CN117158440A - 姜黄碳纳米点在防治小麦赤霉病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了姜黄碳纳米点在防治小麦赤霉病中的应用。本发明姜黄碳纳米点在防治小麦赤霉病中的应用在自然光照射条件下进行；所述姜黄碳纳米点由包括如下步骤的方法制备得到：1)取姜黄粉末，烘干备用；2)使所述姜黄粉末和溶剂组成的体系进行水热反应，反应完毕后离心，收集上清液；3)将所述上清液进行纯化后干燥，得到所述姜黄碳纳米点。本发明通过水热法以自然存在的草本植物姜黄为前驱体，与碳纳米点技术相结合制备出姜黄CDs，草本植物姜黄来源广泛，取材便利，制备的姜黄CDs对禾谷镰刀菌孢子具有优良的抑菌能力，对小麦赤霉病有较好的防治效果，对小麦幼苗生长无不良影响，有望作为一类理想的农用绿色杀菌剂，具有极大的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于农药技术领域，尤其涉及碳纳米点在防治小麦赤霉病中的应用。
背景技术
小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的真菌病害，对全球的粮食生产安全和人畜的生命健康造成严重威胁。常用的赤霉病防治方法为喷洒农药，毒性大。为了避免农药残留，保障粮食生产安全，弥补农业防治见效慢、抗病品种培育难、化学试剂长期使用污染环境并增加病原菌耐药性等传统小麦赤霉病防治技术的不足，亟待开发高效、环境友好的新型绿色农药来代替现有商品化品种。
碳纳米点(carbon dots,CDs)是一种新发现的、尺寸通常小于10nm的球形碳颗粒，具有合成原料广泛、合成方法多样、荧光强度高、荧光范围广、生物毒性低、光漂白耐受性好等特点，已经被普遍应用于生物荧光成像、化学检测、生物检测、光催化、药物负载等领域。使用不同的原料或是利用不同的制备方法所得到的碳纳米点具有不同的结构组成和性质，其用途也大不相同。碳纳米点的制备根据原料的不同被分为“自上而下法”和“自下而上法”两大类，其中，“自下而上法”是利用小尺寸有机分子或低聚物为原料(柠檬酸、苹果酸、葡萄糖等)通过化学氧化、燃烧、模板、水热或微波等方法制备碳纳米点。近年来，在水热合成法中出现了一种“绿色合成法”，该方法选择香蕉、楼汁等天然的生物资源作为原料制备碳点。另外甜辣椒、牛奶、牛血清蛋白等天然原料也被用于水热法制备碳点的研究中。与传统农业病害防控措施相比，CDs可以快速高效杀灭多种细菌、真菌，作用靶点多，病原菌很难产生抗性。碳纳米点作为一种新兴的杀菌材料，大多数研究人员探究CDs对细菌的杀菌效应及机制，但是由于真菌(尤其是多细胞真菌)结构更为复杂，当前对杀灭真菌的报道相对较少，且目前未见有CDs在赤霉病防治方面的应用。
发明内容
本发明的目的是提供姜黄碳纳米点在防治小麦赤霉病中的应用，该姜黄碳纳米点(CDs)以自然存在的草本植物姜黄为前驱体，采用水热法制备得到，对禾谷镰刀菌孢子具有优良的抑菌能力，对小麦赤霉病有较好的防治效果，对小麦幼苗的生长无不良影响。本发明首次将CDs与农业生产相结合，不仅符合“绿色农业”的发展要求，而且进一步开拓了CDs在农业领域的应用，尤其是CDs在防治小麦病害方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供姜黄碳纳米点在下述任一项或制备具有下述任一项功能的产品中的应用；
A1、防治由禾谷镰刀菌引起的植物病害；
A2、防治小麦赤霉病；
A3、杀灭禾谷镰刀菌孢子；
A4、抑制禾谷镰刀菌；
A5、抑制禾谷镰刀菌孢子的生长；
A6、抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发；
所述应用在自然光照射条件下进行；
所述姜黄碳纳米点由包括如下步骤的方法制备得到：
1)取姜黄粉末，烘干备用；
2)使所述姜黄粉末和溶剂组成的反应体系进行水热反应，反应完毕后离心，收集上清液；
3)将所述上清液进行纯化后干燥，得到所述姜黄碳纳米点。
上述的应用中，所述溶剂可为无水乙醇或N-N二甲基甲酰胺；
所述水热反应的温度可为120～180℃，优选为140～160℃，如160℃；
所述水热反应的时间可为2～6h，具体可为5h。
上述的应用中，所述姜黄粉末和所述溶剂的比例为1g：(4～20)mL，优选为1g：20mL。
上述的应用中，所述离心的转速为5000～10000转/分钟，时间为5～10分钟，如在10000rpm/min下离心10分钟；
所述纯化采用硅胶柱层析。
上述的应用中，所述姜黄碳纳米点以其水溶液的形式存在，浓度为0～0.5g/L但不为0，优选0.01～0.5g/L，更优选0.05～0.5g/L，进一步优选0.1～0.5g/L，最优选0.5g/L。
第二方面，本发明提供包含姜黄碳纳米点的杀菌组合物在下述任一项或制备具有下述任一项功能的产品中的应用；
A1、防治由禾谷镰刀菌引起的植物病害；
A2、防治小麦赤霉病；
A3、杀灭禾谷镰刀菌孢子；
A4、抑制禾谷镰刀菌；
A5、抑制禾谷镰刀菌孢子的生长；
A6、抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发；
所述应用在自然光照射条件下进行；
所述姜黄碳纳米点由包括如下步骤的方法制备得到：
1)取姜黄粉末，烘干备用；
2)使所述姜黄粉末和溶剂组成的反应体系进行水热反应，反应完毕后离心，收集上清液；
3)将所述上清液进行纯化后干燥，得到所述姜黄碳纳米点。
上述的应用中，所述溶剂为无水乙醇或N-N二甲基甲酰胺；
所述水热反应的温度可为120～180℃，优选为140～160℃，如160℃；
所述水热反应的时间可为2～6h，具体可为5h。
上述的应用中，所述姜黄粉末和所述溶剂的比例可为1g：(4～20)mL，具体可为1g：20mL；
所述离心的转速为5000～10000转/分钟，时间为5～10分钟，如在10000rpm/min下离心10分钟；
所述纯化采用硅胶柱层析。
上述的应用中，所述杀菌组合物还包含辅料和/或与所述姜黄碳纳米点可复配的杀菌组分。
以上任一项所述自然光照射具体可为晴天自然光照射。
以上任一所述禾谷镰刀菌具体可为禾谷镰刀菌标准野生型菌株PH-1。
以上任一项所述产品可为农用杀菌剂或农用复方杀菌剂。所述农用杀菌剂或农用复发杀菌剂的剂型不限，如悬浮剂、可湿性粉剂、乳油、水分散粒剂、微乳剂、水乳剂、悬乳剂、微囊悬浮剂中的任一种。
本发明具有如下有益效果：
本发明的作用机理如下：姜黄CDs可以利用光催化，将大自然的光能资源转换成ROS，通过多种ROS及其中间的协同效应，姜黄CDs一方面能够快速高效杀灭禾谷镰刀菌，另一方面，姜黄CDs产生的多种ROS在一定程度上可以促进小麦植株的生长，提高小麦产量。
本发明通过水热法以自然存在的草本植物姜黄为前驱体，与碳纳米点技术相结合，通过一系列物理化学方法制备出姜黄CDs，该姜黄CDs具有优异的光电子转换性能、良好的化学稳定性和生物相容性、细胞毒性小、经济且易于制备等特点，且草本植物姜黄来源广泛，取材便利，制备的姜黄CDs对禾谷镰刀菌孢子具有优良的抑菌能力，在田间对小麦赤霉病有较好的防治效果，且对小麦幼苗的生长无不良影响，有望作为一类理想的农用绿色杀菌剂，具有极大的市场应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备得到的姜黄CD的材料性质表征：(A)透射电子显微镜图；(B)傅里叶变换红外光谱图；(C-F)X射线光电子能谱图总图及谱峰分别对应的C，N，O的分图。
图2为实施例1制备得到的姜黄CDs的粒径统计图。
图3为实施例2中姜黄CDs在不同光照条件下处理对禾谷镰刀菌孢子存活数的影响：(A)暗处理；(B)晴天自然光照射。
图4为在不同光照条件下(暗处理和晴天自然光照射)处理30分钟后，实施例2中姜黄CDs及其所对应同等浓度的姜黄素对禾谷镰刀菌孢子存活数的影响：(A)姜黄CDs处理组；(B)同等浓度姜黄素处理组。
图5为实施例3中姜黄CDs对禾谷镰刀菌生长的影响：(A)菌丝体生长照片；(B)孢子萌发的显微图像；(C)菌丝生长抑制率；(D)孢子萌发率。
图6为实施例4中不同浓度姜黄CDs处理后的染病小麦穗部照片。
图7为实施例5中姜黄CDs对小麦幼苗生长的影响：(A)小麦生长14天的照片；(B)株高；(C)鲜重；(D)干重；(E)叶绿素含量；(F)SOD活性；(G)POD活性变化。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中使用的中草药姜黄采购于药材市场，选择成色较好的姜黄块体。
下述实施例中所用的禾谷镰刀菌为标准野生型菌株PH-1(Li et al.,2017)由本实验室副研究员赠予，记载于“Li,B.,Liu,L.,Li,Y.,et al.(2017).The fgvps39-fgvam7-fgsso1 complex mediates vesicle trafficking and is important for thedevelopment and virulence of fusarium graminearum.Molecular plant-microbeinteractions:MPMI,30(5),MPMI11160242R.”中，公众可从郑州大学获得。
实施例1、制备姜黄CDs
取姜黄块体研磨成粉末，将姜黄粉末在干燥箱烘干24h后，称取1g姜黄粉末，置于反应釜中后加入20mL无水乙醇，充分搅拌混匀之后将上述反应体系置于加热箱中，160℃加热5h。随后等待反应温度降低至室温，将反应好的悬浊液转移到50mL试管当中，将试管放入离心机中以10000rpm/min的速度离心10分钟，留取上清液，以去除大颗粒杂质。之后将所得的粗制姜黄碳点溶液采用硅胶柱层析的方式将样品纯化，得到纯净的碳点溶液，放入烘箱中进行干燥，待溶剂完全挥发后置于25℃储藏箱备用。表征结果见图1，粒径统计图见图2，本实施例成功制备出了姜黄CDs，平均粒径为2.71nm。
实施例2、评估姜黄CDs对禾谷镰刀菌孢子的杀灭效果
实验方法：使用平板计数法评估姜黄CDs水溶液对禾谷镰刀菌孢子的杀灭效果。将-80℃冻存的禾谷镰刀菌在新鲜的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)上活化，28℃黑暗条件下培养3天，置于4℃的冰箱保存备用。
每次实验前，从菌落边缘切部分菌块转接至100ml羧甲基纤维素钠(CMC)液体培养基中，在28℃180rpm条件下培养5天。用无菌滤布将培养物过滤后，6000rpm离心10min，将孢子用无菌水洗涤两次，重悬后备用。
对于姜黄CDs杀菌测试，将姜黄CDs溶液用无菌水稀释至浓度为0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5g/L，其中将0作为对照组。分别取1.5mL姜黄CDs溶液至1.5mL离心管中，加入孢子悬液，通过血球计数板计数，使孢子终浓度为2.7×105CFU mL-1。之后，将其置于暗处理、晴天自然光强下，处理4个小时。分别在0、15、30、45、60、90、180、240分钟后取样；对于姜黄CDs和其同等浓度姜黄素杀菌测试，分别将姜黄CDs溶液用无菌水稀释至浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5g/L，记为Control、CDs-0.05、CDs-0.1、CDs-0.2、CDs-0.3和CDs-0.5，同时将同等浓度姜黄素溶液分别记为Control、Cur-0.05、Cur-0.1、Cur-0.2、Cur-0.3和Cur-0.5，将两组姜黄CDs和姜黄素溶液分别置于1.5mL离心管中，孢子浓度同上，在暗环境以及加光照环境中处理30分钟后取样。
取100μL处理好的孢子悬液用无菌水进行浓度梯度稀释，将100μL稀释好的孢子悬液均匀涂抹在PDA固体培养皿中。PDA平板在28℃黑暗下培养36h后进行平板菌落计数。每个稀释梯度涂三个板，实验重复三次。
实验结果：姜黄CDs对禾谷镰刀菌孢子灭活率如图3所示。在暗环境下，姜黄CDs对禾谷镰刀菌孢子不具备杀伤能力，见图3(A)，但是如图3(B)所示，在外界晴天的自然光照射下，0.3g/L的姜黄CDs仅照射30分钟即可将1mL孢子浓度为2.7×105CFU/mL的禾谷镰刀菌孢子完全灭活，0.1g/L的姜黄CDs在光照下照射30分钟即可降低3.1个log值，当处理时间延长至60min后，0.1g/L也可完全杀死禾谷镰刀菌孢子。此研究结果表明，姜黄CDs具有优良的光电子转化性能，并能在自然光的照射下对禾谷镰刀菌表现出优异抗菌性能。
为了进一步对比姜黄CDs与姜黄素对禾谷镰刀菌孢子存活的影响，采用姜黄CDs及其同等浓度的姜黄素在暗环境和加光照条件下对禾谷镰刀菌孢子处理30分钟，试验结果如图4所示。与对照组(5.41Log)相比，在暗环境下，姜黄CDs对禾谷镰刀菌孢子没有灭活效果，而姜黄素Cur-0.5处理30分钟后，可以降低0.64个Log值，这可能与姜黄素本身具备毒性有关。但是在光照条件下，姜黄CDs-0.05、0.1、0.2可将禾谷镰刀菌孢子Log值分别降低至2.97、2.20和2.10，当姜黄CDs的浓度增加至0.3g/L之后，即可将对照组的禾谷镰刀菌孢子全部灭活。同时，与之相对应的姜黄素处理组，姜黄素Cur-0.05、0.1、0.2处理30分钟后，禾谷镰刀菌孢子Log值仅仅分别降低5.29、5.13和3.95，当姜黄素处理组的浓度增加至0.3和0.5时，仅可将禾谷镰刀菌孢子Log值降低至3.70和3.53。此研究结果表明，虽然姜黄素对禾谷镰刀菌孢子也有灭活作用，但是其灭活效应远低于姜黄CDs，这可能与姜黄CDs具有良好的光电子转化性能以及具有更优的溶解性相关。总的来说，姜黄CDs在有光照的条件下，可以显著灭活禾谷镰刀菌孢子，从而为田间赤霉病的防治提供一定的理论基础。
实施例3、评估姜黄CDs对禾谷镰刀菌菌丝生长的抑制效果
实验方法：为了评估姜黄CDs对禾谷镰刀菌菌丝生长的抑制效果，将不同浓度的姜黄CDs在自然光下对孢子处理30min后，首先将处理后5μL孢子悬液滴加至PDA固体培养皿中央，将PDA平板置于28℃下培养72h，之后用十字交叉法测量真菌菌落直径。菌丝生长抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(1-dt/dc)×100，其中dc和dt分别表示未处理组和处理组的菌落直径。其次，将处理后的孢子悬液6000rpm离心10min后，将孢子沉淀重新转接至10ml马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中，在28℃180rpm条件下培养4h后，取10μL孢子悬液在显微镜下进行观察并统计孢子萌发率。
实验结果：如图5所示，姜黄CDs处理30min后，可以有效抑制禾谷镰刀菌孢子的菌丝体生长和分生孢子的萌发。具体来讲，随着姜黄CDs浓度的增加，CDs可以肉眼可见的抑制菌丝体的生长，CDs-0.5作为最大处理剂量，可以完全抑制菌丝体的正常生长。与此同时，禾谷镰刀菌经过CDs处理后，其孢子萌发率由对照组的96.33％显著降低至CDs-0.5处理组的1.67％，进一步来讲，CDs-0.1即可将孢子萌发率显著降低至30.67％，当浓度增加至0.2g/L时，孢子萌发率会降低至10％以下。
实施例4、评估姜黄CDs对小麦赤霉病的田间防治效果
实验方法：为了评估姜黄CDs对小麦赤霉病的田间防治效果，在河南新乡进行田间试验。将培养5天的CMC培养基中收集禾谷镰刀菌孢子，浓度调整为106CFU/mL，在小麦扬花期，将10μL的孢子悬液接种于扬花小麦穗中部小花外稃和内稃之间的花腔内，接种后第0、3、5、7天，对每个处理组的每穗小麦各喷洒2ml的姜黄CDs溶液，浓度分别为0、0.1、0.3、0.5g/L，其中将0设为对照组，在接种孢子后第14天进行病情调查，每个小区随机取样麦穗并拍照。
实验结果：如图6所示，姜黄CDs处理以浓度依赖性方式有效的控制田间小麦赤霉病的发生，随着姜黄CDs浓度的增高，小麦穗部发病部位逐渐减小。上述结果表明，姜黄CDs在田间对小麦赤霉病有较好的防治效果，其防治效果与姜黄CDs对禾谷镰刀菌的抗真菌能力有关。
实施例5、评估姜黄CDs对小麦植株生长的安全性实验方法
为了评估姜黄CDs对小麦生长是否有负面影响，在温室对小麦幼苗进行安全性试验。实验分为4组，在温室对小麦进行栽培，培养第7、10、13天后，对每个处理组的每株小麦植株上各喷洒2ml的姜黄CDs溶液，浓度分别为0、0.1、0.3、0.5g/L，其中将0设为对照组。培养第14天后，测量小麦植株的株高、鲜重、干重、叶绿素含量以及对小麦植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)进行测定，每个处理组随机取样并拍照。
实验结果：如图7(A)所示，可直观看出姜黄CDs处理后，四组小麦的外观没有显著差异。具体来讲，如图7(B)-图7(E)所示，株高、鲜重、干重和叶绿素含量结果表明，姜黄CDs处理对小麦幼苗的株高、鲜重、干重和叶绿素含量的影响不明显，说明姜黄CDs对小麦幼苗的生长指标无影响。此外，非生物胁迫通常会刺激ROS的产生，因此可以通过测定植物的抗氧化物酶活性来反映小麦幼苗受到的氧化胁迫。如图7(F)和图7(G)所示，姜黄CDs处理后，小麦幼苗的SOD和POD活性没有显著差异，因此姜黄CDs不会诱导小麦幼苗发生氧化应激。总的来讲，姜黄CDs对小麦幼苗的生长无不良影响。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围内，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.姜黄碳纳米点在下述任一项或制备具有下述任一项功能的产品中的应用；
A1、防治由禾谷镰刀菌引起的植物病害；
A2、防治小麦赤霉病；
A3、杀灭禾谷镰刀菌孢子；
A4、抑制禾谷镰刀菌；
A5、抑制禾谷镰刀菌孢子的生长；
A6、抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发；
所述应用在自然光照射条件下进行；
所述姜黄碳纳米点由包括如下步骤的方法制备得到：
1)取姜黄粉末，烘干备用；
2)使所述姜黄粉末和溶剂组成的体系进行水热反应，反应完毕后离心，收集上清液；
3)将所述上清液进行纯化后干燥，得到所述姜黄碳纳米点。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述溶剂为无水乙醇或N-N二甲基甲酰胺；
所述水热反应的温度为120～180℃；
所述水热反应的时间为2～6h。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述姜黄粉末和所述溶剂的比例为1g：(4～20)mL。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述离心的转速为5000～10000转/分钟，时间为5～10分钟；
所述纯化采用硅胶柱层析。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于：所述姜黄碳纳米点以其水溶液的形式存在，浓度为0～0.5g/L但不为0。
6.包含姜黄碳纳米点的杀菌组合物在下述任一项或制备具有下述任一项功能的产品中的应用；
A1、防治由禾谷镰刀菌引起的植物病害；
A2、防治小麦赤霉病；
A3、杀灭禾谷镰刀菌孢子；
A4、抑制禾谷镰刀菌；
A5、抑制禾谷镰刀菌孢子的生长；
A6、抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发；
所述姜黄碳纳米点由包括如下步骤的方法制备得到：
1)取姜黄粉末，烘干备用；
2)使所述姜黄粉末和溶剂组成的体系进行水热反应，反应完毕后离心，收集上清液；
3)将所述上清液进行纯化后干燥，得到所述姜黄碳纳米点。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述溶剂为无水乙醇或N-N二甲基甲酰胺；
所述水热反应的温度为120～180℃；
所述水热反应的时间为2～6h。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述姜黄粉末和所述溶剂的比例为1g：(4～20)mL。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的应用，其特征在于：所述离心的转速为5000～10000转/分钟，时间为5～10分钟；
所述纯化采用硅胶柱层析。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的应用，其特征在于：所述杀菌组合物还包含辅料和/或与所述姜黄碳纳米点可复配的杀菌组分。
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|---|---|---|---|---|
| CN117757470A (zh) * | 2023-12-07 | 2024-03-26 | 扬州大学 | 一种草碳点及其制备方法和应用 |
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2023
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