CN101019533A

CN101019533A - 化学激活剂,其制备方法和其应用

Info

Publication number: CN101019533A
Application number: CN 200710065721
Authority: CN
Inventors: 郝小江; 李艳梅; 陈刚; 罗晓东; 张仲凯; 何红平
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2007-03-19
Filing date: 2007-03-19
Publication date: 2007-08-22
Anticipated expiration: 2027-03-19
Also published as: CN100527957C

Abstract

3－丙酮基－3－羟基羟吲哚(3－acetonyl－3－hydroxyoxindole，AHO)(1)，具有显著的抗烟草花叶病毒(TMV)的作用，研究证明AHO是通过作用于植物水杨酸途径的上游和下游而激活植物的系统获得抗性，是一种新型的化学激活剂，可用于防治由植物病毒或病原物引起的植物病害等。

Description

化学激活剂，其制备方法和其应用

所属领域：本发明涉及药物领域，更具体地，涉及3-丙酮基-3-羟基羟吲哚(3-acetonyl-3-hydroxyoxindole，AHO)原料药及其制剂，其制备方法，以及其在制备防治植物病毒病药剂、抗烟草花叶病毒病制剂、植物中水扬酸合成促进剂、植物系统抗性激活制剂中的应用。

背景技术：化学激活剂的研究被认为是二十一世纪新型农药的重要发展方向之一。近年来，国外发展了INA、BTH等化学激活剂并用于激活经济作物的系统获得抗性，这些化学激活剂为合成的杂环化合物，作用于植物水杨酸途径的上游或者下游。BTH曾经获得注册上市。但由于其毒副作用，使用受到较大限制。目前国外报道的化学激活剂主要用于抗农作物的病原菌，很少报道作为抗植物病毒的作用。

发明内容：本发明的目的在于提供一种现有技术中没有的化学激活剂，该化学激活剂的有效成分为3-丙酮基-3-羟基羟吲哚。进一步的，本发明的目的还在于提供该化学激活剂的制备方法，以及3-丙酮基-3-羟基羟吲哚在制备防治植物病毒病药剂、抗烟草花叶病毒病制剂、植物中水扬酸合成促进剂、植物系统抗性激活制剂中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

化学激活剂，含有3-丙酮基-3-羟基羟吲哚和/或药学上可接受的辅料或载体。

所述的化学激活剂，可进一步含有抗病素蛋白。

所述化学激活剂的制备方法，植物用甲醇-丙酮溶液回流提取，再经柱层析分离，在甲醇-水溶剂中以β-环糊精-苄胺复合物为催化剂，靛红与丙酮缩合后经重结晶制备化合物。

所述化学激活剂的制备方法，植物用10％丙酮-甲醇提取，减压除去溶剂后得浸膏，浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、水溶解，其溶解物经除去溶剂后制备成相应的5部分提取物，乙酸乙酯提取部分通过多种柱层析反复分离即可。

化合物3-丙酮基-3-羟基羟吲哚在制备防治植物病毒病药剂中的应用。

化合物3-丙酮基-3-羟基羟吲哚在制备抗烟草花叶病毒病制剂中的应用。

化合物3-丙酮基-3-羟基羟吲哚在制备植物中水扬酸合成促进剂中的应用。

化合物3-丙酮基-3-羟基羟吲哚在制备植物系统抗性激活制剂中的应用。

本发明化学激活剂剂型，优选为水剂或微乳剂。

本发明涉及化学式(1)所示的化合物3-丙酮基-3-羟基羟吲哚：

本发明基于发现和研究新类型的植物系统获得抗性化学激活剂，通过抗烟草花叶病毒的活性筛选以及活性化合物抗病毒机制的研究，发现了3-丙酮基-3-羟基羟吲哚(3-acetonyl-3-hydroxyoxindole，AHO)(1)具有明显的抑制烟草花叶病毒(TMV)的作用，作用机制研究表明，化合物(1)具有显著的诱导植物系统获得抗性的作用。不同于其它合成的化学激活剂，化合物(1)既可作用于植物水杨酸途径的上游，又可作用于水杨酸途径的下游，且该化合物具有易制备、毒性低的特点，可作为新型的化学激活剂广泛应用于经济作物的抗病毒、抗病原菌，成为新的生物农药。

具体实施方式：

下面用本发明的实施例来进一步阐明本发明的实质性内容，但不以此限定本发明：

实施例1：

3-丙酮基-3-羟基羟吲哚(3-acetonyl-3-hydroxyoxindole，AHO)(1)的制备：

(1)干重植物马蓝(Strobilanthesis cusia)全草17千克用10％丙酮-甲醇提取，减压除去溶剂后，得浸膏，取少部分浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、水溶解，其溶解物经除去溶剂后制备成相应的5部分提取物，用DMSO溶解配成10mg/ml浓度的溶液，用ELISA分别测定各部分的抗TMV活性。乙酸乙酯提取物作为有效组分，通过多种柱层析方法反复分离，得到单一的抗TMV活性化合物3-丙酮基-3-羟基羟吲哚(3-acetonyl-3-hydroxyoxindole，AHO)(1)17毫克。

表1化合物(1)的氢谱和碳谱数据

No.	¹H^ab	¹³C^a	¹H COSY-¹HCOSY	HMBC
No.	¹H^ab	¹³C^a	¹H COSY-¹HCOSY	HMBC	11a233a45678910OH	8.38(br s)////7.68(d，J＝7.6)7.07(t，J＝7.6)7.25(t，J＝7.6)6.97(d，J＝7.6)3.76(d，J＝16.2)3.64(d，J＝16.2)/2.10(s，3H)11.67(br s)	/143.9 s180.3 s74.3 s133.0 s124.6 d121.9 d129.7 d110.3 d51.5 t205.5 s30.9 q/	////7.07(t，J＝7.6)7.68(d，J＝7.6)7.25(d，J＝7.6)7.07(t，J＝7.6)6.97(d，J＝7.6)7.07(t，J＝7.6)3.64(d，J＝16.2)3.76(d，J＝16.2)///	/////C-3，C-5，C-6，C-7，C-1a，C-3a(weak)C-4，C-6，C-7，C-1a，C-3aC-4，C-5，C-7，C-1a(weak)，C-3aC-3(weak)，C-4(weak)，C-5，C-6(weak)，C-1a(weak)，C-3aC-2，C-3，C-3a，C-9/C-8，C-9，C-3(weak)C-3

3-丙酮基-3-羟基羟吲哚(3-acetonyl-3-hydroxyoxindole，AHO)(1)

为无色针晶，mp 115-117℃(氯仿-甲醇)，分子量为205，其分子式C₁₁H₁₁NO₃，旋光度为零，表明其为外消旋体。其化学结构通过X-单晶衍射得以证明。

化合物(1)的主要波谱数据如下：

UV_λ ^ETO20nm(logλ)：286(4.23)；EIMS(m/z，％)∶205(M⁺，57)，187(12)，177(6)，172(14)，162(100)，148(86)，120(84)，92.IRv_max ^KBr cm^-1：3369，3321(OH)，1760(C＝O)。氢谱和碳谱数据见表1。

(2)由靛红为原料制备的方法：将1克β-环糊精溶解于100毫升水中，再加入100毫升甲醇。将1.5当量的苄胺滴加到溶液中，反应液回流2-3小时。减压除去溶剂，残留物用甲醇洗至无苄胺气味，得到的白色粉末的β-环糊精-苄胺复合物作为反应催化剂。

1克市售的靛红(isatin)溶解于水(100毫升)和甲醇(100毫升)中，加入3当量的丙酮，将5％的β-环糊精-苄胺复合物加入反应液后在室温下反应20分钟，待反应液由红色变为浅黄色后终止反应，减压除去溶剂，残留物用甲醇溶解，用甲醇-水重结晶，得到产物的无色针状晶体。收率80％。

实施例2：

在不同施药条件下化合物(1)对TMV复制的抑制率试验：

为了探讨化合物(1)的抗TMV的作用机制，本发明设计了三种试药方法：A)先施药后接病毒，B)先接病毒后施药，C)药与病毒混合接种。药物分5个浓度即100，200，300，400，500 nM。施药方法：先施药后接病毒，或先接病毒后施药都是叶面施药，药物与病毒混合接种是不同浓度的化合物与TMV混合后，在37℃条件下放置15分钟然后接种。检测方法：枯斑检测、电镜检测、酶联免疫检测(ELISA)检测。实验结果表明，先接病毒后施药和药、病毒混合接种这两种试药方式对病毒的抑制率很低，而先施药后接病毒，对病毒的抑制率都在80％以上如表。这就暗示了化合物(1)不是直接作用于病毒而是诱导植物的系统获得抗性(表2)。

表2、化合物(1)对TMV的抑制率

抑制率(％)	化合物的浓度(μg/ml)
抑制率(％)	化合物的浓度(μg/ml)					施药方法	10	20	30	50	70
先接病毒后试药	4.2	5.2	5.7	6.2	7.4	施药方法	10	20	30	50	70
先接病毒后试药	4.2	5.2	5.7	6.2	7.4	药与病毒混合后接种	3.1	4.2	4.7	5.2	6.3
先试药后接病毒	81.3	84.7	87.6	89.6	90.1	药与病毒混合后接种	3.1	4.2	4.7	5.2	6.3

实施例3：

在最佳试药条件下，不同浓度的化合物(1)对TMV增殖的影响：

不同浓度的化合物(1)均匀喷洒在在系统寄主烟草K326叶片上，然后接种TMV，接种三天后用ELISA检测病毒的增殖。结果表明，随着化合物浓度的增加，病毒的含量逐渐减少，当化合物的浓度为500nM(125μg/ml)时，已检测不到病毒(表3)。

表3、酶联免疫法法(ELISA)测定植物病毒

病毒浓度(光密度OD490)	化合物浓度(μg/ml)
病毒浓度(光密度OD490)	化合物浓度(μg/ml)						10	20	30	50	70
CK-	0.012	0.043	0.040	0.033	0.042		10	20	30	50	70
CK-	0.012	0.043	0.040	0.033	0.042	CK+	0.235	0.786	0.726	0.576	0.626
处理	0.542	0.323	0.104	0.054	0.032	CK+	0.235	0.786	0.726	0.576	0.626

CK-为阴性对照，CK+为阳性对照，大于阳性对照为阳性，小于2倍的阴性对照为阴性。

实施例4：

化合物(1)对病毒在烟苗上形成症状的影响：

生长旺盛、健康的烟苗用70μg/ml的化合物(1)处理后，接种TMV(10μg/ml)，接种后第三天观察烟苗的症状，结果表明，用70μg/ml的化合物1处理烟苗后接病毒，烟苗没有表现任何花叶症状，电镜、ELISA都检测不到病毒；但对照则出现严重的花叶。

实施例5：

化合物(1)对TMV增殖的影响：

生长旺盛、健康的烟苗用70μg/ml的化合物(1)处理后，接种TMV(10μg/ml)，接种后不同时间取样，在电镜下观察TMV的增殖，结果表明金刚砂摩擦接种法使大量病毒进入了叶肉细胞，接种后第二天病毒量明显减少，接种后第三天天电镜下已观察不到病毒。

实施例6：

外施化合物(1)的抗病毒作用：

为了研究化合物(1)的抗TMV的作用机制，本发明利用枯斑寄主法进一步验证了化合物(1)的抗TMV活性，结果表明用化合物(1)处理的烟草与未加处理的烟草比较，前者由TMV侵染形成的枯斑的数量和大小明显比不处理的烟草小得多，而且能明显抑制TMV的复制。

实施例7：

在烟草中外施化合物(1)对水杨酸(SA)积累和PR-1表达的影响：

在植物中，诱导抗病毒反应常伴随SA水平和PR-1基因表达的提高。SA水平和PR-1基因表达的提高是形成系统获得抗性的关键。实验结果表明，外施化合物(1)能引起SA水平和PR-1基因表达的明显提高，而且与化合物(1)的浓度成正比，表明化合物能通过SA的积累诱导植物对TMV的防卫反应。

实施例8

在烟草中化合物(1)对烟草中苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响：

在植物中，苯丙氨酸解氨酶是合成SA的关键。实验结果证明，外施化合物(1)能明显提高苯丙氨酸解氨酶的活性，即化合物(1)可能是通过激活苯丙氨酸解氨酶的活性而导致SA水平的提高。

实施例9：

外施化合物(1)对烟草中蛋白质组变化的影响：

为了研究化合物(1)激活植物防卫反应的作用机制，本发明利用双相电泳分析了用化合物(1)处理与不用化合物(1)处理的烟草中蛋白质组的差异。结果表明，用化合物(1)处理的烟草中总蛋白的点有2,735±56被匹配。不用化合物处理的烟草中总蛋白的点有2,520±73被匹配。蛋白质点差异分析结果表明，大约有45个蛋白质点在化合物存在的条件下发生变化，其中有20个蛋白变化与化合物7相关。用MALDI-MS鉴定了8个点(表4)，包括两个核糖体失活蛋白，其它6个蛋白同样能被SA诱导。被鉴定的有SIPK2、SIP19、MAPK1、MAPK2、NTMEK2等(表4)。提示了化合物诱导的植物抗TMV的防卫反应依赖于SA途径。

表4、蛋白点的鉴定

蛋白编号	基因库序列号	分子量(kDa)	PI值	蛋白鉴定
蛋白编号	基因库序列号	分子量(kDa)	PI值	蛋白鉴定	1	AAF67262	35	7.0	SIPK2(42KD)
2	AAQ75123	40	7.5	SIP19	1	AAF67262	35	7.0	SIPK2(42KD)
2	AAQ75123	40	7.5	SIP19	3	Q39021	42	6.5	MAPK1
7	BAA24079	39	7.64	MAPK2	3	Q39021	42	6.5	MAPK1
7	BAA24079	39	7.64	MAPK2	20	AAB58396	45	5.53	SIPK
11	AAH34151	20	9.0	CIP2	20	AAB58396	45	5.53	SIPK
11	AAH34151	20	9.0	CIP2	17	1PUU_A	30	6.5	lectinIII
13	AAL91666	25	7.5	cofilin	17	1PUU_A	30	6.5	lectinIII

实施例10：

化合物(1)的1％微乳剂防治烟草病毒病田间试验结果：

烟草病毒病是我国烟草的主要病害之一，平均发病率在10％左右，严重田块达50％以上，为了探究防治病毒病的有效药剂，本发明依据农业部药检所“农药田间药效试验准则”，进行1％溶液剂防治烟草病毒病田间药效试验，为确定药剂防治烟草病毒病的最佳田间使用剂量，测试药剂对作物及非靶标有益生物的影响和药剂药效、安全合理的实用技术提供数据。

试验作物：烟草；防治对象：烟草病毒病；

供试药剂：

	中文名称/剂型及含量	商品名	生产单位
	中文名称/剂型及含量	商品名	生产单位	试验药剂	1％溶液	AHO	中国科学院昆明植物研究所(本申请人)
对照药剂	10％宁南毒素可溶性粉剂	10％宁南毒素	黑龙江强尔生化技术开发有限公司	试验药剂	1％溶液	AHO	中国科学院昆明植物研究所(本申请人)
	10％宁南毒素可溶性粉剂	10％宁南毒素	黑龙江强尔生化技术开发有限公司	20％病毒A可湿性粉剂	毒克星	黑龙江齐齐哈尔四友化工实业有限公司

施药方法及用水量(升/公顷)：采用喷雾施药的方法，用水量为750升/公顷。

试验结果：

药剂处理	有效成份用量(毫克/千克或克/公顷)	末次药后防效(％)(各重复平均值)	差异显著性
			差异显著性		5％	1％
			1％溶液	150.00g/hm²	5％	1％	77.90	a	A
75.00g/hm²	57.79	b		150.00g/hm²	B		77.90	a	A
75.00g/hm²	57.79	b		10％宁南毒素可溶性粉剂	B	53.50g/hm²	80.41	a	A
20％病毒A可湿性粉剂	600.00g/hm²	79.91	a	10％宁南毒素可溶性粉剂	A	53.50g/hm²	80.41	a	A

适宜施药时期和用量：根据以上试验结果，认为本发明所提供的杀菌剂1％溶液对烟草病毒病具有好的防治效果。第一次施药应在烟草病毒病初发时，病叶率不超过5％，连续用药3次，用药间隔时间7天。在使用制剂量为15000.00g/hm²(有效成分用量150.00g/hm²)时，其防治效果与对照药剂10％宁南毒素可溶性粉剂(制剂量为535.00g/hm²，有效成分用量53.50g/hm²)和20％病毒A可湿性粉剂(制剂量为3000.oog/hm²，有效成分用量600.00g/hm²)相当。因此推荐使用剂量为制剂量15000g/hm²(有效成分用量150g/hm²)以上，该农药通过登记后，可以大面积推广使用于烟草病毒病的防治。

使用方法：喷雾

安全性：试验过程中没有发现对作物及非靶标有益生物产生不良影响，较为安全。

Claims

1、化学激活剂，含有3-丙酮基-3-羟基羟吲哚和/或药学上可接受的辅料或载体。

2、如权利要求1所述的化学激活剂，可进一步含有抗病素蛋白。

3、权利要求1化学激活剂的制备方法，植物用甲醇-丙酮溶液回流提取，再经柱层析分离，在甲醇-水溶剂中以β-环糊精-苄胺复合物为催化剂，靛红与丙酮缩合后经重结晶制备化合物。

4、权利要求1化学激活剂的制备方法，植物用10％丙酮-甲醇提取，减压除去溶剂后得浸膏，浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、水溶解，其溶解物经除去溶剂后制备成相应的5部分提取物，乙酸乙酯提取部分通过多种柱层析反复分离即可。

5、化合物3-丙酮基-3-羟基羟吲哚在制备防治植物病毒病药剂中的应用。

6、化合物3-丙酮基-3-羟基羟吲哚在制备抗烟草花叶病毒病制剂中的应用。

7、化合物3-丙酮基-3-羟基羟吲哚在制备植物中水扬酸合成促进剂中的应用。

8、化合物3-丙酮基-3-羟基羟吲哚在制备植物系统抗性激活制剂中的应用。

9、如权利要求1所述的化学激活剂，优选为水剂或微乳剂。