CN113678843B - 短小芽孢杆菌lymc-3的新用途 - Google Patents

Abstract

本申请公开了短小芽孢杆菌LYMC‑3的新用途，即为短小芽孢杆菌LYMC‑3在防治茶树轮斑病中的应用。本申请的松树内生短小芽孢杆菌LYMC‑3，室内盆栽苗防效试验表明，短小芽孢杆菌LYMC‑3菌株发酵液对茶轮斑病菌引起的茶轮斑病有很好的防治效果，室内的预防效果最高达48.59％。通过对LYMC‑3菌株发酵液中的抑菌物质进行研究，发现抑菌物质是一类小分子、极性较高的非蛋白类物质，具有较好的热稳定性，对酸碱较为敏感，强酸强碱环境下，抑菌活性明显降低；对茶轮斑病菌起抑制作用的物质，正丁醇能将其从发酵液中较好的萃取出来。可见，LYMC‑3菌株及其发酵液和发酵液的提取物均具有很好的生防作用。

Description

短小芽孢杆菌LYMC-3的新用途

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及松树内生细菌短小芽孢杆菌LYMC-3的新应用。

背景技术

近年来，由于人们过度追求经济效益，在农林业病害的防治上，大量使用化学农药，虽然能够减轻一些植物病害的发生，但给自身及生态环境带来了许多负面影响，如环境污染加剧，土壤及作物农药残留严重，病菌抗药性的产生加快，严重威胁着人们的生命财产安全。解决这些问题已经十分迫切，生物防治技术因其与环境兼容性好而越来越受到人们的青睐。在研究开发的各种生防微生物中，使用生防细菌来防治植物病害成为国内外学者研究生物防治的热点。

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)是常见的生防微生物，具有生物防治，生物降解以及促进植物生长等多种功能。短小芽孢杆菌可以防治多种植物病害，如对稻瘟病、鹰嘴豆根腐病、黄瓜枯萎病及棉花黄萎病等都具有显著的防治效果。因此在农业生产中，利用生物菌芽孢杆菌的生物菌剂代替化学农药和杀菌剂的作用有非常广阔的前景，既能对植物病虫害的发生起抑制作用，很大程度上又维持了生态系统的稳定，还对人类健康和环境副作用小。

本申请所用菌株是李亮亮博士从洛阳马尾松茎部分离筛选出的具有杀线活性的高效拮抗细菌——LYMC-3菌株，并对该菌株的形态进行了观察，同时研究其一系列生理生化指标，利用Biolog技术和16S rDNA序列技术分析，最终确定菌株LYMC-3为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。短小芽孢杆菌LYMC-3具有内生性，能在马尾松体内良好地定殖和传导，其无菌发酵滤液具有很强的杀线作用，分别以无菌发酵滤液原液及其2倍、4倍、10倍稀释液处理等量松材线虫24h，其线虫死亡率达100％，且死亡的虫体全部消解，因此LYMC-3菌株未来可能会发展成为一种防治松材线虫病的生物制剂，为人们保护森林提供了一条切实可行的道路。但是要想使它大规模投入到人类的社会生产实践当中，对于它的研究应该更加广泛和深入。而对于LYMC-3菌株用来防治其他植物病害的相关研究，未见报道。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供松树内生细菌短小芽孢杆菌LYMC-3的新应用，满足在防治茶树轮斑病中的使用需求。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

短小芽孢杆菌LYMC-3在防治茶树轮斑病中的应用。

短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液在防治茶树轮斑病中的应用。

一种制备所述的短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵滤液的方法，将保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上的短小芽孢杆菌LYMC-3接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL的三角瓶中，于28℃和无光照条件下以200r/min转速摇培；将摇培2d，取得发酵液后，经4℃、10000r/m冷冻离心20min，得到发酵上清液，用0.22μm的细菌过滤器过滤即得无菌滤液。

短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液的非蛋白提取物在防治茶树轮斑病中的应用。

所述的短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液的非蛋白提取物的制备方法：向除菌发酵滤液中注入2-3倍体积的无水乙醇，缓慢搅拌搅拌，使大分子蛋白质、多糖及核酸类物质充分沉淀，于2℃，5000r/min冷冻离心15min，收集非蛋白部分，于40℃，120r/min下旋转蒸发，直至将乙醇完全去除，加去离子水恢复至原体积。

短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液的甲醇粗提物在防治茶树轮斑病中的应用。

所述的短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液的甲醇粗提物的制备方法：取发酵滤液，在50℃下用旋转蒸发仪将其蒸发至干燥，分3次加入适量甲醇缓慢振荡，使干燥物与甲醇充分混匀，离心后获得粗提液；将粗提液在40℃下旋转蒸发至干燥，用去离子水恢复至原体积即得到抑菌粗提物。

短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液的有机溶剂提取物在防治茶树轮斑病中的应用。

所述的短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液的有机溶剂提取物的制备方法，取LYMC-3菌株发酵滤液，加入2-3倍体积的有机溶剂，充分振荡，于2℃冰箱中静置24h，使沉淀析出或分层；使用灭过菌的分液漏斗分离溶剂相和残留沉淀物，然后将萃取液在40℃下旋转蒸发至干燥，沉淀物在通风橱里采用自然挥发的方式清除残留溶剂，用蒸馏水恢复至原体积，获得有机溶剂提取物；其中，有机溶剂选自乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、苯、正丁醇、四氯化碳。

有益效果：与现有技术相比，本发明的松树内生短小芽孢杆菌LYMC-3，室内盆栽苗防效试验表明，短小芽孢杆菌LYMC-3菌株发酵液对茶轮斑病菌引起的茶轮斑病有很好的防治效果，室内的预防效果最高达48.59％。通过对LYMC-3菌株发酵液中的抑菌物质进行研究，发现抑菌物质是一类小分子、极性较高的非蛋白类物质，具有较好的热稳定性，对酸碱较为敏感，强酸强碱环境下，抑菌活性明显降低；对茶轮斑病菌起抑制作用的物质，正丁醇能将其从发酵液中较好的萃取出来。可见，LYMC-3菌株及其发酵液和发酵液的提取物均具有很好生防作用。

附图说明

图1是LYMC-3菌株对病原真菌的拮抗作用结果图；右图为对照(CK)；

图2是LYMC-3菌株对茶轮斑病菌菌丝形态和孢子萌发的抑制作用结果图；A为菌丝形态，B为孢子萌发，CK为对照；

图3是温室内茶轮斑病发病症状图；A为接种病原菌后发病初期症状；B为接种病原菌后发病后期症状；C为对照；

图4是LYMC-3菌株发酵液处理病叶后的病斑直径变化图；

图5是发酵滤液中蛋白与非蛋白提取物对病原菌的抑制作用结果图；

图6是发酵滤液中不同提取组分对病原菌的抑制作用结果图；

图7是温度对LYMC-3菌株抑菌物质抑菌活性的影响结果图；

图8是pH值对LYMC-3菌株抑菌物质抑菌活性的影响结果图；

图9是抑菌物质在不同有机溶剂中的分配结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

本申请所采用的短小芽孢杆菌LYMC-3，为本申请人前期研究成果的中国专利申请CN106754586B公开的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LYMC-3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2016775。

实施例1短小芽孢杆菌LYMC-3菌株对不同病原菌的抑制作用

1短小芽孢杆菌LYMC-3的活化

配制NA培养基，121℃高温高压灭菌20分钟，在无菌操作台中，将灭菌的培养基倒入无菌培养皿中，待培养基凝固且培养皿中无水蒸汽时，采用平板划线法将短小芽孢杆菌LYMC-3菌种在培养基上划线分离，多次活化，直至获取单菌落，于28℃恒温培养箱中培养待用。

2病原菌的活化

配制PDA培养基，灭菌后将其倒入无菌操作台上的平板中，静置备用。采用打孔器将采用打孔器将病原真菌茶轮斑病菌(Pestalotiopsis vesicolor)(南京林业大学林学院森林保护系病理实验室提供)制成直径5mm菌饼，用灭过菌的挑针把菌饼移接到培养基中央，置于25℃恒温培养箱中培养，待菌丝生长状态较好且菌落直径接近培养皿直径时使用。

3平板对峙实验

将用NA斜面活化的短小芽孢杆菌LYMC-3菌株划线接种于PDA平板两侧，再将病原真菌的PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，分别点接于平板中央，以只接病原菌为对照，每个处理3-5个重复。25℃恒温培养箱中培养4d，观察各病原真菌生长状态及抑菌带的有无，并记录其宽度。

试验结果表明，LYMC-3菌株对茶轮斑病菌具有较强的抑菌作用，其抑菌直径为27.69mm。实验中发现，茶轮斑病菌的菌落靠近LYMC-3菌株一侧的菌丝不能正常生长，菌丝在培养基上不能扩展，抑菌带明显，菌落边缘菌丝稀疏(图1)。

4LYMC-3菌株发酵液对病原菌生长的影响

取100mL容量瓶若干，每瓶装液50mL，灭菌后挑取纯化的LYMC-3菌株单菌落进入摇瓶中，在28℃、200r/min的条件下摇培2d，取得发酵液后，经4℃、10000r/m冷冻离心20min，得到发酵上清液，用0.22μm的细菌过滤器过滤即得无菌滤液。按无菌滤液∶PDA等于1∶4的比例混合倒平板，以NB培养基代替无菌发酵液为对照。将活化好的病原真菌点接于平板中央。每个处理设置5个重复，25℃恒温培养箱中培养，4d后测定滤液对病原菌的生长抑制率(抑菌率)。计算公式如下：抑菌率(％)＝(对照平板菌落直径-带毒平板菌落直径)/(对照平板菌落直径-菌块直径)×100％。

试验结果表明，LYMC-3菌株发酵液对茶轮斑病菌的抑制作用，抑制率达到了63.70％(带毒平板菌落直径29.12±0.72mm，对照平板菌落直径84.50±0.58mm)。

5菌株LYMC-3对茶轮斑病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用

对菌丝生长的影响采用平板对峙法测定，即取LYMC-3菌株菌液原液按照滤纸条法测定其对茶轮斑病菌的拮抗活性，方法如下：在无菌滤纸条(70mm×3mm)均匀滴入50μL待测液，按照十字交叉方向小心将滤纸条置于PDA平板中，然后将茶轮斑病菌的菌饼等距离接种在滤纸条的空当中，28℃培养4d，观察LYMC-3菌株对茶轮斑病菌的抑制作用；挑取茶轮斑病菌菌落边缘菌丝分别于空白PDA培养基上培养，同时在光学显微镜(ZEISS，下同)下镜检。

对茶轮斑病菌孢子萌发的抑制试验采用凹玻片法，即吸取20μL(浓度为约1×10⁶个/mL孢子)的孢子悬浮液与等量的LYMC-3菌株发酵滤液5倍稀释液混合，滴加在凹玻片中央，对照为等量NB培养基与孢子悬浮液混合，将各处理的凹玻片置于底部铺层湿滤纸的培养皿内，25℃恒温箱中黑暗培养12h，观察并记录病原菌孢子萌发情况。

试验结果显示，茶轮斑病菌菌丝受LYMC-3抑制后菌丝形态出现异常，抑制作用表现为菌丝变粗、卷曲，且分叉较多(图2A)。挑取畸形的边缘菌丝于PDA培养基上培养，不能正常生长。LYMC-3菌株发酵滤液的5倍稀释液对茶轮斑病菌孢子萌发有显著地抑制作用。经LYMC-3菌株发酵滤液5倍稀释液处理的孢子几乎不萌发，有的孢子发生畸变，外形肿大，无芽管伸出(图2B)。当处理24h后，发酵滤液5倍稀释液处理的孢子萌发率只有10.88％，孢子萌发抑制率高达89.12％，对照孢子萌发率为100％，说明LYMC-3菌株发酵液对茶轮斑病菌菌丝生长和孢子萌发均有显著的抑制作用。

实施例2短小芽孢杆菌LYMC-3菌株室内盆栽苗防效试验

1、供试植物材料：1年实生健壮无病虫害的盆栽茶树苗，品种为西湖龙井。

2、LYMC-3菌株发酵液的制备：将保存在NA斜面上的LYMC-3菌株于NA平板划线活化，挑选单菌落接入装有NB培养液的100mL摇瓶中，恒温摇床培养24小时至对数生长期作为种子液(28℃，200r/min)。以体积分数2％的接种量将种子液接到细菌发酵培养基中，摇床培养48小时(28℃，200r/min)备用。

3、病原菌培养及孢子液的制备：将活化好的茶轮斑病菌打孔后分别接种于PDA平板中央。当茶轮斑病菌长满平板时，将其置于黑光灯下照射，促进产孢。一周后，收集病原菌孢子，用无菌水将其配制成约含1×10⁶个/mL浓度的孢子液，为避免不利因素影响孢子萌发，孢子液需要现配现用。

4、病情的调查

病原菌接种：采用孢子悬浮液针刺法接种茶树苗，即用75％酒精将茶树叶片表面消毒，接着用烧红的接种针轻轻地接触叶片，在叶片上形成点状的烫伤斑，记录初始伤口直径大小。烫伤处理后，将孢子液喷洒到叶面，接种后保湿处理24h。

接种病原菌后调查发病情况，计算感病指数和防治效果。发病分级标准参照表1，病情指数和防治效果计算公式如下：

表1茶树接种发病分级标准

病级	分级标准	代表值
			I	无病斑	0
II	病斑占叶面1/4以下	1
			III	病斑占叶面1/4-2/4	2
IV	病斑占叶面2/4-3/4	3
			V	病斑占叶面3/4以上	4

接种病原菌一周后，茶树开始发病。由图3可知，茶轮斑病发病初期，先在叶尖上生出黄绿色小病斑，然后扩展为不规则褐色大病斑，后期病斑中间变为灰白色，逐渐扩展到整个叶片，最终导致大量叶片脱落，植株死亡。

5、LYMC-3菌株发酵液对茶轮斑病的防治试验

1)LYMC-3菌株发酵液对茶轮斑病的预防处理：用培养48h的LYMC-3菌株发酵液，稀释2倍待用。具体处理方法如下：

处理1：接种前一周每棵茶树苗灌根接种100mL稀释后的LYMC-3菌株发酵液。

处理2：接种前一周每棵茶树苗挑选10片茶叶，用50mL稀释后的LYMC-3发酵液对这些茶叶进行喷雾处理，以喷至叶片开始滴水时为准，待干燥后，重复喷洒3次。

处理3：接种前一周每棵茶树苗灌根接种50mL稀释后的LYMC-3菌株发酵液，并挑选10片茶叶进行喷雾处理，待干燥后，重复喷洒3次。

各处理均以接种无菌水为阴性对照，只接病原菌为阳性对照，各处理及对照各5个重复。

表2结果表明，采取三种处理方式进行茶轮斑病的预防试验，其防治效果均有所差异。其中，接种前喷雾LYMC-3菌株48h发酵液的处理方式，感病指数均比其他两种处理方式低，防效也最好，预防效果达到了48.59％。三种处理方式中，灌根处理的方式对茶轮斑病的防效最差，为23.61％。

表2LYMC-3菌株发酵液室内茶轮斑病的预防效果

5、LYMC-3菌株发酵液对茶轮斑病的治疗处理

接种病原菌一周后，用培养48h的LYMC-3菌株发酵液对茶树苗进行统一处理，具体处理方法如下：

每棵茶树苗进行喷雾处理，待干燥后，重复喷洒3次。以接种无菌水为阴性对照，只接病原菌为阳性对照，处理及对照各5个重复。每3天观察一次叶片病斑扩展情况，记录病斑直径大小。

在茶树上接种茶轮斑病菌一周后，用培养48小时的LYMC-3菌株发酵液对病原菌引起的茶树轮斑病进行治疗试验。从图4可以看出，喷雾处理9天后，LYMC-3菌株发酵液开始抑制茶轮斑病病斑的扩大，18天后抑制效果较为明显，30天后，与对照相比，处理组叶片病斑不再扩大，说明LYMC-3菌株发酵液对茶轮斑病具有一定的治疗效果，可以作为一种生防菌用于防治茶轮斑病。

实施例3

1、抑菌活性检测方法

毒板法：PDA培养基和去菌体的细菌代谢液按照4∶1的比例混合均匀，倒平板制成带毒平板，待平板凝固晾干后，将病原菌菌饼(d＝5mm)接入平板中央，4-5d后测量病原菌菌落直径。

抑菌作用计算公式：抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)×100/(对照菌落直径-d)。

2、LYMC-3菌株发酵滤液中蛋白与非蛋白部分活性的测定

采用无水乙醇沉淀法，将LYMC-3菌株发酵滤液中的蛋白与非蛋白分离开来。即向一定体积的除菌发酵滤液中注入2-3倍体积的无水乙醇(冰浴中进行)，缓慢搅拌搅拌一段时间，使大分子蛋白质、多糖及核酸类物质充分沉淀，于2℃，5000r/min冷冻离心15min，分别收集蛋白部分与非蛋白部分。将蛋白部分用去离子水溶解恢复至原体积，非蛋白部分于40℃，120r/min下旋转蒸发，直至将乙醇完全去除，加去离子水恢复至原体积。用毒板法检测各部分抑菌物质的活性，以发酵滤液为阳性对照，未接入菌体的培养液为阴性对照，设3次重复。

试验结果(图5)表明，对茶轮斑病菌来说，蛋白和非蛋白部分提取物均有一定的抑菌活性，而蛋白质等大分子物质对茶轮斑病菌的抑制作用均小于溶于乙醇的小分子非蛋白提取物。与阳性对照相比，非蛋白提取物抑菌活性略低于其抑菌活性，而蛋白提取物抑菌活性低于其抑菌活性的二分之一。非蛋白提取物对茶轮斑病菌的抑菌率为57.79％；蛋白提取物的抑菌率各为31.76％。因此，LYMC-3菌株发酵滤液抑菌物质中，非蛋白提取物对病原菌起主要抑制作用。

3、抑菌粗提物的制备

量取一定体积的发酵滤液，在50℃下用旋转蒸发仪将其蒸发至干燥(收集蒸出液)，分3次加入适量甲醇缓慢振荡，使干燥物与甲醇充分混匀，离心后获得粗提液。将粗提液在40℃下旋转蒸发至干燥，用去离子水恢复至原体积即得到抑菌粗提物。甲醇提取后的残留物(主要为蛋白质、核酸、多糖等大分子物质)用蒸馏水重新溶解至原体积。利用毒板法对抑菌粗提物、甲醇提取后残留物及蒸出液分别进行抑菌活性测定，以发酵滤液为阳性对照，NB培养基为阴性对照，重复3次实验。

LYMC-3菌株发酵滤液经甲醇粗提，分出三种不同组分：甲醇粗提物、甲醇残留物、蒸出液。三种组分的生物活性测定如图6所示，从结果可以看出，发酵滤液蒸出液和甲醇残留物对两种病原菌的抑制作用较弱，仅甲醇粗提物有明显的抑菌活性，其对茶轮斑病菌的抑菌率分别达到57.0％。发酵滤液中甲醇粗提物对茶轮斑病菌的抑菌作用与阳性对照相比，无显著性差异。

4、不同温度下抑菌粗提物活性测定

将抑菌粗提物分别在-20℃、0℃、20℃、40℃、60℃、80℃、100℃、120℃下静置1h，用0.22μm细菌过滤器除去滤液中的菌体，采用毒板法对不同温度处理的抑菌粗提物进行抑菌活性检测，重复3次试验。

采用不同的温度处理抑菌物质结果显示(图7)，温度的增加并没有带来抑菌物质抑菌活性的上升，抑菌率在小范围内上下浮动，总体表现较为一致，说明LYMC-3菌株发酵液中，对茶轮斑病菌起抑制作用的抑菌物质对温度不敏感，具有较好的热稳定性。

5、不同pH值下抑菌粗提物活性测定

使用pH仪测得抑菌粗提物的pH为8.7，用1mol/L的HCl和NaOH调节抑菌粗提物的pH值使之分别为4.0、5.0、6.0、7.0，8.0、9.0、10.0、11.0，以茶轮斑病菌为目的菌株，对各处理抑菌粗提物进行抑菌活性的测定。以未处理的抑菌物质为阳性对照，NB培养基为阴性对照，重复3次试验。

在不同pH值下，抑菌物质对病原菌的抑制作用表现出不同的变化趋势(图8)，在pH为6-7时，LYMC-3菌株发酵液中的抑菌物质抑菌活性最强，在pH为8-11时，抑菌活性略微下降，在pH4-5时，抑菌活性最低，说明该菌株发酵液中的抑菌物质对酸碱度有较宽的适应范围。

6、抑菌物质在不同极性有机溶剂中的分配

量取等量体积的6份LYMC-3菌株发酵滤液，分别加入2-3倍体积的不同极性有机溶剂(乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、苯、正丁醇、四氯化碳)，充分振荡，于2℃冰箱中静置24h，使沉淀析出或分层。使用灭过菌的分液漏斗分离溶剂相和残留沉淀物(水相)，然后将各处理的萃取液在40℃下旋转蒸发至干燥，沉淀物在通风橱里采用自然挥发的方式清除残留溶剂，用蒸馏水恢复至原体积。对各处理萃取的抑菌物质进行生物活性测定，以发酵滤液为阳性对照，NB培养基为阴性对照，重复3次试验。

采用毒板法试验检测二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、乙酸乙酯、正丁醇和苯萃取的抑菌粗提物活性，结果表明，六种有机溶剂萃取的粗提物抑菌活性存在差异(图9)，活性大小依次为正丁醇＞二氯甲烷＝苯＞四氯化碳＞乙酸乙酯＞三氯甲烷，用正丁醇萃取的抑菌粗提物活性最大，抑菌率为达到了60.78％。综上所述，LYMC-3菌株发酵液中的抑菌活性物质极性较大，后期对抑菌物质的分离纯化可以选用极性较大的有机溶剂。

Claims (8)

1.短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LYMC-3的发酵液在防治茶树轮斑病中的应用，其特征在于：所述短小芽孢杆菌LYMC-3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2016775。

2.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液在防治茶树轮斑病中的应用，其特征在于：所述的短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液的获得方法为：将保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上的短小芽孢杆菌LYMC-3接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL的三角瓶中，于28℃和无光照条件下以200r/min转速摇培；摇培2d，取得发酵液后，经4℃、10000r/min冷冻离心20min，得到发酵上清液，用0.22μm的细菌过滤器过滤即得无菌滤液。

3.短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LYMC-3的发酵液的非蛋白提取物在防治茶树轮斑病中的应用，其特征在于：所述短小芽孢杆菌LYMC-3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2016775。

4.根据权利要求3所述的短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液的非蛋白提取物在防治茶树轮斑病中的应用，其特征在于：所述短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液的非蛋白提取物的获取方法为：向除菌发酵滤液中注入2-3倍体积的无水乙醇，缓慢搅拌，使大分子蛋白质、多糖及核酸类物质充分沉淀，于2℃，5000r/min冷冻离心15min，收集非蛋白部分，于40℃，120r/min下旋转蒸发，直至将乙醇完全去除，加去离子水恢复至原体积。

5.短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LYMC-3的发酵液的甲醇粗提物在防治茶树轮斑病中的应用，其特征在于：所述短小芽孢杆菌LYMC-3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2016775。

6.根据权利要求5所述的短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液的甲醇粗提物在防治茶树轮斑病中的应用，其特征在于：所述的短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液的甲醇粗提物的获取方法为：取发酵滤液，在50℃下用旋转蒸发仪将其蒸发至干燥，分3次加入适量甲醇缓慢振荡，使干燥物与甲醇充分混匀，离心后获得粗提液；将粗提液在40℃下旋转蒸发至干燥，用去离子水恢复至原体积即得到抑菌粗提物。

7.短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LYMC-3的发酵液的有机溶剂提取物在防治茶树茶轮斑病中的应用，其特征在于：所述短小芽孢杆菌LYMC-3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2016775；所述有机溶剂选自乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、苯、正丁醇、四氯化碳中的一种。

8.根据权利要求7所述的短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液的有机溶剂提取物在防治茶树茶轮斑病中的应用，其特征在于：所述的短小芽孢杆菌LYMC-3的发酵液的有机溶剂提取物的获取方法为：取LYMC-3菌株发酵滤液，加入2-3倍体积的有机溶剂，充分振荡，于2℃冰箱中静置24h，使沉淀析出或分层；使用灭过菌的分液漏斗分离溶剂相和残留沉淀物，然后将溶剂相在40℃下旋转蒸发至干燥获得沉淀物，沉淀物在通风橱里采用自然挥发的方式清除残留溶剂，用蒸馏水恢复至原体积，获得有机溶剂提取物。

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