CN115812744B - 一种油桐提取物及其抑制油茶炭疽病的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种油桐提取物及其抑制油茶炭疽病的应用，油桐提取物采用如下步骤制备：S1、油桐组织样品研磨至粉末状；S2、处理组织样品：取研磨后组织样品的粉末，置于酸性80％乙醇溶液中浸泡，然后超声处理，再过滤后抽滤，最后蒸干获得浸膏；S3、制备油桐提取物溶液：取得到的2g浸膏溶解于5mL体积分数为0.1％的二甲基亚砜溶液再过滤。油桐提取物抑制油茶炭疽病的应用，采用油桐提取物溶液对染病的油茶进行整株喷施至叶片边缘液滴自然流下，每隔10天喷施一次。本发明制备的油桐提取物对果生刺盘孢菌和葡萄座腔菌的生长有抑制效果，油桐叶片提取物的抑菌效果最优，浓度越高，对果生刺盘孢菌的抑制效果越显著。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种油桐提取物及其抑制油茶炭疽病的应用。
背景技术
油桐(Vernicia fordii)是我国重要的生物质能源树种，属于大戟科油桐属，与油茶、乌桕、核桃并列为我国四大木本油料树种。油桐树的主要产品是桐油，是重要的出口物资之一。油桐树的根、叶、花、果均可入药，具有清热解毒、消肿杀虫等功效，对痢疾、肠炎、烫伤等病症均有作用。
油桐的有效成分复杂，作用广泛，但目前主要应用的是油桐籽，而其他产物比花、叶片、果壳利用甚少。由于油桐各组织器官中具体有效成分及差异不明晰，局限了定向副产物的开发。国内对油桐提取物的研究大部分的实验为多种层析方法进行分离纯化并用波谱解析进行结构鉴定，这种方式检测出的成分有限且进展较慢。
植物中含有多种具有抑菌或杀菌功效的活性成分，其抑菌机理非常的繁杂和多样化。在同一种植物中可存在多种抑菌活性成分，发挥不同的抑菌作用。植物抑菌物质复杂多样，不同的提取方式和提取溶剂所得到的抑菌物质种类和含量也不同。
近年来，已有文献表明油桐含有抑菌消炎、治疗烧伤烫伤等药用价值，并通过实验研究发现油桐的花、叶片、果壳、粕提取物都具有明显的抑菌效果，油桐中抑菌活性成分多且优势明显。但由于油桐成分复杂，当前国内外对油桐成分尚未明晰，油桐提取物抑菌消炎等生物活性成分的研究未有系统科学的解释。
综上所述，现在亟需针对油桐的抑菌活性成分进行系统性研究，并研发出一种油桐提取物及其抑制油茶炭疽病的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种油桐提取物及其抑制油茶炭疽病的应用，以开发油桐
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种油桐提取物，采用如下步骤进行制备：
S1、制备组织样品：采集油桐的组织样品于液氮环境中研磨至粉末状；
S2、处理组织样品：取所述步骤S1中研磨后的组织样品的粉末，置于酸性80％乙醇溶液中浸泡，然后超声处理，再过滤后抽滤，最后采用滤液旋转蒸发仪蒸干至提取物无法流动后获得浸膏；
S3、制备油桐提取物溶液：取所述步骤S2中得到的浸膏2g，采用5mL体积分数为0.1％的二甲基亚砜溶液溶解得到油桐提取物溶液。
在上述的方案的基础上，在另一改进的方案中，所述油桐的组织样品先用灭菌水清洗后取无菌滤纸吸干，再进行研磨。
在上述的方案的基础上，在另一改进的方案中，2g浸膏溶解在二甲基亚砜溶液中，在超净工作台上采用0.45微米有机滤膜进行过滤灭菌后得到油桐提取物溶液。
在上述的方案的基础上，在另一改进的方案中，80％乙醇溶液先用HCl调节pH值至3.0。
在上述的方案的基础上，在另一改进的方案中，所述步骤S2中每1g组织样品的粉末配10mL乙醇溶液，浸泡时间为24h；超声处理1次，处理时间1h。
在上述的方案的基础上，在另一改进的方案中，所述组织样品为油桐的花苞或叶片或成熟果壳中的任意一种。
本发明还提供一种油桐提取物抑制油茶炭疽病的应用，采用上述方案中制备的油桐提取物溶液对染病的油茶进行整株喷施至叶片边缘液滴自然流下，每隔10天喷施一次，处理三次以上或直到染病的油茶恢复健康状态。
在上述的方案的基础上，在另一改进的方案中，所述油桐提取物为油桐叶片提取物。
在上述的方案的基础上，在另一改进的方案中，所述油桐叶片提取物溶液的浓度为60mg/mL至80mg/mL。
在上述的方案的基础上，在另一改进的方案中，所述油桐叶片提取物溶液对果生刺盘孢菌的最小抑菌浓度为60mg/mL，所述油桐叶片提取物对果生刺盘孢菌的最低杀菌浓度为80mg/mL。
在上述的方案的基础上，在另一改进的方案中，采用10mg/mL赤霉素溶液与所述油桐叶片提取物先后喷施染病的油茶，每隔10天喷施一次，处理三次以上或直到染病的油茶恢复健康状态。
在上述的方案的基础上，在另一改进的方案中，所述油桐提取物溶液的活性物质含有葫芦巴碱、水苏碱、甜菜碱和O-磷酸胆碱中的一种或多种。
本发明的技术方案所取得的有益技术效果是：
本发明的油桐提取物及其抑制油茶炭疽病的应用，以湖南省湘西自治州永顺县油桐种质资源保存库中的良种‘华桐1号’为研究对象，采用乙醇浸提法制备油桐花、成熟叶片、果壳提取物，选取导致油茶炭疽病的果生刺盘孢菌、与其共生的葡萄座腔菌、新拟盘多毛孢菌、链格孢属以及假拟盘多毛孢菌为检测病菌。
通过比较不同处理下的菌落生长情况，结果表明经过油桐提取物处理的果生刺盘孢菌和葡萄座腔菌的菌落直径明显小于对照组菌落直径，而新拟盘多毛孢菌，链格孢属和假拟盘多毛孢菌的菌落大小与对照组无显著差异，说明油桐提取物对果生刺盘孢菌和葡萄座腔菌的生长有一定的抑制效果。其中，油桐叶片提取物的抑菌效果最优，果生刺盘孢菌在油桐叶片提取物处理下的菌落直径最小。
通过用不同浓度的油桐花、叶片、果壳提取物培养果生刺盘孢菌，利用菌落生长大小和对接种油茶离体叶片进行致病性测定，结果表明，油桐提取物中的叶提取物浓度越高，对果生刺盘孢菌的抑制效果越显著，果生刺盘孢菌在添加120mg/mL的油桐叶片提取物的培养基上停止生长。在离体油茶叶片的致病力测定实验中，发现采用油桐提取物进行处理，均能降低染有炭疽病的发病叶片的病斑面积大小，有效延缓发病进程，其中油桐叶片提取物的效果最明显，这与平板抑菌试验结果相吻合。
本申请所获得的油桐提取物能够有效降低油茶炭疽病病情的发展，其中油桐叶乙醇浸提物的抑菌效果明显，尤其针对果生刺盘孢菌有良好的抑杀作用，油桐叶提取物对果生刺盘孢菌有良好的抑杀作用，其最小抑菌浓度为60mg/mL，最低杀菌浓度为80mg/mL，属于高效植物抑菌剂。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实验例2中的油桐花、叶片、果壳提取物对供试真菌的抑制情况，其中a：对照处理；b：油桐花提取物处理；c：油桐叶片提取物处理；d：油桐壳提取物处理；1：果生刺盘孢菌；2：葡萄座腔菌；3：新拟盘多毛孢菌；4：链格孢菌；5：假拟盘多毛孢菌；
图2为实验例2中的油桐花、叶片、果壳提取物对果生刺盘孢菌菌落生长的影响,菌落生长图中a：对照处理；b：花提取物处理；c：叶片提取物处理；d：果壳提取物处理；1-4为10、30、60、120mg/mL浓度处理；
图3为实验例2中不同浓度的油桐花、叶片、果壳提取物对果生刺盘孢菌菌落生长的影响,统计不同浓度处理下的菌落直径变化，不同小写字母代表差异显著性，(p＜0.05)；
图4为实验例2的油茶离体叶片接种油桐花、叶片、果壳提取物后的病斑生长图，其中a、b、c、d分别为油桐花、叶片、果壳提取物处理和对照处理；
图5为实验例2中油茶离体叶片接种油桐花、叶片、果壳提取物后的病斑面积的统计柱状图，字母代表不同处理下病斑面积差异显著性(p＜0.05)；
图6为实验例3中的果生刺盘孢菌菌丝体生长情况，其中a-g为PDB液体培养基培养，果生刺盘孢菌在加入0、10、20、40、60、80、100mg/mL提取物浓度下的生长情况；h-j为PDA培养基培养，果生刺盘孢菌在60、80、100mg/mL提取物浓度下生长情况；
图7为实验例3中的油桐叶片提取物对果生刺盘孢菌孢子萌发抑制率的影响，其中字母代表不同浓度处理下果生刺盘孢菌孢子萌发率差异显著性(p＜0.05)；
图8为实验例4中果生刺盘孢菌感染的油茶盆苗的照片；
图9为实验例4中对染病油茶苗进行不同喷施处理后的照片，A：10mg赤霉素；B：60mg/mL油桐叶片提取物；C：80mg/mL油桐叶片提取物；D：10mg赤霉素+
60mg/mL油桐叶片提取物；E：10mg赤霉素+80mg/mL油桐叶片提取物。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。此外，本领域技术人员根据本文件的描述，可以对本文件中实施例中以及不同实施例中的特征进行相应组合。
材料来源
油桐(Vernicia fordii(Hemsl.)Airy Shaw)地方审定良种‘华桐1号’的花苞、嫩叶和成熟果壳，采摘于湖南省湘西自治州永顺县油桐种质资源保存库(北纬N29°01′46.02″东经E110°13′33.82″)，统一海拔水平随机选择30株十年生、长势一致的‘华桐1号’植株分为3组，每组10株分别采集四月初的花苞与成熟叶片、十月底的成熟果壳混样，各3个生物学重复。油桐组织样品采集后用灭菌去离子水快速清洗，取无菌滤纸吸干后用锡箔纸包好标记后，液氮速冻，在-80℃超低温冰箱种贮藏。
供试菌株：油茶炭疽病主要致病病菌-果生刺盘孢菌(Colletotrichumfructicola)，果生刺盘孢菌共生的病菌-葡萄座腔菌(Botryosphaeriaceae)，新拟盘多毛孢菌(Neopestalotiopsis clavispora)，假拟盘多毛孢菌(Pseudopestalotiopsis)，链格孢菌(AlternariaNees)。均为中南林业科技大学微生物菌种保存实验中心提供。
供试油茶叶片：采自中南林业科技大学树木楼楼顶油茶苗圃‘华硕’品种当年生嫩叶。
仪器与试剂
分析天平(OHAUS)，超纯水机(SANYO)，研磨仪(上海弗尔德，MM 400)，旋转蒸发仪(上海科兴RE-301)，超声波清洗器(新芝SB-120DTN)，各种规格移液枪(大龙)，70mm规格培养皿，超净无菌工作台(上海沪净SWCJ2FD)、恒温培养箱(上海三发GNP-9050)、高压蒸汽灭菌锅(ZEALWAY)，光照培养箱(GZX-350北京中兴伟业)，抽滤机(天津东康DP-01)，色谱柱(岛津公司Shim-pack XR-ODS III柱)；甲醇、乙腈、乙醇(均为色谱纯购自Merck公司)和BioBioPha/Sigma-Aldrich公司的标准品，液氮(日臻气体有限公司)。生物碱标准品：葫芦巴碱、水苏碱、O-磷酸胆碱均购自上海源叶生物科技有限公司、甜菜碱购自上海麦克林生物科技有限公司。DMSO(二甲基亚砜)购自德国默克公司。其余试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。
马铃薯葡萄糖水PDB液体培养基：用量筒量取100mL蒸馏水倒入250mL试剂瓶中，用分析电子天平称取3.5g马铃薯葡萄糖肉汤培养基加入混匀后，于高温高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min，冷却至室温备用。
马铃薯葡萄糖琼脂PDA固体培养基：用量筒量取100mL蒸馏水倒入250mL试剂瓶中，用分析电子天平称取4.6g马铃薯葡萄糖琼脂培养基加入混匀后，于高温髙压蒸汽灭菌锅中115℃灭菌20min，冷却至室温备用。
磷酸缓冲盐溶液PBS溶液：分析电子天平称取8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.44g无水磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾溶于800mL蒸馏水中，用盐酸调节溶液PH值为7.4后加水定容至1L，于高温髙压蒸汽灭菌锅中115℃灭菌20min，4℃冰箱保存备用。
Tris-HCl缓冲液：分析电子天平称取12.1g三羟甲基氨基甲烷溶于800mL蒸馏水中，用盐酸调节溶液PH值为7.4后加水定容至1L。
以下通过几个实验例具体介绍本申请方案的研究路线及具体研究过程。
实验例1、油桐花、叶片、果壳代谢组成分鉴定与差异分析
为找到油桐提取物抑菌研究的合适方向，申请人先利用超高效液相色谱-质谱联用的广泛靶向代谢组学技术，构建油桐花、叶及果壳广泛靶向代谢组，比较分析油桐花、叶片和果壳的代谢产物及代谢通路(具体实验方法和数据可参见发明人的硕士论文)。采用广泛靶向代谢组学技术，以油桐的花、叶片、果壳为材料，分析获得944种代谢产物，其中酚酸、黄酮、木脂素和香豆素、鞣质、生物碱、萜类等活性成分占总代谢产物的50％以上。研究结果显示，油桐叶中酚酸类物质含量显著高于油桐花。油桐花和叶的显著差异代谢成分富集在苯丙烷类代谢途径，油桐叶中含量显著高于花的酚酸类物质，大多数为苯丙烷类代谢途径的中间产物。代谢组研究结果显示，油桐花、叶片、果壳中次生代谢产物酚类、黄酮和生物碱最多。
实验例2、油桐花、叶片、果壳提取物抑菌检测及主效成分分析
2.1油桐花、叶片、果壳提取物的制备
将油桐花、叶片和果壳样品利用液氮用研磨仪研磨(30Hz，1.5min)至粉末状。分别称取花、叶片和果壳粉末20g，加酸性80％乙醇溶液(先用HCl调节pH值至3.0)200mL，浸泡24h，超声1h后取出，过滤后抽滤。后将滤液通过旋转蒸发仪蒸干至浸膏不在流动，取2g浸膏用5mL体积分数为0.1％的DMSO溶液溶解。再经0.45μm有机滤膜过滤。
2.2油桐花、叶片、果壳提取物抑菌测定
采用生长速率测定法(张佳等，滤纸片法测定黄花蒿提取物对霉菌的抑制活性，湖北农业科学,2009)测定同一浓度油桐花、叶片、果壳提取物对不同菌种的作用。取油桐花、叶片、果壳提取物分别加入快要冷却的PDA培养基中，分别制成提取物终浓度为60mg/mL油桐花、叶片、果壳提取物培养基，充分摇匀，用等量灭菌的无菌水加入作空白对照，倒入无菌培养皿中。待培养基冷却凝固后，用无菌打孔器取直径6mm菌饼(果生刺盘孢菌、葡萄座腔菌、新拟盘多毛孢、假拟盘多毛孢属、链格孢属)，接种于培养基平板中央，放入28℃恒温培养箱中倒置培养。
采用生长速率测定法测定不同浓度油桐花、叶片、果壳提取物对果生刺盘孢菌的作用。用油桐花、叶片、果壳提取物和无菌PDA培养基制成提取物终浓度为10mg/mL、30mg/mL、60mg/mL、120mg/mL培养基，用等量灭菌的无菌水加入作空白对照，倒入无菌培养皿中。待培养基冷却凝固后，用无菌打孔器取直径6mm果生刺盘孢菌菌饼接种于带药培养基平板中央，放入28℃恒温培养箱中倒置培养。5d后，用游标卡尺进行十字交叉测量菌丝生长直径(mm)。取其平均值计算抑制率：
供试菌株的致病力通过油茶离体叶片有伤接种试验进行测定。采集大小一致的新鲜油茶嫩叶，用蒸馏水冲洗干净后放置在铺有层湿滤纸的培养皿中，在叶柄处盖上用蒸馏水湿润的脱脂棉。试验组用针在酒精灯上灼烧灭菌，针尖冷却后在油茶叶两边上刺出小孔，小孔上接种6mm直径的60mg/mL油桐花、叶片、果壳提取物培养下的菌丝块，对照组为普通PDA培养基培养下的6mm直径菌丝块。置于温度为28℃封口膜密封培养皿。28℃下暗培养4d后取出叶片，测量记录病斑面积。取其平均值计算离体叶片病斑的生长抑制率：
2.3结果与分析
2.3.1油桐花、叶片、果壳提取物对供试病菌的抑菌效果
将果生刺盘孢菌、葡萄座腔菌、新拟盘多毛孢、链格孢属、假拟盘多毛孢属菌分别接种至添加了油桐花、叶片和果壳以及对照溶剂的培养基中，28℃培养5d后观察。结果参见附图1所示，油桐花、叶片和果壳提取物对于新拟盘多毛孢菌，链格孢属和假拟盘多毛孢菌的抑菌效果均不明显，其中添加了油桐花和叶提取物的培养基中链格孢属和假拟盘多毛孢菌生长慢于对照组，但是抑制效果不显著。油桐三种部位提取物对于果生刺盘孢菌和葡萄座腔菌抑制效果较明显，其中油桐叶片提取物对果生刺盘孢菌的生长抑制能力最强。通过对菌丝整体形态观察，可以看出油桐叶片提取物、处理的果生刺盘孢菌落(参见附图1c-1)边缘完整圆滑，没有出现明显气生菌丝，表现出较强的抑菌活性。
2.3.2油桐花、叶片、果壳提取物抑制果生刺盘孢菌菌丝生长的情况
参见附图2至附图3可知，含有油桐叶片和果壳提取物的培养基对果生刺孢盘菌的菌丝生长均有一定的抑制效果，含有油桐花提取物的培养基没有明显的抑制效果。随着油桐叶片提取物的浓度升高，果生刺孢盘菌的菌丝生长的抑制效果更明显并在油桐叶片提取物120mg/mL浓度停止生长，菌落呈现无活力的棕色(参见附图2c-1)，菌落直径也显著小于其他组(参见附图3)。
因为果生刺盘孢菌是油茶炭疽病的主要元凶。通过前述实验发现了油桐叶片提取物对果生刺盘孢菌有良好的杀菌效果，因此接下来设计更多的实验来探究其是否可作为生物杀菌剂，起到抑制油茶炭疽病的作用。
2.3.3油桐花、叶片、果壳提取物对油茶果生刺盘孢菌的抑制效果
参见附图4至附图5可知，接种经过处理后病菌的油茶叶片病斑均小于无处理对照组，说明经过油桐花、叶片、果壳提取物处理后的果生刺盘孢菌的毒力降低，抑制了油茶病斑的扩展。其中油桐叶片提取物处理后的病菌感染能力显著低于对照，菌斑面积仅为对照的18.75％(参见下表1的数据)。说明油桐叶片提取物能够有效降低油茶炭疽病病情的发展。
表1在60mg/mL浓度油桐花、叶片、果壳提取物的抑菌效果
注：不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)
实验例3、油桐叶片提取物最佳抑菌浓度的确定
3.1最小抑菌浓度的测定
将不同浓度的油桐叶片提取物混合溶解于培养基中，然后接种果生刺盘孢菌种，通过分析菌落生长情况检测油桐叶片提取物对果生刺盘孢菌丝生长的抑制作用。在PDB培养基加入终浓度分别为0、10、20、40、60、80、100mg/mL的油桐叶片提取物，加入6mm果生刺盘孢菌块后，置于恒温振荡培养箱28℃，160r/min培养48h。最小抑菌浓度(MIC值)的定义为培养2d能完全抑制病原菌生长的最低油桐叶片提取物浓度，将油桐叶片提取物浓度≥最低抑菌浓度的培养液涂布在PDA平板后继续培养2d，能完全抑制病原菌生长的最低油桐叶片提取物浓度即最低杀菌浓度(MFC值)。
3.2孢子萌发抑制率测定
选取培养了7d菌株的PDA平板，在平板中加入适量无菌水，晃动，过滤，即获得孢子悬浮液。将孢子悬浮液配成1×105个孢子/mL的浓度。孢子悬浮液和不同提取物溶液各取500μL混合于1mL离心管，以同体积的无菌水溶液为空白对照。分别取50μL提取物-孢子混合液于凹玻片上，放于带有浅水层的培养皿中，保湿培养于28℃，黑暗条件下的恒温中，每处理3重复。当空白对照孢子萌发率达80％以上时，检查各处理下孢子萌发情况，每处理各重复随机观察3个视野，孢子芽管长度大于孢子的短半径视为萌发，分别记录观察孢子总数及萌发数。取其平均值计算抑制率：
3.3油桐叶片提取物抑制果生刺盘孢菌生长情况的分析
不同浓度油桐叶片提取物对果生刺盘孢菌生长情况的影响参见附图6所示，PDB培养基培养2d后，油桐叶片提取物浓度为60mg/mL时(参见附图6e)可完全抑制果生刺盘孢菌菌丝的生长，表明油桐叶片提取物抑制果生刺盘孢菌丝体生长的MIC值为60mg/mL。将油桐叶片提取物浓度大于MIC的培养液涂布到PDA平板继续培养2d后发现，在80mg/mL浓度(参见附图6i)油桐叶片提取物可以完全抑制果生刺盘孢菌菌丝的生长，表明MFC值为80mg/mL。油桐叶片提取物能有效的抑制果生刺盘孢菌的生长，具有良好的抑菌活性。
表2油桐叶片提取物对果生刺盘孢菌菌丝体生长情况的影响
注：“++”表示该培养基菌落生长旺盛；“+”表示菌落少量生长；“-”表示无菌落生长
从附图7可以看出，不同浓度油桐叶片提取物处理后，果生刺盘孢菌的孢子萌发率均有所下降。在MIC浓度油桐叶片提取物对孢子萌发的抑制率已经达到58％，在MFC浓度时孢子萌发的抑制率已经达到84％，表明油桐叶片提取物可显著抑制果生刺盘孢菌孢子的萌发。
实验例4油桐叶片提取物抑制油茶盆苗炭疽病的应用
4.1果生刺盘孢菌感染油茶盆苗
选取培养了7d果生刺盘孢菌菌株的PDA平板，在每个平板中加入10mL无菌水，晃动平板，吸取液体即得孢子悬浮液。使用孢子悬浮液喷施刺伤过的油茶苗叶片，至叶片边缘液滴自然流下。10天之后油茶病斑明显(参见附图8)。
4.2赤霉素和油桐叶片提取物处理染病油茶盆苗
使用不同浓度的油桐叶片提取物和赤霉素处理染病的油茶苗，共五组，分别为：①10mg/mL赤霉素；②60mg/mL油桐叶片提取物；③80mg/mL油桐叶片提取物；④10mg/mL赤霉素+60mg/mL油桐叶片提取物(先喷赤霉素随即喷油桐叶片提取物)；⑤10mg/mL赤霉素+80mg/mL油桐叶片提取物(先喷赤霉素随即喷油桐叶片提取物)。处理方式为整株喷施至叶片边缘液滴自然流下，共处理五次，每隔10天喷施一次。
4.3油桐叶片提取物对染病油茶盆苗的影响
赤霉素和不同浓度油桐叶片提取物对染病油茶盆苗生长情况的影响如附图9所示。仅用赤霉素处理的油茶盆苗生长势弱，叶片有明显病斑，芽枯黄凋落(参见附图9A)；60mg/mL油桐叶片提取物处理的油茶盆苗叶片边缘存在病斑，生长势中等，部分芽死亡凋落(参见附图9B)；80mg/mL油桐叶片提取物处理的油茶盆苗生长势中等，未见明显病斑(参见附图9C)；赤霉素和60mg/mL油桐叶片提取物共同处理后油茶盆苗生长势较强，但叶片表面有明显病斑(参见附图9D)；赤霉素和80mg/mL油桐叶片提取物处理的油茶盆苗生长旺盛，叶片表面无病斑(参见附图9E)。综上所述60mg/mL油桐叶片提取物能显著抑制油茶炭疽病的发展和蔓延，80mg/mL油桐叶片提取物能完全抑制油茶炭疽病的发生。
本申请以‘华桐1号’油桐花、叶片、果壳为材料，构建广靶代谢组数据库，经过差异分析明确了油桐副产物开发价值及主要研究方向；通过抑菌试验，明确了油桐花、叶片、果壳提取物最佳使用浓度及主效抑菌成分；通过比较分析菌丝生长情况、生理生化指标等，探究了油桐叶片提取物的抑菌机理。主要结果如下：
1.采用高效液相色谱串联质谱法构建油桐花、叶片、果壳代谢组数据库，经过差异代谢物和代谢通路分析，结果表明共有944种代谢产物，其中酚酸、黄酮、木脂素和香豆素、鞣质、生物碱、萜类等活性成分占总代谢产物的50％以上，油桐花、叶片和果壳含有462种共有成分，其中次生代谢产物占比51％，以酚酸、黄酮、生物碱的含量居多。这些次生代谢产物主要富集在嘌呤代谢通路、苯丙烷类代谢合成通路、环戊酮-2-羧酸甲酯代谢通路、氨酰-tRNA生物合成通路，以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路。在油桐花、叶片、果壳中生物碱含量较高主要有葫芦巴碱、水苏碱、甜菜碱和O-磷酸胆碱。
2.采用乙醇浸提法分别获得油桐花、叶片、果壳的提取物，对果生刺盘孢菌、葡萄座腔菌、新拟盘多毛孢、链格孢属、假拟盘多毛孢属菌进行抑菌试验，结果显示各提取物对果生刺盘孢菌和葡萄座腔菌生长具有抑制作用。进一步采用生长速率法和离体叶片防治测定法验证提取物对油茶炭疽病菌果生刺盘孢菌的抑制作用，结果显示油桐叶片、果壳提取物对果生刺孢盘菌的菌丝生长和油茶离体叶片致病力均有明显抑制作用，但油桐花提取物的抑制效果不明显，当添加120mg/mL油桐叶片提取物时，菌丝完全被抑制，无法生长。
3.油桐叶片提取物能够抑制果生刺盘孢菌的生长、孢子的萌发，在添加量为80mg/mL时，对果生刺盘孢菌的抑制率达可达80％以上，其最小抑菌浓度为60mg/mL。
4.综上所述，油桐花、叶片、果壳均富含次生代谢产物，应用空间广阔。其中油桐叶乙醇浸提物的抑菌效果明显，尤其针对果生刺盘孢菌，80mg/mL处理浓度抑菌效果可达80％以上，属于高效植物抑菌剂，其中主要起抑菌作用的生物碱为水苏碱和甜菜碱。油桐叶片提取物可渗入菌丝体细胞内部与DNA结合，影响DNA正常功能，进而导致体内活性氧水平上升、丙二醛含量增加，以致于细胞膜通透性增加、细胞壁完整性破坏以及细胞结构发生改变，最终导致菌体死亡。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种油桐提取物，其特征在于，采用如下步骤进行制备：
S1、制备组织样品：采集油桐的组织样品于液氮环境中研磨至粉末状；所述组织样品为油桐的花苞或叶片或成熟果壳中的任意一种；
S2、处理组织样品：取所述步骤S1中研磨后的组织样品的粉末，置于用HCl调节pH值至3.0的酸性80%乙醇溶液中浸泡，然后超声处理，再过滤后抽滤，最后滤液采用旋转蒸发仪蒸干至提取物无法流动后获得浸膏；每1g组织样品的粉末配10mL乙醇溶液，浸泡时间为24h；超声处理1次，处理时间1h；
S3、制备油桐提取物溶液：取所述步骤S2中得到的浸膏2g，采用5 mL 体积分数为0.1%的二甲基亚砜溶液溶解，在超净工作台上采用0.45微米有机滤膜进行过滤灭菌后得到油桐提取物溶液。
2.一种油桐提取物抑制油茶炭疽病的应用，其特征在于，采用如权利要求1所制备的油桐提取物溶液对致病病原菌为果生刺盘孢菌的染病油茶进行整株喷施至叶片边缘液滴自然流下，每隔10天喷施一次，处理三次以上或直到染病的油茶恢复健康状态。
3.根据权利要求2所述的油桐提取物抑制油茶炭疽病的应用，其特征在于，所述油桐提取物为油桐叶片提取物。
4.根据权利要求3所述的油桐提取物抑制油茶炭疽病的应用，其特征在于，所述油桐叶片提取物溶液的浓度为60mg/mL 至80mg/mL。
5.根据权利要求3-4任一项所述的油桐提取物抑制油茶炭疽病的应用，其特征在于，采用10mg/mL赤霉素溶液与所述油桐叶片提取物溶液先后喷施染病的油茶，每隔10天喷施一次，处理三次以上或直到染病的油茶恢复健康状态。
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