CN113773992B - 高地芽孢杆菌Ba1449及菌剂在防治植物真菌病中的应用 - Google Patents

高地芽孢杆菌Ba1449及菌剂在防治植物真菌病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物防治领域，特别是涉及高地芽孢杆菌Ba1449及菌剂在防治植物真菌病中的应用。本发明提供了高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Ba1449在防治植物真菌病中的应用，所述的高地芽孢杆菌Ba1449保藏编号为CGMCCNo.22899。本发明所述高地芽孢杆菌Ba1449同时对柑橘链格孢褐斑病菌和炭疽病病菌具有高的拮抗能力，而且对环境无污染，具有重要的生防应用前景。

Description

高地芽孢杆菌Ba1449及菌剂在防治植物真菌病中的应用
技术领域
本发明涉及生物防治领域，特别是涉及高地芽孢杆菌Ba1449及菌剂在防治植物真菌病中的应用。
背景技术
柑橘是世界第一大水果，但是一直以来遭受严重的病害威胁。柑橘链格孢褐斑病和炭疽病均为柑橘的重大病害，其病原菌均为真菌，分别为：交链格孢菌橘致病型(Alternaria alternatapathotype tangerine，也称A.alternata pv.citri)和胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。
柑橘链格孢褐斑病(Alternaria brown spot，ABS)是近年来在我国局部地区新发现的病害，主要为害宽皮柑橘及某些杂交种柑橘，引起落叶、落果和枯梢，不仅影响产量，还影响果实的销售，造成严重损失，并且病害呈逐渐扩散和加重的趋势。柑橘炭疽病是柑橘普遍发生的重要病害，可发生于柑橘植株地上的各个部位。该病害具有危害广和危害时间长的特点，采前常引起大量落叶、落果、枝梢枯死和树皮爆裂，严重时可致整株死亡；在果实贮藏运输期间，引起大量腐烂。
目前这两种病害的主要防治方式是药剂防治。药剂防治虽是最有效措施，但化学药剂对引起病原菌的抗药性和对环境的污染是不可忽视的。因此，生物防治越来越受到柑橘生产者和科研工作者的关注。目前被发现对柑橘炭疽病菌具有拮抗作用的细菌有：烟管菌、越南伯克霍尔德氏菌、枯草芽孢杆菌和短短芽孢杆菌等。目前也还未开发出有效抑制柑橘炭疽病菌的生防菌，而拮抗柑橘链格孢褐斑病菌的细菌还未被发现。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了高地芽孢杆菌Ba1449及菌剂在防治植物真菌病中的应用。本发明所述高地芽孢杆菌Ba1449同时对柑橘链格孢褐斑病菌和炭疽病病菌具有高的拮抗能力，而且对环境无污染，具有重要的生防应用前景。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一株防治植物真菌病的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Ba1449，所述的高地芽孢杆菌Ba1449保藏编号为CGMCC No.22899。
本发明提供了高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Ba1449在防治植物真菌病中的应用，所述的高地芽孢杆菌Ba1449保藏编号为CGMCC No.22899。
优选的，所述植物包括柑橘属植物。
优选的，所述柑橘属植物包括柑橘。
优选的，所述真菌病的病原菌包括链格孢褐斑病菌和/或炭疽病病菌。
本发明提供了一种防治植物真菌病的菌剂，所述菌剂的有效成分包括上述高地芽孢杆菌Ba1449。
优选的，所述植物包括柑橘属植物。
优选的，所述柑橘属植物包括柑橘。
优选的，所述真菌病的病原菌包括链格孢褐斑病菌和/或炭疽病病菌。
有益效果：
本发明提供了一株防治植物真菌病的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Ba1449，所述的高地芽孢杆菌Ba1449保藏编号为CGMCC No.22899。采用本发明提供的菌株对植物真菌病具有高的拮抗能力，还能够避免出现环境污染，而且防效极佳。本发明所述高地芽孢杆菌Ba1449菌株能够有效防治植物真菌病。
生物保藏说明
本发明所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Ba1449，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年7月14日，保藏编号为CGMCC No.22899。
附图说明
图1为高地芽孢杆菌Ba1449的系统发生树；
图2为高地芽孢杆菌Ba1449对柑橘链格孢菌的拮抗作用，其中C为对照，T为柑橘链格孢菌；
图3为高地芽孢杆菌Ba1449对炭疽真菌的拮抗作用，其中C为对照，T为炭疽真菌。
具体实施方式
本发明提供了一株防治植物真菌病的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Ba1449，所述的高地芽孢杆菌Ba1449保藏编号为CGMCC No.22899。
在本发明中，所述高地芽孢杆菌Ba1449的形态优选为：在LB培养基，培养24h，菌体直杆状，不透明；菌落白色，圆形边缘不规则。采用本发明提供的菌株对植物真菌病具有高的拮抗能力，还能够避免出现环境污染，而且防效极佳。本发明所述高地芽孢杆菌Ba1449菌株能够有效防治植物真菌病。实施例试验结果证明，本申请提供的高地芽孢杆菌Ba1449菌株同时对柑橘链格孢褐斑病菌和炭疽病病菌具有高的拮抗能力。
本发明提供了高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Ba1449在防治植物真菌病中的应用，所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Ba1449的保藏编号为CGMCCNo.22899。在本发明中，所述植物优选包括柑橘属植物；所述柑橘属植物包括优选柑橘，更优选包括哈姆林甜橙；所述真菌病的病原菌优选包括链格孢褐斑病菌和/或炭疽病病菌。本发明所述高地芽孢杆菌Ba1449菌株能够有效防治植物真菌病。实施例试验结果证明，本申请提供的高地芽孢杆菌Ba1449菌株同时对柑橘链格孢褐斑病菌和炭疽病病菌具有高的拮抗能力。
本发明提供了一种防治植物真菌病的菌剂，所述菌剂的有效成分包括上述高地芽孢杆菌Ba1449，优选包括高地芽孢杆菌Ba1449菌液；所述高地芽孢杆菌Ba1449菌液中高地芽孢杆菌Ba1449的浓度优选为1×108CFU/ml。在本发明中，所述植物优选包括柑橘属植物；所述柑橘属植物包括优选柑橘，更优选包括哈姆林甜橙；所述真菌病的病原菌优选包括链格孢褐斑病菌和/或炭疽病病菌，进一步优选为链格孢褐斑病菌和/或炭疽病病菌，更优选为柑橘链格孢菌(A.alternata pv.citri)和/或胶孢炭疽真菌(Colletotrichumgloeosporioides)。本发明对所述柑橘链格孢和胶孢炭疽真菌的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规购买所得即可；在本发明具体实施例中，所述柑橘链格孢菌优选购自宁波明舟生物科技有限公司，货号优选为BMZ026463；胶孢炭疽真菌优选购自宁波明舟生物科技有限公司，货号优选为BMZ105526。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的高地芽孢杆菌Ba1449及菌剂在防治植物真菌病中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
柑橘根际细菌提取：
供试柑橘材料：柑橘属柑橘根部样品采自江西(N25°40′43″，E115°2′51″)；
采用稀释平板法进行柑橘根部细菌提取：将含有柑橘根部组织的土样样品进行冷冻干燥；采用“抖根法”抖落根部(包括须根)四周松散的土壤，通过无菌手套揉搓和摇动从根部手动除去松散的土壤，直至剩余约为1～2mm附着在根部的土壤；将含有根外厚度约1～2mm的土壤样品置于盛有PBS缓冲液的离心管中，用无菌钳搅动清除根表面所有土壤，涡旋振荡10min后，取出根部；对洗涤根部的缓冲液进行离心(4300rpm，5min)分离，弃去上清液，沉淀部分为根际微生物菌落；在LB培养基平板上利用平板划线法纯化细菌，挑取单菌落于LB液体培养基(实施例3中制备得到的)中，30℃振荡培养18h，取1mL菌液以1mL甘油(25％)，于-80℃保藏，得柑橘根际细菌。
实施例2
1、供试病原菌：柑橘链格孢菌(A.alternata pv.citri)购自宁波明舟生物科技有限公司，货号：BMZ026463；胶孢炭疽真菌(Colletotrichum gloeosporioides)购自宁波明舟生物科技有限公司，货号：BMZ105526。
2、培养基：
LB液体培养基配方(g/L)：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10.0g/L。
LB液体培养基配制方法(1L)：在950ml双蒸水中依次加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠10g。用1mol/L的NaOH溶液调节培养基的pH到7.0，定容至1L。121℃，20min高压灭菌，4℃储存。
LB培养基平板制作方法：在1L LB液体培养基中加入15g琼脂粉。121℃，高压灭菌20min，待冷却至50～60℃时，倒制平板。倒制时培养基温度不宜过高，否则冷却后平板会产生大量冷凝水。
PDA固体培养基配方(g/L)：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15～20g/L。
PDA固体培养基配制方法：称取200g洗净去皮土豆，切成小块，加水煮烂(煮沸20～30min，能被玻璃棒戳破即可)，用8层纱布过滤，滤液继续加热。加入15～20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，115℃高压灭菌20min。
PDA培养基平板制作方法：将灭菌完成了PDA固体培养基冷却至50～60℃时，倒制平板。
PBS缓冲液配制方法：称取8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液将pH调至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。
3、拮抗菌的筛选
(1)柑橘病原真菌(柑橘链格孢菌和胶孢炭疽真菌)活化：将柑橘链格孢菌和胶孢炭疽真菌从保藏状态恢复到室温状态，得到活化的柑橘链格孢菌和炭胶孢疽真菌；
(2)柑橘根际细菌的纯化：采用平板划线法对实施例1得到的柑橘根际细菌进行纯化；具体操作是：在无菌操作台中进行，用接种环挑取悬液1环，先在LB平板的一边作第1次平行划线3～4条，转动平板约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线作第2次划线，再利用同样的方法进行第3次和第4次划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于30℃培养箱中培养18h，得纯化后的细菌菌株；
(3)纯化后的细菌菌株利用平板对峙培养法，以柑橘链格孢菌和炭疽真菌作为靶菌从中筛选拮抗菌：
初筛：在无菌条件下，将活化的柑橘链格孢菌和胶孢炭疽真菌菌饼(直径5mm)分别置于PDA培养基平板中央，平板置于28℃培养24h，在平板背面四周距菌落中心30mm处画点。将纯化后的细菌菌株接种于LB液体培养基，30℃振荡培养18h，取菌液20uL滴在PDA培养基平板背面画点处，平板置于28℃培养4～7d，观察拮抗结果，当出现有明显抑菌带时，记录细菌名称及相关信息，以备复筛。
复筛：将活化的柑橘链格孢菌和胶孢炭疽真菌菌饼分别置于PDA培养基平板中央，并在距菌饼中心左右30mm处各打1孔，平板置于28℃培养24h。使用LB液体培养基接种初筛后拮抗作用明显的细菌，30℃振荡培养16～24h，紫外分光(OD600)测菌液吸光值为0.8～1.0。取20μL菌液滴加在PDA培养基平板左右孔中，于28℃培养4～7d，观察拮抗抑菌透明带，并测量抑菌带，从中得到抑菌带最宽的菌株，记为菌株A。
利用平板对峙法(同上面的复筛过程)检测复筛过程中抑制效果最好的菌株A对柑橘链格孢或胶孢炭疽病菌的拮抗作用，将菌株A接种到柑橘链格孢菌记为柑橘链格孢菌组，将菌株A接种到胶孢炭疽病菌记为胶孢炭疽病菌组，以未接种菌株A的处理作为对照组，记为柑橘链格孢菌对照组和胶孢炭疽真菌对照组。培养6d后进行观察，调查结果见表1、图2和图3。
表1拮抗带宽度
病原真菌 抑菌带宽度(cm)
柑橘链格孢菌组 0.71+0.05
柑橘链格孢菌对照组 0
胶孢炭疽真菌组 0.65+0.09
胶孢炭疽真菌对照组 0
结果如表1、图2和图3所示，复筛过程中抑菌(活化的柑橘链格孢菌或胶孢炭疽真菌)效果最好的菌株A对柑橘链格孢菌和胶孢炭疽病菌具有明显的拮抗作用。
实施例3
对复筛过程中抑菌(活化的柑橘链格孢菌和胶孢炭疽真菌)效果最好的菌株A的鉴定：通过PacBio RS II和Illumina HiSeq 4000平台分别对高地芽孢杆菌Ba1449进行三代和二代全基因组测序。三代数据用于全基因组的组装，二代数据对组装基因组的纠错后获得高地芽孢杆菌Ba1449全基因组序列，此菌株的全基因组序列已提交至NCBI数据库(National Center forBiotechnology Information(nih.gov))，其BioProject序列号为PRJNA679141。利用GTDB-T k软件，基于全基因组相似性估算对菌株进行鉴定，结果如图1所示，结果发现具有最大平均核酸确定度ANI(Average Nucleotide Identity)的细菌为高地芽孢杆菌，其ANI值为98.36％。将高地芽孢杆菌Ba1449和其他近缘物种(枯草芽孢杆菌、苏云金杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、高地芽孢杆菌)建立系统发生树，发现高地芽孢杆菌Ba1449落在高地芽孢杆菌支系中。综合以上两部分结果确定高地芽孢杆菌Ba1449为高地芽孢杆菌，被命名为高地芽孢杆菌Ba1449。
实施例3
室内盆栽试验：
试验菌株：高地芽孢杆菌Ba1449菌液、柑橘链格孢菌孢子悬浮液、胶孢炭疽病菌孢子悬浮液；
试验植物：哈姆林甜橙；
孢子悬浮液制备：柑橘链格孢菌接种PAD培养基平板后，28℃培养7～8天。在长势良好的平板中加入5ml无菌水，利用无菌接种针刮下孢子，利用两层纱布过滤该孢子悬浮液，并用5ml无菌水分3次冲洗滤渣，收集滤液获得柑橘链格孢菌孢子悬浮液。利用血球计数板计算孢子悬浮液浓度，同时将浓度稀释到1×105CFU/ml。
利用同样的方法制得柑橘胶孢炭疽病菌孢子悬浮液，浓度为1×105CFU/ml。
高地芽孢杆菌Ba1449菌液：高地芽孢杆菌Ba1449接种至LB液体培养基中，28℃培养18小时。利用PBS缓冲溶液稀释菌液浓度至1×108CFU/ml。
试验流程：于2021年8月2日种植哈姆林甜橙，当哈姆林甜橙长到5片叶片时，利用小喷瓶将1ml 1×105CFU/ml的柑橘链格孢菌悬浮液均匀于喷洒于叶片的正反面，保湿24小时，待哈姆林甜橙叶片表面出现圆形褐色小点，周围有黄色晕环时，在叶片正反面均匀喷施1ml 1×108CFU/ml的高地芽孢杆菌Ba1449的菌液，记为1组；
与1组处理方法相同，区别仅在于，采用1ml 1×105CFU/ml的胶孢炭疽病菌的孢子悬浮液，记为2组；
与1组处理方法相同，区别仅在于，仅采用1ml 1×105CFU/ml的柑橘链格孢菌的孢子悬浮液，记为3组；
与1组处理方法相同，区别仅在于，仅采用1ml 1×105CFU/ml的胶孢炭疽病菌的孢子悬浮液，记为4组；
以喷施等量的无菌水作为对照，记为5组；
每个处理3盆，重复3次，取样的时间为2021年9月9日。采用计算发病叶片的方法对高地芽孢杆菌Ba1449的抗病效果进行检测，
发病率＝发病叶片数/总叶片数×100％
检测结果见表2。
表2实验结果
处理 发病叶片 总叶片 发病率
1组 17 45 37.8％
2组 21 45 46.7％
3组 45 45 100％
3组 45 45 100％
5组 0 45 0
由表2记载的可知，高地芽孢杆菌Ba1449在温室条件下能够很好的防治柑橘柑橘格孢褐斑病和炭疽病。
综上实施例记载的可知，采用本发明提供的菌株对植物真菌病具有高的拮抗能力，还能够避免出现环境污染，而且防效极佳。实施例试验结果证明，本申请筛选得到的高地芽孢杆菌Ba1449菌株同时对柑橘链格孢菌和胶孢炭疽病病菌具有高的拮抗能力，能够有效抑制柑橘链格孢菌和胶孢炭疽病病菌，从而预防或防治柑橘褐斑病和炭疽病。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一株防治植物真菌病的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Ba1449，其特征在于，所述的高地芽孢杆菌Ba1449保藏编号为CGMCC No.22899。
2.高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Ba1449在防治植物真菌病中的应用，其特征在于，所述的高地芽孢杆菌Ba1449保藏编号为CGMCC No.22899；所述植物真菌病的病原菌为柑橘链格孢菌(A.alternata pv.citri)和胶孢炭疽真菌(Colletotrichumgloeosporioides)。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述植物包括柑橘属植物。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述柑橘属植物包括柑橘。
5.一种防治植物真菌病的菌剂，其特征在于，所述菌剂的有效成分包括权利要求1所述高地芽孢杆菌Ba1449；所述植物真菌病的病原菌为柑橘链格孢菌(A.alternatapv.citri)和胶孢炭疽真菌(Colletotrichum gloeosporioides)。
6.根据权利要求5所述菌剂，其特征在于，所述植物包括柑橘属植物。
7.根据权利要求6所述菌剂，其特征在于，所述柑橘属植物包括柑橘。
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