰ级：植株开始显症，显症叶片小于10％，尽在嫁接点附近叶片呈现黄化症状(在叶片上呈现黄色斑点)。其它枝条未显症状；
感病Ⅱ级：植株10-40％的叶片呈现黄化病症；
感病Ⅲ级：植株40-70％叶片呈现黄龙病病症，双枝条或多枝条植株中嫁接枝条全部显症；另外的枝条也有30-50％左右的叶片呈现黄化病症，有些植株伴随有叶片凋落、不再长出新芽或新芽生长缓慢、不能成花或变小变畸形；
感病Ⅳ级：植株70-90％以上的叶片呈现黄化病症，双枝条或多枝条植株中，嫁接病叶的枝条全部叶片显症；另外枝条有50-80％的叶片呈现病症，有些植株或有叶片凋落、或顶芽畸形、或不能成花、或生长缓慢缺乏生气、或无新生芽叶但生长缓慢，或以上几种症状并发；
感病Ⅴ级：植株全株叶片(100％)呈现黄化病症，有些植株大量落叶，不能成花，生长缓慢；
感病Ⅵ级：植株萎蔫死亡。
本实施例可选任意一级叶片做为接穗叶片；申请人在实验时对不同级别的感病叶片进行了实验操作，最终得出结果如图1所示：从图中可以看出，感病Ⅰ级的叶片做为接穗嫁接后长春花黄龙病的发病率为21％、感病Ⅱ级的叶片做为接穗嫁接后长春花黄龙病的发病率为36％、感病Ⅲ级的叶片做为接穗嫁接后长春花黄龙病的发病率为77％，而感病Ⅴ级以上叶片由于黄化严重，成活率不高，用其做为接穗反而导致接种后的长春花发病率降低，因此，申请人认为感病Ⅲ级的长春花植株叶片为接穗的最优选择。
实施例2：
本实施例是针对实施例1进行的进一步研究，主要是针对不同嫁接材料、嫁接方式对长春花感病率的影响：
具体方案为：优选实施例1中感病为Ⅲ级的长春花植株做为材料来进行嫁接，选取感病Ⅲ级的长春花的芽和长春花的叶片做为接穗，通过膜接和夹子嫁接的方式来完成嫁接：
①薄膜嫁接方法如图2所示：用手术刀将健康长春花枝条顶部第一对完全叶以上的顶芽部分横切一刀去除，在切面上韧皮部的位置从上向下纵切出一厘米左右的接口，用手术刀将接穗叶柄一厘米处削成楔形并及时地插入砧木切口中对齐贴紧，再用薄膜将嫁接位点缠绕包好，可起到固定接穗叶片、使嫁接位点保持湿润的作用。
接完后及时用喷雾器喷水，并且在嫁接后3-5天内每隔3小时左右喷一次水，保持接穗叶片的活力，延迟其萎蔫的时间，确保接穗叶片能将黄龙病的病菌传到健康长春花体内。
②夹子嫁接方式如图3所示：即将固定接穗的薄膜换成了嫁接夹，在将接穗叶片插入砧木切口并对齐贴紧之后，选择大小与枝条粗细合适的嫁接夹从接穗插入一侧夹住，避免因嫁接夹过小而压伤植株或将接穗挤出，或因嫁接夹过大而使接穗与砧木接触不严密。嫁接前植株浇透水，嫁接后立即放入提前搭好的小拱棚中进行保湿管理。
本实施例中用到的顶芽接穗处理方法为：将顶芽下部一厘米处削成楔形并及时插入砧木切口中，其余操作同叶片。
采用上述两个嫁接方法嫁接后第60d，统计并计算长春花感病率；其中，感病率的计算方法为：
感病率(％)＝感病植株/(嫁接总株数-植株非病死亡数量)×100％；其结果如表1所示：
表1不同嫁接材料、嫁接方式对长春花感病率的影响
从上表可见，如采用本申请叶片做为接穗的方法进行嫁接，则选用夹子嫁接的方法其感病率要优于采用薄膜嫁接的方法；如采用现有技术的芽做为接穗的方法进行嫁接，则选用膜嫁接的方法其感病率要优于采用夹子嫁接的方法。
选取感病为Ⅲ级的长春花植株做为材料来进行嫁接时，采用感病叶片的嫁接效果要优于使用感病植株的芽。出现上述现象的具体原因还需进一步研究，经申请人的初步观察认为：感病为Ⅲ级的长春花植株的芽部分过于幼嫩，嫁接后成活率不高是导致感病率较低的其中一个原因，也有可能是长春花植株的芽部分其病原菌较少，这也导致了感病率低的原因。
经过操作统计发现，使用夹子嫁接的效率是使用膜嫁接的3倍以上，对不同的熟练操作工进行统计，发现，平均每个工人采用膜嫁接的方法一小时内可以嫁接长春花植株为30株；而采用夹子嫁接的方法一小时内可以嫁接的长春花植株至少90株。
由此可见，针对病为Ⅲ级的长春花植株，采用感病叶片为接穗，其感病效果要优于感病芽；使用感病叶片做为接穗时，采用夹子嫁接的方法其感病效果要优于薄膜嫁接，而且在不降低长春花感病的情况下，整个嫁接效率提高了3倍以上，适合大规模嫁接感病植株，以便与进行后一步能大规模的进行小分子药物筛选实验。
实施例3：
经过实施例1和实施例2的研究，申请人发现：采用感病叶片长春花为接穗嫁接长春花植株能有效提高长春花高感黄龙病模式植物的建立效率，因此，申请人在实施例1的基础上对建立长春花高感黄龙病模式植物进行了优化实验具体如下：
做为砧木的健康长春花植株长到5-9对真叶时，进行掐顶处理，然后以感病Ⅲ级的长春花植株叶片为接穗，取叶片时，通过黄化程度来计算叶片黄化面积占比，将叶片黄化面积占比分为四个等级：
1级：1-25％黄化面积占比；(如图4)
2级：26-50％黄化面积占比；(如图5)
3级：51-75％黄化面积占比；(如图6)
4级：76-100％黄化面积占比。(如图7)
黄化面积占比的计算方法为：黄化面积占比(％)＝(黄斑面积/叶片总面积)×100％；
统计长春花植株的感病率和病情指数，其中，
感病率计算方法为：感病率(％)＝(感病植株/总实验植株)×100％；
病情指数计算方法为(感病级别的分级标准参见实施例1)：
得到的结果如表2所示：
表2嫁接砧木和嫁接接穗叶片的含菌度对长春花感病的影响
由上表可知，采用叶片进行长春花嫁接黄龙病病菌时，需要选择合适生长期、合适黄化面积占比的接穗叶片；
表现在：当嫁接砧木处于5对叶片生长期时，采用黄化面积占比1级(1-25％)和2级(26-50％)的叶片为接穗其第60d的感病率可达到90％以上；从图9可见，当5对叶为接穗时，在黄化面积占比为1级(1-25％)和2级(26-50％)时，植株表现出黄化、枯萎病症的植株明显高于黄化面积占比为3级(51-75％)和4级(76-100％)与统计数据一致。
当嫁接砧木处于7对叶片生长期时，采用黄化面积占比1级(1-25％)和黄化面积占比3级(51-75％)的叶片为接穗其第60d的感病率可达到90％以上；从图10可见，当7对叶为接穗时，在黄化面积占比为3级(51-75％)时，植株表现出黄化、枯萎病症的植株明显高于黄化面积占比为1级(1-25％)、2级(26-50％)和4级(76-100％)与统计数据一致。
当嫁接砧木处于9对叶片生长期时，采用黄化面积占比1级(1-25％)、2级(26-50％)和3级(51-75％)的叶片为接穗其感病率可达到90％以上；从图11可见，当9对叶为接穗时，在黄化面积占比为1级(1-25％)、2级(26-50％)和3级(51-75％)时，植株表现出黄化、枯萎病症的植株明显高于黄化面积占比为4级(76-100％)与统计数据一致。
从图9-图11可知，从黄化程度和感病程度来讲，选取5对叶和7对叶的接穗其感病率明显高于9对叶。
实施例4：
保湿条件对长春花感黄龙病模型建立的影响：
在长春花感病模型的建立过程中，申请人还发现在采用实施例1的方法进行栽培的过程中，保湿是很重要的一个环节，申请人采用的保湿方法为：嫁接前植株浇透水，嫁接后立即放入用塑料薄膜提前搭好的拱棚中进行保湿管理。嫁接后十天内将拱棚严密封好，使拱棚内的相对湿度保持在至少80％；申请人研究了不同保湿时间下，同一批次长春花的感病情况，申请人采用的是9对叶长春花植株掐顶做为砧木，采用黄化面积占比为26-50％的叶片做为接穗进行嫁接，得到的结果如表3和图8所示：
表3保湿时间对长春花感病率的影响
| 保湿时间 | 植株数量 | 感病植株数 | 感病率(％) |
| 0d | 45 | 10 | 22.22 |
| 10d | 45 | 25 | 55.56 |
| 20d | 45 | 26 | 57.78 |
未进行保湿处理的长春花植株的黄龙病感病率仅为22.22％；连续保湿10d后长春花的黄龙病感病率提高到了55.56％；当连续保湿20d后长春花的黄龙病感病率达到了57.78％，与第10d无显著差别，由此可见，土培嫁接时，长春花嫁接完成后至少需要保湿10d，才能使长春花的感病率达到更佳。
实施例5：
采用上述高感黄龙病的长春花植株做为药物筛选的模型植株：
具体方法为：将抑制柑橘黄龙病药物配置成溶液后通过喷雾、滴灌或浇灌的方法对长春花高感柑橘黄龙病植株进行施药。
本实施例采用对黄龙病有明显抑制作用的氨苄青霉素做为抑菌药物来进行实验，方法为，将氨苄青霉素配制成浓度为100mg/L的氨苄青霉素液体，然后采用喷雾和/或滴灌的方法对长春花高感柑橘黄龙病植株进行施药；采用不同的施药方法，其施药量完全相同，施药量为30ml/株，每隔5d给一次药；另采用等量蒸馏水替代青霉素进行施药，并将蒸馏水组定为CK组，具体结果如图12-20所示：
图12-20为采用夹子嫁接病原菌第32d后才开始给药，给药的方法为喷雾或滴灌，其中图12为采用喷雾的方法给药，长春花在给药第30d、第60d、第90d的生长状态；图13为采用滴灌的方法给药，长春花在给药第30d、第60d的生长状态；图14为采用蒸馏水的CK组在给药第30d时的生长状态。图中，嫁接病原菌32d后，通过给药处理30d，对照CK组表现出基本枯黄死亡、而氨苄青霉素实验组仍有部分植株存活，在给药第60d、第90d后，喷雾给药组的长春花植株表现为正常生长；而滴灌给药组在给药第60d后表现为枯萎、死亡。
图15-17为采用夹子嫁接病原菌第21d后才开始给药，给药的方法为喷雾或滴灌，其中图15为采用喷雾的方法给药，长春花在给药第30d、第60d、第90d的生长状态；图16为采用滴灌的方法给药，长春花在给药第30d、第60d、第90d的生长状态；图17为采用蒸馏水的CK组在给药第30d、第60d、第90d的生长状态。图中，嫁接病原菌21d后，通过给药处理30d，各对照组无明显区别，而给药第60d后，喷雾给药组长春花植株表现为大部分正常生长，1株植株出现枯萎现象；而滴灌组和CK组表现为较多的植株出现枯萎现象；给药第90d后，喷雾组的长春花生长状态明显优于滴灌组和CK组。
图18-20为采用夹子嫁接病原菌第9d后才开始给药，给药的方法为喷雾或滴灌，其中图18为采用喷雾的方法给药，长春花在给药第30d、第60d、第90d的生长状态；图19为采用滴灌的方法给药，长春花在给药第30d、第60d、第90d的生长状态；图20为采用蒸馏水的CK组在给药第30d、第60d、第90d的生长状态。图中，嫁接病原菌9d后，通过喷雾给药处理在给药后第30d、第60d、第90d长春花植株正常生长，没有感病症状，而滴灌组和CK在第30d开始出现植株泛黄、在第60d出现部分植株萎凋，在第90d出现大部分植株萎凋的现象。
从上述结果中可以看出：感病的长春花植株越早给药，其对黄龙病的抑制效果越好，针对氨苄青霉素，给药方式采用喷雾给药能较好的对柑橘黄龙病起到抑制作用，而采用滴灌方式给药抑制效果不明显。
实施例6：
采用上述高感黄龙病的长春花植株对阳性对照药物最适浓度筛选的模型：
具体方法为：将抑制柑橘黄龙病药物配置成溶液后通过喷雾、滴灌或浇灌的方法对长春花高感柑橘黄龙病植株进行施药。
本实施例采用对黄龙病有明显抑制作用的氨苄青霉素做为抑菌药物来进行实验，方法为，将氨苄青霉素配制成浓度为100mg/L、200mg/L的氨苄青霉素液体，然后采用上述较优的喷雾方法对长春花高感柑橘黄龙病植株进行施药；采用不同的施药时间分别为嫁接后10d、20d、30d，其施药量完全相同，施药量为15ml/株，每隔5d给一次药；另采用等量蒸馏水替代青霉素进行施药，并将蒸馏水组定为CK组，具体结果如图21-图27和表4所示：
图21为采用夹子嫁接病原菌第10d后开始喷施100mg/L氨苄青霉素的感病长春花第60d生长状态图；
图22为采用夹子嫁接病原菌第20d后开始喷施100mg/L氨苄青霉素的感病长春花第60d生长状态图；
图23为采用夹子嫁接病原菌第30d后开始喷施100mg/L氨苄青霉素的感病长春花第60d生长状态图；
图24为采用夹子嫁接病原菌第10d后开始喷施200mg/L氨苄青霉素的感病长春花第60d生长状态图；
图25为采用夹子嫁接病原菌第20d后开始喷施200mg/L氨苄青霉素的感病长春花第60d生长状态图；
图26为采用夹子嫁接病原菌第30d后开始喷施200mg/L氨苄青霉素的感病长春花第60d生长状态图；
图27为不进行氨苄青霉素喷施的感病长春花第60d生长状态图。
从图21-图27中可见，对照CK组表现出基本枯黄死亡、而氨苄青霉素实验组仍有部分植株存活，在给药第60d后，10天用药的长春花植株表现为植株正常生长且无感黄龙病植株出现；而20天、30用药的长春花植株在给药第60d后仍表现出表现为枯萎的症状，由此说明，氨苄青霉素能有效对长春花黄龙病有抑制作用，而在嫁接病原菌第10d后开始喷施100mg/L氨苄青霉素、200mg/L氨苄青霉素的长春花长势优于其他组；从图21和图24的对比来看，喷施200mg/L氨苄青霉素的试验组比喷施100mg/L氨苄青霉素相比效果更优。
统计60d长春花植株的感病率和病情指数，其中，感病率、病情指数的计算方法参见实施例3；相对防效的计算方法如下：
具体数值参见表4：
表4不同施药条件下第60d长春花的感病情况
由表4可知，氨苄青霉素的浓度在100mg/L-200mg/L条件下，在嫁接第10d用药时能有效降低长春花模型的感病率，降低病情指数，提高相对防效，在上述浓度下，200mg/L浓度条件达到效果最优，甚至达到健康组的100％防效。
综上所述，本申请的摸索出了一套叶片嫁接黄龙病菌，批量生产感黄龙病长春花植株的方法，该方法能有效提高制备高感黄龙病长春花模式植物的能力，并且通过优化嫁接方式能有效提高长春花对黄龙病的感染能力，快速实现对长春花的接种；比膜嫁接的方法效率提高3倍，同时感染率达到87％，效果明显为建立高效、快速的长春花高感模型提供了坚实基础，且通过药物试验，证明氨苄青霉素通过喷雾的施药方法对柑橘黄龙病有较明显的抑制效果。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (8)
1.长春花高感柑橘黄龙病模型的制备方法，其特征在于，所述方法为：选取黄龙病感病Ⅲ级的感病长春花植株叶片作为接穗；选取健康的长春花植株做为砧木，对砧木进行去顶处理后，从去顶处垂直向下劈开一个嫁接口，然后将接穗直接插入嫁接口中，通过嫁接夹固定，完成嫁接过程；之后将嫁接好的长春花植株放入薄膜棚中进行保湿，完成模型制备。
2.根据权利要求1所述长春花高感柑橘黄龙病模型的制备方法，其特征在于，所述砧木为长到5-9对真叶时的健康长春花植株；所述接穗为黄化面积占比1％-75％的感病长春花叶片。
3.根据权利要求1所述长春花高感柑橘黄龙病模型的制备方法，其特征在于，所述砧木为长到5对真叶时的健康长春花植株、接穗为黄化面积占比1％-50％的感病长春花叶片；
或所述砧木为长到7对真叶时的健康长春花植株、接穗为黄化面积占比1％-25％和/或接穗为黄化面积占比51％-75％的感病长春花叶片；
或所述砧木为长到9对真叶时的健康长春花植株、接穗为黄化面积占比1％-75％的感病长春花叶片。
4.根据权利要求1所述长春花高感柑橘黄龙病模型的制备方法，其特征在于，所述保湿方法为：嫁接前将植株浇透水，嫁接后立即放入用塑料薄膜搭建的拱棚中进行保湿管理；保湿时，拱棚内的相对湿度保持在至少80％，保湿时间至少为10d。
5.根据权利要求4所述长春花高感柑橘黄龙病模型的制备方法，其特征在于，所述保湿时间优选为10-15d。
6.一种如权利要求1-5所述方法制备得到的长春花高感柑橘黄龙病模型在筛选抑制柑橘黄龙病药物中的应用。
7.一种应用氨苄青霉素防治柑橘黄龙病的方法，其特征在于，所述方法为：应用如权利要求1-5所述方法制备得到的长春花高感柑橘黄龙病模型植株，然后将氨苄青霉素用水配制成浓度为100mg/L-200mg/L的溶液，之后对所述长春花高感柑橘黄龙病模型植株进行喷施；喷施的时间不能晚于接种病原菌后的第10d。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述氨苄青霉素的浓度为200mg/L。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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