CN109691390A - 茭白种子愈伤培养法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种茭白种子愈伤培养法，包括以下步骤：1)、将茭白种子剥去种皮后进行消毒；2)、消毒后种子接种到诱导培养基中进行培养，从而获得愈伤组织；所用诱导培养基为MS+2mg/L激素2,4‑D，pH值5.85±0.1；3)、摘取愈伤组织转入分化培养基中进行培养，培养时间为25～55天。采用本发明的方法能提高茭白的愈伤诱导率。

Description

茭白种子愈伤培养法

技术领域

本发明涉及茭白愈伤培养领域。

背景技术

茭白，又名高瓜、菰笋、菰手、茭笋，高笋；是禾本科菰属多年生宿根草本植物。茭白多生长于长江湖地一带，适合淡水里生长。

目前，现有的茭白愈伤培养法为从茎尖培养愈伤，然后分化，具体如下：

在大田采集茭白地下匍匐茎冲洗干净，保湿带回实验配备室，取茎上互生侧芽，用清水冲洗30min，用无菌水冲洗2次，用滤纸将水分吸干，放入75％的酒精中消毒60s，并剥去表面包被着的叶片，用0.1％升汞液消毒10min，继续剥去部分叶片，用无菌水冲洗染4次，无菌滤纸吸干后，用5％次氯酸钠浸泡5min，用无菌水冲洗2次，无菌纸吸干后移入超净工作台。在双筒解剖镜下剥去剩下的叶片露出生长点，用解剖刀切取1～4mm大小茎尖分生组织,接种在制备好的固体培养基上进行培养。

上述茎尖培养愈伤尚存在着操作技术要求高，容易污染，愈伤率低(愈伤率仅仅为82％)、分化困难的不足之处(其分化率约75％)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种愈伤诱导率高的茭白愈伤培养法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种茭白种子愈伤培养法，包括以下步骤：

1)、种子消毒：

将茭白种子(饱满茭白种子)剥去种皮后进行消毒；

2)、诱导愈伤：

将步骤1)所得的消毒后种子接种到诱导培养基中进行培养，培养温度为25±1℃，光照16h，黑暗8h，光照强度为50±5μmol/m2/s；培养时间为20～30天，从而获得愈伤组织(为满足分化活力的嫩绿色愈伤组织)；

所述诱导培养基为MS+2mg/L 2,4-D，pH值5.85±0.1；

3)、诱导分化：

摘取(剥离)步骤2)所得的愈伤组织转入分化培养基中进行培养，培养温度为25±1℃，光照16h，黑暗8h，光照强度为50±5μmol/m2/s；培养时间为25～55天；

所述分化培养基为：MS+IAA 0.2mg/L+6-BA 0.5mg/L+KT 1mg/L+0.1％活性碳；pH值5.85±0.1。

备注说明：上述培养时间到达后，能获得满足炼苗生长的植株，可将该植株进行常规的后续培养，例如可按照已公开的《茭白的组织培养技术初探》进行生根、壮苗等后续步骤。

作为本发明的茭白种子愈伤培养法的改进，所述步骤1)的种子消毒为包括以下步骤：

1.1)将饱满茭白种子剥去种皮(用小镊子剥去种皮)，移入超净台工作；

1.2)70％(体积％)的酒精浸泡2-3次，每次浸泡时间为9～11min；

1.3)无菌水冲洗2～3次；

1.4)用NaClO混合液浸泡20～30min；

NaClO混合液为在15g NaClO、0.2g吐温-80(Tween 80)中加水定容至100ml均匀混合后而得；

1.5)无菌水浸泡洗4-5次，每次浸泡洗时间为1.5～2.5分钟。

作为本发明的茭白种子愈伤培养法的改进：

所述诱导培养基的制备方法为在1L MS基本培养基中加入2mg的激素2,4-D，调节pH值5.85±0.1，最后高温灭菌(为常规的高温灭菌，一般为在1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。

所述分化培养基的制备方法为：在1L MS基本培养基中加入1g活性碳；调节pH值5.85±0.1，高温灭菌(为常规的高温灭菌，一般为在1.1个大气压，121℃下灭菌20min)，等温度降至50±5℃，加入0.2mg IAA、0.5mg 6-BA、1mg KT。

相对于现有的茎尖培养愈伤法而言，本发明具有如下的技术优势：

1、操作技术要求相对简单方便，更适于市场应用；

2、现有技术采用茭白茎尖，而本发明采用茭白种子；

相比较茎尖，种子更容易诱导愈伤，所获得的为胚性愈伤，具有更强的分化能力。

3、本发明特别设定符合茭白种子特性的诱导培养基；从而使愈伤获得率≥92％，分化率≥85％。

4、用种子诱导的愈伤产生更多的胚性细胞。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为生长20天的愈伤组织。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、一种茭白种子愈伤培养法，依次进行以下步骤：

1)、种子消毒：

将饱满茭白种子剥去种皮后进行消毒；具体如下：

1.1)取饱满茭白种子，用小镊子剥去种皮，移入超净台工作；

1.2)70％(体积％)的酒精浸泡2～3次，每次浸泡时间为10min；

1.3)无菌水冲洗2～3次；每次冲洗2min；

1.4)用NaClO混合液浸泡30min；

NaClO混合液为15g NaClO、0.2g吐温-80中加水定容至100ml均匀混合后而得；

1.5)无菌水浸泡洗4～5次，每次浸泡洗时间为2分钟。

上述茭白种子选用4月采摘的山东茭白种子，满足萌发活力条件。

2)、诱导愈伤：

将步骤1)所得的消毒后种子接种到诱导培养基中进行培养，培养温度为25℃，光照16h,黑暗8h，光照强度为50μmol/m²/s；10天后开始长浅黄色愈伤，20天后所得的愈伤组织如图1所示；从而结束诱导愈伤。

诱导培养基为MS+2mg/L2,4-D，pH 5.85±0.1。

愈伤成功率为92％。

3)、诱导分化：

摘取步骤2)所得的愈伤组织转入分化培养基中进行培养，培养温度为25℃，光照16h,黑暗8h，光照强度为50μmol/m²/s；培养时间为40天，从而获得满足炼苗生长的植株。

分化培养基为：MS+IAA 0.2mg/L+6-BA 0.5mg/L+KT 1mg/L+0.1％活性碳；pH值5.85±0.1。

分化率为85％。

4)、将步骤3)所得的植株进行常规的后续培养，例如可按照已公开的《茭白的组织培养技术初探》进行生根、壮苗等后续步骤；基本能全部存活。

对比例1-1、

取消实施例1步骤1.4)中0.2g吐温-80的使用，即，将NaClO混合液改成质量浓度为15％的NaClO水溶液，其余等同于实施例1。

最终所得的结果为：由于灭菌不能彻底，组培中易染菌，因此，步骤2)的愈伤成功率仅仅为53％。

对比例1-2、

取消实施例1步骤1.4)中0.2g吐温-80的使用，且增加NaClO的浓度，即，将NaClO混合液改成质量浓度为30％的NaClO水溶液，其余等同于实施例1。

最终所得的结果为：30％NaClO水溶液浓度过高，浸泡30min容易将茭白种子泡软影响活力；导致愈伤成功率仅仅61％。

即使将浸泡时间缩短为约10min左右，愈伤成功率仅仅65％。

对比例2-1、将步骤2)的诱导培养基改成茎尖培养愈伤中采用的诱导培养基(其配方为MS+IAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+V_B14mg/L+KT1mg/L+0.1％活性碳)；其余等同于实施例1。

最终所得的结果为：步骤2)的愈伤成功率仅仅为70％。

对比例2-2、将步骤2)的诱导培养基由“MS+2mg/L 2,4-D”改成“MS+2mg/L IAA”，其余等同于实施例1。

最终所得的结果为：步骤2)的愈伤成功率仅仅为76％。

对比例2-3、将步骤2)的诱导培养基由“MS+2mg/L 2,4-D”改成“MS+2mg/L 6-BA”，其余等同于实施例1。

最终所得的结果为：步骤2)的愈伤成功率仅仅为61％。

对比例2-4、将步骤2)的诱导培养基由“MS+2mg/L 2,4-D”改成“MS+2mg/L KT”，其余等同于实施例1。

最终所得的结果为：步骤2)的愈伤成功率仅仅为64％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.茭白种子愈伤培养法，其特征是包括以下步骤：

1)、种子消毒：

将茭白种子剥去种皮后进行消毒；

2)、诱导愈伤：

将步骤1)所得的消毒后种子接种到诱导培养基中进行培养，培养温度为25±1℃，光照16h，黑暗8h，光照强度为50±5μmol/m²/s；培养时间为为20～30天，从而获得愈伤组织；

所述诱导培养基为MS+2mg/L激素2,4-D，pH值5.85±0.1；

3)、诱导分化：

摘取步骤2)所得的愈伤组织转入分化培养基中进行培养，培养温度为25±1℃，光照16h，黑暗8h，光照强度为50μmol/m2/s；培养时间为25～55天；

所述分化培养基为：MS+IAA 0.2mg/L+6-BA 0.5mg/L+KT 1mg/L+0.1％活性碳；pH值5.85±0.1。

2.根据权利要求1所述的茭白种子愈伤培养法，其特征是所述步骤1)的种子消毒为包括以下步骤：

1.1)将饱满茭白种子剥去种皮，移入超净台工作；

1.2)70％的酒精浸泡2-3次，每次浸泡时间为9～11min；

1.3)无菌水冲洗2～3次；

1.4)用NaClO混合液浸泡20～30min；

NaClO混合液为15g NaClO、0.2g吐温-80中加水定容至100ml均匀混合后而得；

1.5)无菌水浸泡洗4～5次，每次浸泡洗时间为1.5～2.5分钟。