CN115152352A - 一种工业大麻无菌实生苗繁育方法 - Google Patents

一种工业大麻无菌实生苗繁育方法 Download PDF

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Abstract

一种工业大麻无菌实生苗繁育方法，涉及一种工业大麻繁育方法。为了解决现有的种子灭菌方法灭菌率低、对种子伤害大的问题。方法：种子精选，用清水浸泡直至种子顶破种皮露出白色胚根后剥去外种皮和内种皮，放入装有质量分数为0.2％的次氯酸钠的三角瓶中进行灭菌处理，培养皿培养得到无菌的发芽种子，转移到装有MS固体培养基的容器中继续培养得到无菌实生苗，最后进行移栽。本发明种子先浸泡种子至胚根顶破种皮后去除外种皮和内种皮，只将完全展开、裸露的子叶以及胚轴、胚根进行灭菌，低浓度的次氯酸钠对种子发芽基本无伤害，种子发芽率100％，长势好，灭菌率达到90‑100％。

Description

一种工业大麻无菌实生苗繁育方法
技术领域
本发明涉及一种工业大麻繁育方法。
背景技术
大麻(Cannabis sativa L.)是大麻科(Cannabinaceae)大麻属(Cannabis)1年生草本植物，分为工业大麻和毒品大麻，现在国内外广泛应用的大麻为工业大麻。工业大麻是指四氢大麻酚含量低于0.3％的大麻，我国将工业大麻称为汉麻(hemp)。大麻浑身是宝，主要应用于农业种植、纺织、服装、造纸、军需、化工、新型建材、生物能源、食品保健、医药和饲料等方面。
我国工业大麻产业发展势头很猛，但由于大麻属雌雄异株，为典型的异花授粉作物,在大麻的繁种过程中，由于生物学混杂、机械混杂和不良环境条件引起的品种混杂退化现象十分普遍，品种间极易串粉杂交，核心种质资源的防杂保纯和雄性大麻植株繁殖十分困难。要解决工业大麻种质资源提纯保存，具有优良种质特性的后代材料快速纯化扩繁，就需要解决工业大麻无性繁殖技术问题，在大麻离体培养过程中，无菌实生苗和外植体的获得是关键，选择适宜的种子灭菌方法(消毒剂和处理时间)，既有良好的除菌效果，大大降低了初始污染率，又获得了生长状态更好的实生苗。目前种子的灭菌方法集中在用75％酒精、高浓度的次氯酸钠或升汞三种消毒剂组合应用对种子进行直接灭菌，然后再浸泡剥去种皮或不浸泡不剥去种皮直接种植于培养基中，但由于大麻种皮厚并且内生菌很多，这些方法灭菌率较低，并对种子伤害很大，发芽率较低。
发明内容
本发明为了解决现有的种子灭菌方法灭菌率低、对种子伤害大的问题，提出一种工业大麻无菌实生苗繁育方法。
本发明工业大麻无菌实生苗繁育方法按照以下步骤进行：
一、种子精选
挑选成熟、完整饱满、无病虫侵害、有光泽的工业大麻种子，种子净度达到100％，纯度达到100％，发芽率达到99％以上；
二、种子浸泡
用清水浸泡直至种子顶破种皮露出白色胚根后剥去外种皮和内种皮；种子浸泡时间一般为24-48小时，根据环境温度适当调整；
三、种子灭菌
将剥去外种皮和内种皮的工业大麻种子放入装有质量分数为0.2％的次氯酸钠的三角瓶中进行灭菌处理，灭菌时间总计30～35分钟；灭菌分3次处理，每隔10-12分钟更换1次新的次氯酸钠，灭菌处理过程中摇动三角瓶以达到灭菌彻底的效果；灭菌处理后用无菌水冲洗种子3-4遍，将发芽种子表面的次氯酸钠冲洗干净；
四、培养皿培养
将MS固体培养基灭菌后分装入培养皿中，待培养基凝固冷却后将灭菌完成的种子接种到皿中，培养皿用报纸包裹后，放于培养箱中进行培养，培养2-3天，得到无菌的发芽种子；
五、繁殖
将无菌的发芽种子转移到装有MS固体培养基的容器中继续培养，发芽种子播种密度和容器体积以不影响工业大麻植株生长为宜，培养10-15天，得到无菌实生苗；获得的无菌实生苗根系强壮，生长良好，不需驯化炼苗，可直接出瓶，用做组织培养中的无菌外植体来源，用于工业大麻组织培养、遗传转化以及工厂化育苗等。
六、移栽
将无菌实生苗直接移栽，或将无菌实生苗扩繁生根后进行移栽。
本发明原理及有益效果为：
本发明种子先浸泡种子至胚根顶破种皮后去除外种皮和内种皮，只将完全展开、裸露的子叶以及胚轴、胚根进行灭菌，低浓度的次氯酸钠对种子发芽基本无伤害，种子发芽率100％，长势好，灭菌率达到90-100％。
种子常用的灭菌剂主要为酒精、次氯酸钠和升汞。酒精和次氯酸钠的杀菌效果差不多，只是用途不一样。次氯酸钠主要用于物体表面和环境等灭菌，其水解的次氯酸能将有还原性的物质氧化，使微生物最终丧失机能，无法繁殖或感染；医用酒精的主要成分是乙醇并且是混合物，酒精主要是让蛋白质变性来达到灭菌的效果。升汞又称氯化汞，具有杀菌力强，渗透性好的特点，但对人畜皆有剧毒。能达到灭菌的效果的酒精浓度通常是70-80％，常用的是75％，酒精浓度过高，用其灭菌对大麻种子发芽率影响很大，特别是去除种皮和内种皮后的大麻种子，应用其进行灭菌后，会造成不可逆的伤害；升汞毒性大并具有腐蚀性，不能接触金属物，操作过程应严格防护，对操作人员要求极高，且其在种子灭菌过程中对种子的伤害也不可避免，更不能直接用于去除种皮的工业大麻种子；本发明只采用了0.2％的次氯酸钠进行灭菌，对种子几乎不会造成任何伤害。
附图说明
图1为实施例1中清水浸泡后的种子；成熟种子浸泡后胚根顶破种皮；
图2为实施例1中剥去外种皮和内种皮后的发芽种子；
图3为实施例1中外种皮和内种皮后的种子在几种灭菌处理后的发芽情况；
图4为实施例1中挑选的0.2％次氯酸钠处理后无菌的发芽种子；
图5为实施例1中获得的无菌实生苗。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意合理组合。
具体实施方式一：本实施方式工业大麻无菌实生苗繁育方法按照以下步骤进行：
一、种子精选
挑选成熟、完整饱满、无病虫侵害、有光泽的工业大麻种子，种子净度达到100％，纯度达到100％，发芽率达到99％以上；
二、种子浸泡
用清水浸泡直至种子顶破种皮露出白色胚根后剥去外种皮和内种皮；种子浸泡时间一般为24-48小时，根据环境温度适当调整；
三、种子灭菌
将剥去外种皮和内种皮的工业大麻种子放入装有质量分数为0.2％的次氯酸钠的三角瓶中进行灭菌处理，灭菌时间总计30～35分钟；灭菌分3次处理，每隔10-12分钟更换1次新的次氯酸钠，灭菌处理过程中摇动三角瓶以达到灭菌彻底的效果；灭菌处理后用无菌水冲洗种子3-4遍，将发芽种子表面的次氯酸钠冲洗干净；
四、培养皿培养
将MS固体培养基灭菌后分装入培养皿中，待培养基凝固冷却后将灭菌完成的种子接种到皿中，培养皿用报纸包裹后，放于培养箱中进行培养，培养2-3天，得到无菌的发芽种子；
五、繁殖
将无菌的发芽种子转移到装有MS固体培养基的容器中继续培养，发芽种子播种密度和容器体积以不影响工业大麻植株生长为宜，培养10-15天，得到无菌实生苗；获得的无菌实生苗根系强壮，生长良好，不需驯化炼苗，可直接出瓶，用做组织培养中的无菌外植体来源，用于工业大麻组织培养、遗传转化以及工厂化育苗等。
六、移栽
将无菌实生苗直接移栽，或将无菌实生苗扩繁生根后进行移栽。
本实施方式种子先浸泡种子至胚根顶破种皮后去除外种皮和内种皮，只将完全展开、裸露的子叶以及胚轴、胚根进行灭菌，低浓度的次氯酸钠对种子发芽基本无伤害，种子发芽率100％，长势好，灭菌率达到90-100％。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四所述培养条件为：温度我25℃，湿度为40-50％，光照强度为2000-2500Lux，16h光照/8h黑暗。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤五所述容器为组培瓶、试管等。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤五所述培养条件为：温度为25℃，湿度为40-50％，光照强度为4000-5000Lux，16h光照/8h黑暗。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤六所述移栽方法为：选择株型完整、茎秆粗壮、根系完整的无菌实生苗移栽，出瓶时将培养基与无菌实生苗一起取出，洗净根部的培养基和琼脂，转移到装有基质的盆中，基质需要提前灭菌；所述基质由粗椰糠、细椰糠和泥炭组成；粗椰糠、细椰糠和泥炭的质量比为0.15:0.35:0.5；所述基质的灭菌方法为：在121℃的高压锅中湿热灭菌30-40分钟。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤四和五中所述MS固体培养基中含有的营养元素包括大量元素、微量元素、铁盐和有机物，每升培养基含有18-20g琼脂粉。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述大量元素为KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4和CaCl 2·2H2O；所述微量元素为MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、Na2MnO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O；所述铁盐为Na2-EDTA和FeSO4·7H2O；所述有机物为甘氨酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、烟酸和肌醇。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七不同的是：所述培养基中大量元素的含量为：KNO3：1.9g/L，NH4NO3：1.65g/L，MgSO4·7H2O：0.37g/L，KH2PO4：0.17/L，CaCl2·2H2O：0.44g/L；
所述培养基中微量元素的含量为：MnSO4·4H2O：0.023g/L，ZnSO4·7H2O：0.0086g/L，H3BO3：0.0062g/L，KI：0.00083g/L，Na2MnO4·2H2O：0.00025g/L，CuSO4·5H2O：0.000025g/L，CoCl2·6H2O：0.000025g/L；
所述培养基中铁盐的含量为：Na2-EDTA：0.037g/L和FeSO4·7H2O：0.0278g/L；
所述培养基中有机物的含量为：甘氨酸：0.0001g/L，盐酸吡哆醇：0.00025g/L，盐酸硫胺素：0.00005g/L，烟酸：0.00025g/L，肌醇：0.05g/L；
所述铁盐的配置方法：将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别称好，分别放到馏水中，边加热边不断搅拌使溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，加热至沸腾，当颜色变深黄色后，定容到1L，保存在棕色玻璃瓶中。
实施例1：
本实施例工业大麻无菌实生苗繁育方法按照以下步骤进行：
一、种子精选
挑选成熟、完整饱满、无病虫侵害、有光泽的工业大麻种子，种子净度达到100％，纯度达到100％，发芽率达到99％以上；
二、种子浸泡
用清水浸泡直至种子顶破种皮露出白色胚根后剥去外种皮和内种皮；
所述种子浸泡时间为36小时，根据环境温度适当调整；
三、种子灭菌
将剥去外种皮和内种皮的工业大麻种子放入装有质量分数为0.2％的次氯酸钠的100ml三角瓶中进行灭菌处理，灭菌时间总计30分钟；灭菌分3次处理，每隔10分钟更换1次新的次氯酸钠，灭菌处理过程中摇动三角瓶以达到灭菌彻底的效果；灭菌处理后用无菌水冲洗种子4遍，将发芽种子表面的次氯酸钠冲洗干净；
四、培养皿培养
将MS固体培养基灭菌后分装入培养皿中，待培养基凝固冷却后将灭菌完成的种子接种到皿中，培养皿用报纸包裹后，放于培养箱中进行培养，培养3天，得到无菌的发芽种子；
步骤四所述培养条件为：温度我25℃，湿度为45％，光照强度为2500Lux，16h光照/8h黑暗；
五、繁殖
将无菌的发芽种子转移到装有MS固体培养基的容器中继续培养，发芽种子播种密度和容器体积以不影响工业大麻植株生长为宜，培养15天，得到无菌实生苗；获得的无菌实生苗根系强壮，生长良好，不需驯化炼苗，可直接出瓶，用做组织培养中的无菌外植体来源，用于工业大麻组织培养、遗传转化以及工厂化育苗等。
步骤五所述容器为组培瓶；
步骤五所述培养条件为：温度为25℃，湿度为45％，光照强度为4500Lux，16h光照/8h黑暗；
六、移栽
将无菌实生苗直接移栽，或将无菌实生苗扩繁生根后进行移栽；
步骤六所述移栽方法为：选择株型完整、茎秆粗壮、根系完整的无菌实生苗移栽，出瓶时将培养基与无菌实生苗一起取出，洗净根部的培养基和琼脂，转移到装有基质的盆中，基质需要提前灭菌；
所述基质由粗椰糠、细椰糠和泥炭组成；粗椰糠、细椰糠和泥炭的质量比为0.15:0.35:0.5；
所述基质的灭菌方法为：在121℃的高压锅中湿热灭菌40分钟；
移栽后管理：移植好的盆栽苗需要进行覆膜处理，先放于培养箱中，培养条件为：温度为24-25℃，湿度为65-70％，光照强度为4000-5000Lux、16h光照/8h黑暗条件下培养7天左右将覆盖的膜揭开，继续培养7天左右，有新叶长出，证明实生苗或组培苗已经成活，就可转移到室内进行培养，然后按照常规方法管理即可。
步骤四和五中所述培养基中含有的营养元素包括大量元素、微量元素、铁盐和有机物，每升培养基含有18-20g琼脂粉；
所述大量元素为KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4和CaCl2·2H2O；
所述培养基中大量元素的含量为：KNO3：1.9g/L，NH4NO3：1.65g/L，MgSO4·7H2O：0.37g/L，KH2PO4：0.17/L，CaCl2·2H2O：0.44g/L；
所述微量元素为MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、Na2MnO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O；
所述培养基中微量元素的含量为：MnSO4·4H2O：0.023g/L，ZnSO4·7H2O：0.0086g/L，H3BO3：0.0062g/L，KI：0.00083g/L，Na2MnO4·2H2O：0.00025g/L，CuSO4·5H2O：0.000025g/L，CoCl2·6H2O：0.000025g/L；
所述铁盐为Na2-EDTA和FeSO4·7H2O；
所述培养基中铁盐的含量为：Na2-EDTA：0.037g/L和FeSO4·7H2O：0.0278g/L；
所述有机物为甘氨酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、烟酸和肌醇；
所述培养基中有机物的含量为：甘氨酸：0.0001g/L，盐酸吡哆醇：0.00025g/L，盐酸硫胺素：0.00005g/L，烟酸：0.00025g/L，肌醇：0.05g/L；
所述铁盐的配置方法：将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别称好，分别放到馏水中，边加热边不断搅拌使溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，加热至沸腾，当颜色变深黄色后，定容到1L，保存在棕色玻璃瓶中。
固体培养基制备按比例加入各母液成分后，每升加入18-20g琼脂粉，灭菌后然后进行分装。
图1为实施例1中清水浸泡后的种子；成熟种子浸泡后胚根顶破种皮；图2为实施例1中剥去外种皮和内种皮后的发芽种子；图中1为胚根顶破种皮的种子，2为剥去外种皮的种子，3为剥去的内种皮，4为剥去外种皮和内种皮后完全裸露的种子，能够看到胚和2片子叶；图3为实施例1中外种皮和内种皮后的种子在几种灭菌处理后的发芽情况；图中1为3％次氯酸钠灭菌30秒，2为75％酒精30秒+0.2％次氯酸钠灭菌20分钟，3为采用0.2％次氯酸钠灭菌30分钟；图4为实施例1中挑选的0.2％次氯酸钠处理后无菌的发芽种子；图5为实施例1中获得的无菌实生苗。
对比实验：将直接去除外种皮的工业大麻种子放入装有75％的酒精溶液的100ml三角瓶中灭菌30秒，清水冲洗3次，除掉种子表面残留的酒精；然后将种子放入质量分数为2％的次氯酸钠再次进行灭菌10分钟，灭菌处理过程中摇动三角瓶以达到灭菌彻底的效果；灭菌处理后用无菌水冲洗种子4遍，将种子表面的次氯酸钠冲洗干净。不浸泡直接去除外种皮的工业大麻种子需用酒精和较高浓度的次氯酸钠同时进行杀菌，否则灭菌不彻底，对比实验灭菌率可达60-80％，种子芽率80％左右，种子有轻微损伤，长势明显弱于本发明，并且随着次氯酸钠的浓度升高，种子芽率和发芽势随之降低。

Claims (8)

1.一种工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：工业大麻无菌实生苗繁育方法按照以下步骤进行：
一、种子精选
挑选成熟、完整饱满、无病虫侵害、有光泽的工业大麻种子，种子净度达到100％，纯度达到100％，发芽率达到99％以上；
二、种子浸泡
用清水浸泡直至种子顶破种皮露出白色胚根后剥去外种皮和内种皮；
三、种子灭菌
将剥去外种皮和内种皮的工业大麻种子放入装有质量分数为0.2％的次氯酸钠的三角瓶中进行灭菌处理，灭菌时间总计30～35分钟；灭菌分3次处理，每隔10-12分钟更换1次新的次氯酸钠，灭菌处理过程中摇动三角瓶以达到灭菌彻底的效果；灭菌处理后用无菌水冲洗种子3-4遍，将发芽种子表面的次氯酸钠冲洗干净；
四、培养皿培养
将MS固体培养基灭菌后分装入培养皿中，待培养基凝固冷却后将灭菌完成的种子接种到皿中，培养皿用报纸包裹后，放于培养箱中进行培养，培养2-3天，得到无菌的发芽种子；
五、繁殖
将无菌的发芽种子转移到装有MS固体培养基的容器中继续培养10-15天，得到无菌实生苗；
六、移栽
将无菌实生苗直接移栽，或将无菌实生苗扩繁生根后进行移栽。
2.根据权利要求1所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：步骤四所述培养条件为：温度我25℃，湿度为40-50％，光照强度为2000-2500Lux，16h光照/8h黑暗。
3.根据权利要求1所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：步骤五所述容器为组培瓶或试管。
4.根据权利要求1所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：步骤五所述培养条件为：温度为25℃，湿度为40-50％，光照强度为4000-5000Lux，16h光照/8h黑暗。
5.根据权利要求1所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：步骤六所述移栽方法为：选择株型完整、茎秆粗壮、根系完整的无菌实生苗移栽，出瓶时将培养基与无菌实生苗一起取出，洗净根部的培养基和琼脂，转移到装有基质的盆中，基质需要提前灭菌；所述基质由粗椰糠、细椰糠和泥炭组成；粗椰糠、细椰糠和泥炭的质量比为0.15:0.35:0.5；所述基质的灭菌方法为：在121℃的高压锅中湿热灭菌30-40分钟。
6.根据权利要求1所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：步骤四和五中所述MS固体培养基中含有的营养元素包括大量元素、微量元素、铁盐和有机物，每升培养基含有18-20g琼脂粉。
7.根据权利要求6所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：所述大量元素为KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4和CaCl2·2H2O；所述微量元素为MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、Na2MnO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O；所述铁盐为Na2-EDTA和FeSO4·7H2O；所述有机物为甘氨酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、烟酸和肌醇。
8.根据权利要求7所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：所述培养基中大量元素的含量为：KNO3：1.9g/L，NH4NO3：1.65g/L，MgSO4·7H2O：0.37g/L，KH2PO4：0.17/L，CaCl2·2H2O：0.44g/L；
所述培养基中微量元素的含量为：MnSO4·4H2O：0.023g/L，ZnSO4·7H2O：0.0086g/L，H3BO3：0.0062g/L，KI：0.00083g/L，Na2MnO4·2H2O：0.00025g/L，CuSO4·5H2O：0.000025g/L，CoCl2·6H2O：0.000025g/L；
所述培养基中铁盐的含量为：Na2-EDTA：0.037g/L和FeSO4·7H2O：0.0278g/L；
所述培养基中有机物的含量为：甘氨酸：0.0001g/L，盐酸吡哆醇：0.00025g/L，盐酸硫胺素：0.00005g/L，烟酸：0.00025g/L，肌醇：0.05g/L；
所述铁盐的配置方法：将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别称好，分别放到馏水中，边加热边不断搅拌使溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，加热至沸腾，当颜色变深黄色后，定容到1L，保存在棕色玻璃瓶中。
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