CN106718887A - 一种快速脱除马铃薯病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速脱除马铃薯病毒的方法，在常规茎尖脱毒的基础上，在剥茎尖前的3~5天，在组培苗上喷施抑制病毒的植物抗性诱导剂，包括但不限于氨基寡糖素、宁南霉素、3‑羟基‑3‑丙酮基羟吲哚等；取茎尖另行培养7~28天，再喷施1次抑制病毒的植物抗性诱导剂，取0.1~0.7 mm茎尖另行培养7~28天，如此三次，就能够获得无病毒组培苗，获得的组培苗无病毒率高于80%。该方法获得无毒组培苗的时间短，获得的组培苗带毒率低，操作简单，易于生产上推广。

Description

一种快速脱除马铃薯病毒的方法
技术领域
本发明属于植物病害防控技术领域，具体涉及一种快速脱除马铃薯病毒的方法。
背景技术
马铃薯是我国正在逐步主粮化的重要作物。马铃薯的种薯繁殖主要靠无性繁殖，极容易感染病毒。感染病毒的马铃薯，产量和质量均显著下降。马铃薯病毒病害已成为马铃薯产业的重要为害。防控马铃薯病毒病的主要方法就是茎尖脱毒，然而传统的茎尖脱毒，获得无毒苗的时间较长，一些病毒反复剥茎尖多次都较难脱除，比如马铃薯S病毒。前期也有资料公开了利用病毒唑对病毒复制的干扰，达到脱除病毒的目的。然而使用病毒唑会对植株本身产生毒害，即使在非常低的浓度条件下，植株的生长发育也会受到严重影响。在培养基中加入病毒唑，使组培苗培养时间过长，即使能脱毒也需要较长时间，不利于生产上及时获得无毒种薯。因此，开发一种能解决上述技术问题的方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速脱除马铃薯病毒的方法。
本发明的目的是这样实现的，包括预处理、脱毒、检测步骤，具体包括：
A、预处理：对含有马铃薯病毒的薯块进行赤霉素催芽处理，到出芽后，消毒备用；
B、脱毒：剥茎尖0.1~0.5mm，置于MS培养基上，于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养7~28天至茎尖长至0.5~10mm，喷施抑制病毒的植物抗性诱导剂，再于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养3~5天后，再次剥茎尖0.1~0.7mm，置于MS培养基上，于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养7~28天至茎尖长至0.5~10mm，喷施抑制病毒的植物抗性诱导剂，再于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养3~5天后，再次剥茎尖0.1~0.7mm，置于MS培养基上，反复上述步骤2~5次，每次留下5~6个茎尖继续培养，用作检测；
C、检测：将脱毒处理后长出的组培苗用电子显微镜负染色、ELISA、qRT~PCR检测，80%以上的苗不能检测到病毒。
本发明在常规茎尖脱毒的基础上，在剥茎尖前的3~5天，在组培苗上喷施抑制病毒的植物抗性诱导剂，包括但不限于氨基寡糖素、宁南霉素、3-羟基-3-丙酮基羟吲哚等；取茎尖另行培养15天，再喷施1次抑制病毒的植物抗性诱导剂，取茎尖另行培养15天，如此，三次即可脱除包括马铃薯S病毒在内的病毒。该方法获得组培苗，带毒率低，易于生产上推广。本发明选用的植物抗性诱导剂，即能抑制病毒在植物体内的复制、运动，还不影响植物正常生长。这些诱导剂本发明人均在田间或实验室试验过，根据说明书浓度使用，对植物生长发育没有影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的快速脱除马铃薯病毒的方法，包括预处理、脱毒、检测步骤，具体包括：
A、预处理：对含有马铃薯病毒的薯块进行赤霉素催芽处理，到出芽后，消毒备用；
B、脱毒：剥茎尖0.1~0.5mm，置于MS培养基上，于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养7~28天至茎尖长至0.5~10mm，喷施抑制病毒的植物抗性诱导剂，再于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养3~5天后，再次剥茎尖0.1~0.7mm，置于MS培养基上，于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养7~28天至茎尖长至0.5~10mm，喷施抑制病毒的植物抗性诱导剂，再于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养3~5天后，再次剥茎尖0.1~0.7mm，置于MS培养基上，反复上述步骤2~5次，每次留下5~6个茎尖继续培养，用作检测；
C、检测：将脱毒处理后长出的组培苗用电子显微镜负染色、ELISA、qRT~PCR检测，80%以上的苗不能检测到病毒。
A步骤中所述的消毒为砷汞消毒。
B步骤所述的脱毒是剥茎尖0.1~0.2mm，置于MS培养基上，于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养7~28天至茎尖长至4~6mm，喷施抑制病毒的植物抗性诱导剂，再于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养3~5天后，再次剥茎尖0.1~0.7mm，置于MS培养基上，于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养7~28天至茎尖长至4~6mm，喷施抑制病毒的植物抗性诱导剂，再于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养3~5天后，再次剥茎尖0.1~0.7mm，置于MS培养基上，反复上述步骤3次，每次留下5~6个茎尖继续培养，用作检测；
所述的植物抗性诱导剂为氨基寡糖素、宁南霉素、3-羟基-3-丙酮基羟吲哚。
C步骤所述的检测是将第三次剥茎尖后长出的组培苗用电子显微镜负染色、ELISA、qRT-PCR检测，80%以上的苗不能检测到病毒。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
马铃薯品种为云南近年来的主栽品种合作88，经电子显微镜负染色和ELISA检测，该马铃薯样品带有马铃薯S病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯M病毒、马铃薯H病毒。
材料处理：挑选马铃薯大小适中光滑的薯块，经过7～15天催芽，剪取经催芽处理的薯块的茎尖0.5～1厘米，清水漂洗，然后在超净工作台上进行严格消毒，先用75%的酒精浸泡15秒，无菌水洗2次，再用0.1%的升汞浸泡3～5分钟，无菌水冲洗3～5次，每次冲洗3分钟，用经过灭菌的吸水纸吸干，接种在Ms培养基培养7天待用。
诱导剂处理：用诱导剂：3-丙酮基-3-羟基羟吲哚（3-acetonyl-3-hydroxyoxindole，AHO）浓度2~20微克/毫升直接喷施到组培苗马铃薯的叶面上，在取茎尖前的3-5喷施1次，超过7天未取，再喷施1次。
茎尖剥离：在超净工作台上，把处理待用的马铃薯小苗茎尖剪下放培养皿放在解剖镜（放大10～20倍）下仔细剥离，直到显现出圆滑生长点时，用一次性注射用针管切取0.1～0.7毫米，带1～2个叶原基的茎尖，接种于培养基上培养。在光照培养基内培养，反复3次，每次留下5~6个茎尖继续培养，用作检测。
组培苗15天继代培养一次，45天长成小苗，每个小苗形成一个株系扩繁1瓶，20天成苗待检测。
用电子显微镜负染色、ELISA、qRT-PCR检测第三次剥茎尖后长出的组培苗，获得组培苗86.1%的不能检测到病毒。
实施例2
马铃薯品种为云南昭通主栽品种昊薯302，经电子显微镜负染色和ELISA检测，该马铃薯样品带有马铃薯S病毒。
材料处理：挑选马铃薯大小适中光滑的薯块，经过7～15天催芽，剪取经催芽处理的薯块的茎尖0.5～1厘米，清水漂洗，然后在超净工作台上进行严格消毒，先用75%的酒精浸泡15秒，无菌水洗2次，再用0.1%的升汞浸泡3～5分钟，无菌水冲洗3～5次，每次冲洗3分钟，用经过灭菌的吸水纸吸干，接种在Ms培养基培养7天待用。
诱导剂处理：用诱导剂：3-丙酮基-3-羟基羟吲哚（3-acetonyl-3-hydroxyoxindole，AHO）浓度2~20微克/毫升直接喷施到组培苗马铃薯的叶面上，在取茎尖前的3-5喷施1次，超过7天未取，再喷施1次。
茎尖剥离：在超净工作台上，把处理待用的马铃薯小苗茎尖剪下放培养皿放在解剖镜（放大10～20倍）下仔细剥离，直到显现出圆滑生长点时，用一次性注射用针管切取0.1～0.7毫米，带1～2个叶原基的茎尖，接种于培养基上培养。在光照培养基内培养，反复3次，每次留下5~6个茎尖继续培养，用作检测。
组培苗15天继代培养一次，45天长成小苗，每个小苗形成一个株系扩繁1瓶，20天成苗待检测。
用电子显微镜负染色、ELISA、qRT-PCR检测第三次剥茎尖后长出的组培苗，获得组培苗100%的不能检测到病毒。
实施例3
马铃薯品种为云南曲靖主栽品种靖薯3号、4号，经电子显微镜负染色和ELISA检测，该马铃薯样品带有马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒。
材料处理：挑选马铃薯大小适中光滑的薯块，经过7～15天催芽，剪取经催芽处理的薯块的茎尖0.5～1厘米，清水漂洗，然后在超净工作台上进行严格消毒，先用75%的酒精浸泡15秒，无菌水洗2次，再用0.1%的升汞浸泡3～5分钟，无菌水冲洗3～5次，每次冲洗3分钟，用经过灭菌的吸水纸吸干，接种在Ms培养基培养7天待用。
诱导剂处理：用诱导剂：宁南霉素浓度60~80微克/毫升直接喷施到组培苗马铃薯的叶面上，在取茎尖前的3-5喷施1次，超过7天未取，再喷施1次。
茎尖剥离：在超净工作台上，把处理待用的马铃薯小苗茎尖剪下放培养皿放在解剖镜（放大10～20倍）下仔细剥离，直到显现出圆滑生长点时，用一次性注射用针管切取0.1～0.7毫米，带1～2个叶原基的茎尖，接种于培养基上培养。在光照培养基内培养，反复3次，每次留下5~6个茎尖继续培养，用作检测。
组培苗15天继代培养一次，45天长成小苗，每个小苗形成一个株系扩繁1瓶，20天成苗待检测。
用电子显微镜负染色、ELISA、qRT-PCR检测第三次剥茎尖后长出的组培苗，获得组培苗80.2%的不能检测到病毒。
实施例4
马铃薯品种为云南近年来的主栽品种合作88，经电子显微镜负染色和ELISA检测，该马铃薯样品带有马铃薯S病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯M病毒、马铃薯H病毒。
材料处理：挑选马铃薯大小适中光滑的薯块，经过7～15天催芽，剪取经催芽处理的薯块的茎尖0.5～1厘米，清水漂洗，然后在超净工作台上进行严格消毒，先用75%的酒精浸泡15秒，无菌水洗2次，再用0.1%的升汞浸泡3～5分钟，无菌水冲洗3～5次，每次冲洗3分钟，用经过灭菌的吸水纸吸干，接种在Ms培养基培养7天待用。
诱导剂处理：用诱导剂：氨基寡糖素，喷施浓度150~200微克/毫升直接喷施到组培苗马铃薯的叶面上，在取茎尖前的3-5喷施1次，超过7天未取，再喷施1次。
茎尖剥离：在超净工作台上，把处理待用的马铃薯小苗茎尖剪下放培养皿放在解剖镜（放大10～20倍）下仔细剥离，直到显现出圆滑生长点时，用一次性注射用针管切取0.1～0.7毫米，带1～2个叶原基的茎尖，接种于培养基上培养。在光照培养基内培养，反复3次，每次留下5~6个茎尖继续培养，用作检测。
组培苗15天继代培养一次，45天长成小苗，每个小苗形成一个株系扩繁1瓶，20天成苗待检测。
用电子显微镜负染色、ELISA、qRT-PCR检测第三次剥茎尖后长出的组培苗，获得组培苗83.1%的不能检测到病毒。
实施例5
马铃薯品种为云南近年来的主栽品种合作88，经电子显微镜负染色和ELISA检测，该马铃薯样品带有马铃薯S病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯M病毒、马铃薯H病毒。
材料处理：挑选马铃薯大小适中光滑的薯块，经过7～15天催芽，剪取经催芽处理的薯块的茎尖0.5～1厘米，清水漂洗，然后在超净工作台上进行严格消毒，先用75%的酒精浸泡15秒，无菌水洗2次，再用0.1%的升汞浸泡3～5分钟，无菌水冲洗3～5次，每次冲洗3分钟，用经过灭菌的吸水纸吸干，接种在Ms培养基培养7天待用。
诱导剂处理：用诱导剂：3-丙酮基-3-羟基羟吲哚（3-acetonyl-3-hydroxyoxindole，AHO）浓度2~20微克/毫升直接喷施到组培苗马铃薯的叶面上，在取茎尖前的3-5喷施1次，超过7天未取，再喷施1次。
茎尖剥离：在超净工作台上，把处理待用的马铃薯小苗茎尖剪下放培养皿放在解剖镜（放大10～20倍）下仔细剥离，直到显现出圆滑生长点时，用一次性注射用针管切取0.1～0.7毫米，带1～2个叶原基的茎尖，接种于培养基上培养。在光照培养基内培养，反复3次，每次留下5~6个茎尖继续培养，用作检测。
组培苗15天继代培养一次，45天长成小苗，每个小苗形成一个株系扩繁1瓶，20天成苗待检测。
用电子显微镜负染色、ELISA、qRT-PCR检测第三次剥茎尖后长出的组培苗，获得组培苗86.1%的不能检测到病毒。
实施例6
马铃薯品种为云南迪庆主栽品种格咱红皮，经电子显微镜负染色和ELISA检测，该马铃薯样品带有马铃薯S病毒。
材料处理：挑选马铃薯大小适中光滑的薯块，经过7～15天催芽，剪取经催芽处理的薯块的茎尖0.5～1厘米，清水漂洗，然后在超净工作台上进行严格消毒，先用75%的酒精浸泡15秒，无菌水洗2次，再用0.1%的升汞浸泡3～5分钟，无菌水冲洗3～5次，每次冲洗3分钟，用经过灭菌的吸水纸吸干，接种在Ms培养基培养7天待用。
诱导剂处理：用诱导剂：3-丙酮基-3-羟基羟吲哚（3-acetonyl-3-hydroxyoxindole，AHO），浓度2~20微克/毫升，直接喷施到组培苗马铃薯的叶面上，在取茎尖前的3-5喷施1次，超过7天未取，再喷施1次。
茎尖剥离：在超净工作台上，把处理待用的马铃薯小苗茎尖剪下放培养皿放在解剖镜（放大10～20倍）下仔细剥离，直到显现出圆滑生长点时，用一次性注射用针管切取0.1～0.7毫米，带1～2个叶原基的茎尖，接种于培养基上培养。在光照培养基内培养，反复3次，每次留下5~6个茎尖继续培养，用作检测。
组培苗15天继代培养一次，45天长成小苗，每个小苗形成一个株系扩繁1瓶，20天成苗待检测。
用电子显微镜负染色、ELISA、qRT-PCR检测第三次剥茎尖后长出的组培苗，获得组培苗100%的不能检测到病毒。

Claims (5)

1.一种快速脱除马铃薯病毒的方法，其特征在于包括预处理、脱毒、检测步骤，具体包括：
A、预处理：对含有马铃薯病毒的薯块进行赤霉素催芽处理，到出芽后，消毒备用；
B、脱毒：剥茎尖0.1~0.5mm，置于MS培养基上，于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养7~28天至茎尖长至0.5~10mm，喷施抑制病毒的植物抗性诱导剂，再于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养3~5天后，再次剥茎尖0.1~0.7mm，置于MS培养基上，于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养7 ~ 28天至茎尖长至0.5~10mm，喷施抑制病毒的植物抗性诱导剂，再于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养3~5天后，再次剥茎尖0.1~0.7mm，置于MS培养基上，反复上述步骤2~5次，每次留下5~6个茎尖继续培养，用作检测；
C、检测：将脱毒处理后长出的组培苗用电子显微镜负染色、ELISA、qRT~PCR检测，96%以上的苗不能检测到病毒。
2.根据权利要求1所述的快速脱除马铃薯病毒的方法，其特征在于A步骤中所述的消毒为砷汞消毒。
3.根据权利要求1所述的快速脱除马铃薯病毒的方法，其特征在于B步骤所述的脱毒是剥茎尖0.1~0.5mm，置于MS培养基上，于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养7~28天至茎尖长至4~6mm，喷施抑制病毒的植物抗性诱导剂，再于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养3~5天后，再次剥茎尖0.1~0.7mm，置于MS培养基上，于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养7~28天至茎尖长至4~6mm，喷施抑制病毒的植物抗性诱导剂，再于温度20~30℃，光照度2000~3000Lx下培养3~5天后，再次剥茎尖0.1~0.7mm，置于MS培养基上，反复上述步骤3次，每次留下5~6个茎尖继续培养，用作检测。
4.根据权利要求1或3所述的快速脱除马铃薯病毒的方法，其特征在于所述的植物抗性诱导剂为氨基寡糖素、宁南霉素或3-羟基-3-丙酮基羟吲哚。
5.根据权利要求1所述的快速脱除马铃薯病毒的方法，其特征在于C步骤所述的检测是将第三次剥茎尖后长出的组培苗用电子显微镜负染色、ELISA、qRT-PCR检测，96%以上的苗不能检测到病毒。
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