CN115024221B - 一种大叶种巴戟天组培苗快速繁殖的方法及其应用 - Google Patents

一种大叶种巴戟天组培苗快速繁殖的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大叶种巴戟天组培苗快速繁殖的方法及其应用。所述方法包括以下步骤：S1.将新生的大叶种巴戟天藤茎消毒、漂洗，得到外植体；S2.将步骤S1得到的外植体接种至腋芽诱导培养基，诱导培养得到腋芽；S3.将步骤S2得到的腋芽接种至丛生芽诱导培养基中，诱导培养得到丛生芽；S4.将步骤S3得到的丛生芽接种至生根诱导培养基中，诱导培养丛生芽生根，得到大叶种巴戟天组培苗。本发明的方法中利用特定的丛生芽诱导培养基，可以快速诱导培养出大叶种巴戟天组培苗，利用本发明的方法进行诱导，可以诱导出正常丛生芽，且腋芽诱导时间更短、诱导率高，组培苗生根效果好。

Description

一种大叶种巴戟天组培苗快速繁殖的方法及其应用
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种大叶种巴戟天组培苗快速繁殖的方法及其应用。
背景技术
巴戟天Morindaofficinalis How为茜草科(Rubiaceae)植物。其干燥根可入药，具有强健筋骨、滋补肾阳、祛风除湿的功效，为四大南药之一。巴戟天兼具“药用”及“保健”功效，在我国南方民间被制成各种保健品广泛使用。近年来，随着中医药保健事业的发展，巴戟天作为传统补益类中药也逐渐受到重视。巴戟天目前主要通过扦插繁殖方式进行人工栽培而获得，但长期的无性繁殖为病毒的累积创造了条件，病害等较多，严重影响了巴戟天药材的产量和质量，直接影响药材品质和疗效。因此，如何能够获得高质量、高品质、高产量的巴戟天药材，成为巴戟天研究者首要解决的问题。调研发现：目前主要栽培产地有多种农家品系，如小叶种、大叶种、稼接种等，丁平等发现不同农家类型巴戟天种质资源在分子水平上存在明显的遗传差异，因此，十分有必要针对不同品系的巴戟天进行培育。
研究发现，小叶巴戟天遗传多样性明显高于其他农家类型，可能导致目前栽培巴戟天质量产生变异(丁平,刘瑾,仰铁锤,等.巴戟天遗传多样性的RAPD研究.)。在品种调查及收集中发现大叶种巴戟天具有耐低温、抗旱等生物学特性，特别适合用作巴戟天材料的培养来源，为建立组培体系可以规范品种来源，使研究材料的基因背景一致，为之后研究抗旱、抗寒机制奠定基础；因此十分有必要以大叶种巴戟天为研究对象进行组织培养繁殖的研究，获得大量优质且质量稳定的巴戟天脱毒幼苗，为提高巴戟天药材质量和产业化种植奠定基础。
组织培养技术是获得优质种苗的主要方法，通过组织培养可获得脱毒种苗进行复壮以提高种苗的质量。目前植物组织培养的器官发生途径主要有直接器官发生和间接器官发生，利用较多的为间接器官发生途径，但该方法极易发生变异，导致药用植物再生频率及品质变化较大。而直接器官发生途径由于缺少诱导愈伤组织阶段，相对来说再生周期进一步缩短，且具有极强的遗传稳定性，因此该方法对于保持道地药材质量稳定性具有重要作用。现有技术虽然公开了利用直接器官发生途径进行巴戟天快速组织培养，但是其培养方法并不适用于大叶种巴戟天的快速培育，针对大叶种巴戟天的直接器官发生途径获取组培苗的方法需要进一步研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有巴戟天直接器官发生途径无法获得良好大叶种巴戟天组培苗的缺陷和不足，提供一种大叶种巴戟天组培苗快速繁殖的方法及其应用。
本发明的目的在于提供一种大叶种巴戟天组培苗快速繁殖的方法。
本发明的目的还在于提供利用所述方法培养的大叶种巴戟天组培苗。
本发明的目的还在于提供一种利用所述大叶种巴戟天组培苗培育大叶种巴戟天的方法。
本发明以直接器官发生途径为主，以大叶种巴戟天茎段为外植体，诱导得到腋芽，腋芽诱导丛生芽，丛生芽诱导生根获得大叶种巴戟天的组培苗，建立大叶种巴戟天的组培苗快速繁殖体系。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
本发明提供了一种大叶种巴戟天组培苗快速繁殖的方法，包括以下步骤：
S1.将新生的大叶种巴戟天藤茎消毒、漂洗，得到外植体；
S2.将步骤S1得到的外植体接种至腋芽诱导培养基，诱导培养得到腋芽；
S3.将步骤S2得到的腋芽接种至丛生芽诱导培养基中，诱导培养得到丛生芽；
S4.将步骤S3得到的丛生芽接种至生根诱导培养基中，诱导培养丛生芽生根，得到大叶种巴戟天组培苗；
步骤S2中，所述腋芽诱导培养基为含有浓度为0.15～0.25mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)的1/2MS培养基，pH为5.5～6.5；
步骤S3中，所述丛生芽诱导培养基为含有浓度为0.8～1.2mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、浓度为0.15～0.25mg/L的吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基，pH为5.5～6.5；
步骤S4中，所述生根诱导培养基为含有浓度为0.2～0.55mg/L的吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基，pH为5.5～6.5。
优选地，步骤S2～S4中，所述诱导培养的条件为：每天光照11～12小时，光照强度为1100～1200lx，空气温度为20～25℃，湿度为60～70％。
进一步优选地，步骤S2～S4中，所述诱导培养的条件为：每天光照12小时，光照强度为1200lx，空气温度25℃，湿度60％。
优选地，步骤S1中，所述消毒为利用质量百分数0.05～0.15％的氯化汞溶液进行消毒。
进一步优选地，步骤S1中，所述消毒为利用质量百分数0.1％的氯化汞溶液进行消毒。
优选地，步骤S1中，所述藤茎包括幼嫩茎、半木质化茎及完全木质化茎。
进一步优选地，所述幼嫩茎的消毒是利用质量百分数0.1％的氯化汞溶液消毒260～280s；所述半木质化茎及完全木质化茎的消毒是利用质量百分数0.1％的氯化汞溶液消毒350～370s。
更进一步优选地，所述幼嫩茎的消毒是利用质量百分数0.1％的氯化汞溶液消毒270s；所述半木质化茎及完全木质化茎的消毒是利用质量百分数0.1％的氯化汞溶液消毒360s。
优选地，步骤S2中，所述腋芽诱导培养基为含有浓度为0.2mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)的1/2MS培养基，pH为6.0；
优选地，步骤S3中，所述丛生芽诱导培养基为含有浓度为1mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、浓度为0.2mg/L的吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基，pH为6.0。
优选地，步骤S4中，所述生根诱导培养基为含有浓度为0.45～0.5mg/L的吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基，pH为6.0。
进一步优选地，步骤S4中，所述生根诱导培养基为含有浓度为0.5mg/L的吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基，pH为6.0。
一种培育大叶种巴戟天的方法，利用上述方法制备得到大叶种巴戟天组培苗，然后对所述大叶种巴戟天组培苗进行炼苗和移栽培养，即得大叶种巴戟天。
优选地，所述炼苗具体为：将根系生长良好的组培苗移入组培瓶中，保持温度20～25℃、相对湿度55％～65％，组培瓶密封置于自然光照条件下，放置2～3d后打开瓶口，自然光下炼苗4～5d，避免阳光直射。
进一步优选地，所述炼苗具体为：将根系生长良好的组培苗移入组培瓶中，保持温度20～25℃、相对湿度55％～65％，组培瓶密封置于自然光照条件下，放置3d后打开瓶口，自然光下炼苗5d，避免阳光直射。
优选地，所述移栽具体为：将炼苗结束的大叶种巴戟天组培苗去除培养基后，利用多菌灵溶液灭菌，清洗后移栽至草炭土和珍珠岩体积比1:1～1:1.5混匀的栽培基质中，正常浇水培养。
进一步优选地，所述移栽具体为：将炼苗结束的大叶种巴戟天组培苗去除培养基后，利用浓度为2g/L的多菌灵溶液灭菌，清洗后移栽至草炭土和珍珠岩体积比1:1混匀的栽培基质中，正常浇水培养。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的大叶种巴戟天组培苗快速繁殖的方法，可以快速诱导培养出大叶种巴戟天组培苗，利用本发明的方法进行诱导，可以诱导出正常丛生芽，且腋芽诱导时间更短、诱导率高，组培苗生根效果好。
附图说明
图1为本发明新长出藤茎的大叶种巴戟天植株。
图2为本发明腋芽诱导培养的生长情况；其中A为诱导前的茎段，B为茎段诱导出的腋芽生长情况。
图3为本发明丛生芽的生长情况。
图4为本发明对比1～3的培养基诱导丛生芽培养的生长情况；A代表对比1，B代表对比2，C代表对比3。
图5为本发明对比4～9的丛生芽的生长情况；A代表对比4，B代表对比5，C代表对比6，D代表对比7，E代表对比8，F代表对比9。
图6为本发明对比10～11诱导生根的情况；其中A代表对比10，B代表对比11。
图7为本发明实施例5生根的组培苗的生长情况。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
MS培养基：大量元素，100mL/L；铁元素，10mL/L；微量元素，1mL/L；维生素，1mL/L；甘氨酸，1mL/L；肌醇，4mL/L；蔗糖，30g/L；琼脂，4.2～4.3g/L；调pH值至5.8～6.0，分装，121℃，20min，高压灭菌备用。
1/2MS培养基：大量元素，50mL/L；铁元素，10mL/L；微量元素，1mL/L；维生素，1mL/L；甘氨酸，1mL/L；肌醇，4mL/L；蔗糖，30g/L；琼脂，4.2～4.3g/L；调pH值至5.8～6.0，分装，121℃，20min，高压灭菌备用。
1/3MS培养基：大量元素，33.3mL/L；铁元素，10mL/L；微量元素，1mL/L；维生素，1mL/L；甘氨酸，1mL/L；肌醇，4mL/L；蔗糖，30g/L；琼脂，4.2～4.3g/L；调pH值至5.8～6.0，分装，121℃，20min，高压灭菌备用。
1/4MS培养基：大量元素，25mL/L；铁元素，10mL/L；微量元素，1mL/L；维生素，1mL/L；甘氨酸，1mL/L；肌醇，4mL/L；蔗糖，30g/L；琼脂，4.2～4.3g/L；调pH值至5.8～6.0，分装，121℃，20min，高压灭菌备用。
大量元素溶液的配制：精密称取硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙，超纯水定容，制成含硝酸钾19g/L、硝酸铵1.65g/L、磷酸二氢钠1.7g/L、硫酸镁1.8g/L、氯化钙3.3g/L的大量元素溶液。
铁元素溶液的配制：精密称取硫酸亚铁及乙二胺四乙酸二钠，超纯水定容，制成含硫酸亚铁2.785g/L、乙二胺四乙酸二钠3.725g/L的铁元素溶液。
微量元素溶液的配制：精密称取碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硼酸钠、硫酸铜、氯化钴，超纯水定容，制成含碘化钾0.86g/L、硼酸6.2g/L、硫酸锰17.08g/L，硫酸锌8.6g/L、硼酸钠0.25g/L、硫酸铜0.025g/L、氯化钴0.025g/L的微量元素溶液。
维生素溶液的配制：精密称取维生素B1、维生素B6、PP烟酸，超纯水定容，制成含维生素B1 0.5g/L、维生素B6 0.5g/L、PP烟酸5g/L的微量元素溶液。
甘氨酸溶液的配制：精密甘氨酸，超纯水定容，制成含甘氨酸2g/L的甘氨酸溶液。
肌醇溶液的配制：精密肌醇，超纯水定容，制成含肌醇25g/L的肌醇溶液。
实施例1大叶种巴戟天外植体材料预处理
选取成株的、3～4年生的大叶种巴戟天植株，移栽至洁净大棚内，将大叶种巴戟天茎基处的藤茎剪去，每周向植株喷洒10wt％多菌灵溶液一次。一月后长出新的藤茎，将新长出的藤茎作为外植体材料。新长出藤茎的大叶种巴戟天植株如图1所示。
将切除叶片的新长出的大叶种巴戟天的藤茎置于超净工作台中，用75％酒精棉片擦拭藤茎表面，然后将藤茎切成带有节位的长度约为2～3cm的茎段。藤茎分为三部分：距离顶端20cm以内的幼嫩茎、距离顶端20～40cm的半木质化茎，距离顶端超过40cm的完全木质化茎。幼嫩茎的茎段用0.1wt％的氯化汞溶液消毒4min30s，无菌水漂洗三次；半木质化茎及完全木质化茎的茎段用0.1wt％的氯化汞溶液消毒6min，无菌水漂洗三次；处理结束后的茎段用于诱导培养。
实施例2大叶种巴戟天组培苗的培养
1.腋芽诱导培养
腋芽诱导培养基：含有浓度为0.2mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)的1/2MS培养基，pH为6.0。
将实施例1处理后的茎段于无菌条件下接种至腋芽诱导培养基，接种后每天光照12小时，光照强度为1200lx，空气温度为25℃，湿度为60％，培养20天后长出腋芽，观察并统计腋芽诱导率及腋芽生长情况；
腋芽诱导率(％)＝诱导出了腋芽的外植体数/外植体总数*100。
培养20天左右长出的腋芽芽体健壮，生长状况良好、呈深绿色，腋芽诱导率为80.55％。腋芽诱导培养的生长情况如图2所示，其中A为诱导前的茎段，B为茎段诱导出的腋芽生长情况。
利用相同的方式处理，以小叶种巴戟天藤茎为外植体，以含有浓度为0.2mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)的1/2MS培养基，pH为6.0的腋芽诱导培养基诱导腋芽，培养30天才能长出腋芽，其腋芽诱导率仅仅为70％，明显低于大叶种腋芽的诱导率。
2.丛生芽诱导培养
丛生芽诱导培养基：含有浓度为1mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、浓度为0.2mg/L的吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基，pH为6.0。
将腋芽诱导培养基培养一个月得到的腋芽从茎段上切下，接种于丛生芽诱导培养基中，接种后每天光照12小时，光照强度为1200lx，空气温度为25℃，湿度为60％。培养30天后，记录丛生芽的增殖系数以及丛生芽生长状况；
增殖系数＝诱导出的丛生芽芽数/腋芽总数。
丛生芽的增殖系数为1.8，丛生芽的生长情况如图3所示，图3显示，丛生芽芽体健壮，生长良好。
3.生根诱导培养
生根诱导培养基：含有浓度为0.5mg/L的吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基，pH为6.0。
将经过丛生芽诱导培养的，高度1.5～2cm的丛生芽切下，接种至生根诱导培养基中，接种后每天光照12小时，光照强度为1200lx，空气温度为25℃，湿度为60％。培养20天后丛生芽长出白色短根，统计其生根率，记载根系生长状况，得到组培苗。
生根率＝根长大于0.5cm的植株数/总植株数*100。
组培苗的生根率达100％，组培苗诱导出白色短根为正常根，根须较少，粗壮。
4.炼苗及移栽
挑选根系生长良好的组培苗移入组培瓶中，保持温度20～25℃、相对湿度60％左右(55％～65％)，组培瓶密封置于自然光照条件下，放置3d。然后打开瓶口，自然光下炼苗5d，注意避免阳光直射。将炼苗结束的大叶种巴戟天幼苗从组培瓶中移出，清水洗净根部残留的培养基，将根部浸泡于浓度为2g/L的多菌灵溶液中3min，再用流水冲洗1min。然后将组培苗移栽至草炭土和珍珠岩体积比为1:1混匀的栽培基质中，移栽后浇透土壤，随后1～3天浇水一次，每次浇水以土壤表面湿润，盆底不滴水为标准，正常培养。移栽后培养30天后，大叶种巴戟天组培苗的存活率大于90％。
对比例1不同MS培养基对丛生芽诱导的影响
将丛生芽诱导的培养基的成分进行更换，观察不同培养基对丛生芽诱导的影响。
将实施例2中丛生芽诱导培养基替换成含有浓度为0.2mg/L 6-BA的1/2MS培养基，作为对比1。
将实施例2中丛生芽诱导培养基替换成含有浓度为0.2mg/L 6-BA的1/3MS培养基，作为对比2。
将实施例2中丛生芽诱导培养基替换成含有浓度为0.2mg/L 6-BA的1/4MS培养基，作为对比3。
对比1～3的培养基诱导丛生芽培养的生长情况如图4所示，图4中，A代表对比1，B代表对比2，C代表对比3。
图4结果显示：对比1丛生芽诱导的培养基诱导培养丛生芽，45天的时候出现玻璃化现象，生长缓慢，伴有新叶叶片褐化；对比2丛生芽诱导的培养基诱导培养丛生芽，未出现玻璃化现象，但生长缓慢，同时伴有新叶叶片褐化、过分潮湿、脱落的现象；对比3丛生芽诱导的培养基诱导培养丛生芽，未出现玻璃化现象，但生长缓慢，同时伴有新叶叶片褐化、过分潮湿、脱落的现象。对比1～3丛生芽诱导的效果均比实施例2差，丛生芽的增殖系数也均小于实施例2。
对比例2不同激素对丛生芽诱导的影响
将实施例2中的丛生芽诱导培养基中的激素6-BA和IBA的浓度进行调整，其余不变，得到对比4～9的丛生芽诱导的培养基，利用对比4～9的丛生芽诱导的培养基进行丛生芽的诱导，获得的丛生芽的增殖系数(增殖系数计算公式同实施例2)、生长高度、生长情况如表1；对比4～9的丛生芽的生长情况如图5所示，其中A代表对比4，B代表对比5，C代表对比6，D代表对比7，E代表对比8，F代表对比9。
表1对比4～9丛生芽的增殖系数、生长高度、生长情况
Figure BDA0003696723010000081
注：对比8即实施例2中的丛生芽诱导培养基。
从表1和图5可以看出，当培养基中激素6-BA浓度为1mg/L、IBA浓度为0.2mg/L时，丛生芽的生长高度虽然略低于培养中激素6-BA浓度为0.2mg/L、IBA浓度为0mg/L的丛生芽，但是丛生芽的增殖系数最大，且粗壮，深绿色，节间长约0.90cm，显著优于其他对比培养基培养的丛生芽。由此可知，对比8的培养基，也即实施例2中的丛生芽培养基诱导丛生芽的效果最好。
对比例3不同激素对生根诱导的影响
将实施例2中的生根诱导培养基中的激素IBA的浓度进行调整，其余不变，得到对比10～11的生根诱导的培养基。利用对比10～11的生根诱导的培养基进行生根诱导，诱导的生根率、平均根长及根的形态如表2所示，诱导生根的情况如图6所示；其中A代表对比10，B代表对比11。
表2对比10～11诱导的生根率、平均根长及根的形态
Figure BDA0003696723010000091
表2显示，当生根诱导培养基中IBA的浓度为1mg/L时，虽然产生的根须较多，但是产生的是气生根，气生根不能运输水分和营养，气生根组培苗是无法存活。由此可知，生根诱导培养基的IBA的浓度为0.5mg/L比较合适，也即实施例2的生根诱导培养基。
实施例3大叶种巴戟天外植体材料预处理
选取成株的、3～4年生的大叶种巴戟天植株，移栽至洁净大棚内，将大叶种巴戟天茎基处的藤茎剪去，每周向植株喷洒10wt％多菌灵溶液一次。一月后长出新的藤茎，将新长出的藤茎作为外植体材料。
将切除叶片的新长出的大叶种巴戟天的藤茎置于超净工作台中，用75％酒精棉片擦拭藤茎表面，然后将藤茎切成带有节位的长度约为2～3cm的茎段。藤茎分为三部分：距离顶端20cm以内的幼嫩茎、距离顶端20～40cm的半木质化茎，距离顶端超过40cm的完全木质化茎。幼嫩茎的茎段用0.05wt％的氯化汞溶液消毒4min 40s，无菌水漂洗三次；半木质化茎及完全木质化茎的茎段用0.05wt％的氯化汞溶液消毒6min 10s，无菌水漂洗三次；处理结束后的茎段用于诱导培养。
实施例4大叶种巴戟天外植体材料预处理
选取成株的、3～4年生的大叶种巴戟天植株，移栽至洁净大棚内，将大叶种巴戟天茎基处的藤茎剪去，每周向植株喷洒10wt％多菌灵溶液一次。一月后长出新的藤茎，将新长出的藤茎作为外植体材料。
将切除叶片的新长出的大叶种巴戟天的藤茎置于超净工作台中，用75％酒精棉片擦拭藤茎表面，然后将藤茎切成带有节位的长度约为2～3cm的茎段。藤茎分为三部分：距离顶端20cm以内的幼嫩茎、距离顶端20～40cm的半木质化茎，距离顶端超过40cm的完全木质化茎。幼嫩茎的茎段用0.15wt％的氯化汞溶液消毒4min 20s，无菌水漂洗三次；半木质化茎及完全木质化茎的茎段用0.15wt％的氯化汞溶液消毒5min 50s，无菌水漂洗三次；处理结束后的茎段用于诱导培养。
实施例5大叶种巴戟天组培苗的培养
1.腋芽诱导培养
同实施例2。
2.丛生芽诱导培养
同实施例2。
3.生根诱导培养
生根诱导培养基：含有浓度为0.2mg/L的吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基，pH为6.0。
将经过丛生芽诱导培养的，高度1.5～2cm的丛生芽切下，接种至生根诱导培养基中，接种后每天光照12小时，光照强度为1200lx，空气温度为25℃，湿度为60％。培养20天后丛生芽长出白色短根，统计其生根率(生根率计算公式同实施例2)，记载根系生长状况，得到组培苗。
组培苗的生根率为100％，生根的组培苗的生长情况如图7所示，结合图7可知，组培苗的白色短根为正常根，根须较少，细弱，平均根长1.2cm。
4.炼苗及移栽
挑选根系生长良好的组培苗移入组培瓶中，保持温度20～25℃、相对湿度60％左右，组培瓶密封置于自然光照条件下，放置2d。然后打开瓶口，自然光下炼苗4d，注意避免阳光直射。将炼苗结束的大叶种巴戟天幼苗从组培瓶中移出，清水洗净根部残留的培养基，将根部浸泡于浓度为2g/L的多菌灵溶液中3min，再用流水冲洗1min。然后将组培苗移栽至草炭土和珍珠岩体积比为1:1.5混匀的栽培基质中，移栽后浇透土壤，随后1～3天浇水一次，每次浇水以土壤表面湿润，盆底不滴水为标准，正常培养。移栽后培养30天后，大叶种巴戟天组培苗的存活率大于90％。
实施例6大叶种巴戟天组培苗的培养
1.腋芽诱导培养
腋芽诱导培养基：含有浓度为0.15mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)的1/2MS培养基，pH为5.5。
将实施例1处理后的茎段于无菌条件下接种至腋芽诱导培养基，接种后每天光照11小时，光照强度为1100lx，空气温度为20℃，湿度为70％，培养20天后长出腋芽。观察并统计腋芽诱导率及腋芽生长情况；
腋芽诱导率(％)＝诱导出了腋芽的外植体数/外植体总数*100。
培养20天左右长出的腋芽芽体健壮，生长状况良好、呈深绿色，腋芽诱导率为80.45％。
2.丛生芽诱导培养
丛生芽诱导培养基：含有浓度为0.8mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、浓度为0.15mg/L的吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基，pH为5.5。
将腋芽诱导培养基培养一个月得到的腋芽从茎段上切下，接种于丛生芽诱导培养基中，接种后每天光照11小时，光照强度为1100lx，空气温度为25℃，湿度为60％。培养30天后，记录丛生芽的增殖系数以及丛生芽生长状况(增殖系数计算公式同实施例2)；得到的丛生芽的增殖系数达1.75，丛生芽芽体健壮，生长良好。
3.生根诱导培养
生根诱导培养基：含有浓度为0.45mg/L的吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基，pH为5.5。
将经过丛生芽诱导培养的，高度1.5～2cm的丛生芽切下，接种至生根诱导培养基中，接种后每天光照11小时，光照强度为1100lx，空气温度为25℃，湿度为60％。培养20天后丛生芽长出白色短根，统计其生根率(生根率计算公式同实施例2)，记载根系生长状况，得到组培苗。
组培苗的生根率为100％，组培苗的白色短根为正常根，根须较少，粗壮。
实施例7大叶种巴戟天组培苗的培养
1.腋芽诱导培养
腋芽诱导培养基：含有浓度为0.25mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)的1/2MS培养基，pH为6.5。
将实施例1处理后的茎段于无菌条件下接种至腋芽诱导培养基，接种后每天光照12小时，光照强度为1200lx，空气温度为25℃，湿度为60％，培养20天后长出腋芽。观察并统计腋芽诱导率及腋芽生长情况；
腋芽诱导率(％)＝诱导出了腋芽的外植体数/外植体总数*100。
培养20天左右长出的腋芽芽体健壮，生长状况良好、呈深绿色，腋芽诱导率为80.65％。
2.丛生芽诱导培养
丛生芽诱导培养基：含有浓度为1.2mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、浓度为0.25mg/L的吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基，pH为6.5。
将腋芽诱导培养基培养一个月得到的腋芽从茎段上切下，接种于丛生芽诱导培养基中，接种后每天光照12小时，光照强度为1200lx，空气温度为25℃，湿度为60％。培养30天后，记录丛生芽的增殖系数以及丛生芽生长状况(增殖系数计算公式同实施例2)；得到的丛生芽的增殖系数达1.85，丛生芽芽体健壮，生长良好。
3.生根诱导培养
生根诱导培养基：含有浓度为0.55mg/L的吲哚-3-丁酸(IBA)的MS培养基，pH为6.5。
将经过丛生芽诱导培养的，高度1.5～2cm的丛生芽切下，接种至生根诱导培养基中，接种后每天光照12小时，光照强度为1200lx，空气温度为25℃，湿度为60％。培养20天后丛生芽长出白色短根，统计其生根率(生根率计算公式同实施例2)，记载根系生长状况，得到组培苗。
组培苗的生根率为100％，组培苗的白色短根为正常根，根须较少，粗壮。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种大叶种巴戟天组培苗快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将新生的大叶种巴戟天藤茎消毒、漂洗，得到外植体；
S2.将步骤S1得到的外植体接种至腋芽诱导培养基，诱导培养得到腋芽；
S3.将步骤S2得到的腋芽接种至丛生芽诱导培养基中，诱导培养得到丛生芽；
S4.将步骤S3得到的丛生芽接种至生根诱导培养基中，诱导培养丛生芽生根，得到大叶种巴戟天组培苗；
步骤S2中，所述腋芽诱导培养基为含有浓度为0.15～0.25mg/L的6-苄基氨基嘌呤的1/2MS培养基，pH为5.5～6.5；
步骤S3中，所述丛生芽诱导培养基为含有浓度为0.8～1.2mg/L的6-苄基氨基嘌呤、浓度为0.15～0.25mg/L的吲哚-3-丁酸的MS培养基，pH为5.5～6.5；
步骤S4中，所述生根诱导培养基为含有浓度为0.2～0.55mg/L的吲哚-3-丁酸的MS培养基，pH为5.5～6.5。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2～S4中，所述诱导培养的条件为：每天光照11～12小时，光照强度为1100～1200lx，空气温度为20～25℃，湿度为60～70％。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中，所述藤茎包括幼嫩茎、半木质化茎及完全木质化茎。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述幼嫩茎的消毒是利用质量百分数0.05～0.15％的氯化汞溶液消毒260～280s；所述半木质化茎及完全木质化茎的消毒是利用质量百分数0.05～0.15％的氯化汞溶液消毒350～370s。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述腋芽诱导培养基为含有浓度为0.2mg/L的6-苄基氨基嘌呤的1/2MS培养基，pH为6.0。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述丛生芽诱导培养基为含有浓度为1mg/L的6-苄基氨基嘌呤、浓度为0.2mg/L的吲哚-3-丁酸的MS培养基，pH为6.0。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S4中，所述生根诱导培养基为含有浓度为0.45～0.5mg/L的吲哚-3-丁酸的MS培养基，pH为6.0。
8.一种培育大叶种巴戟天的方法，其特征在于，利用权利要求1～7所述方法制备得到大叶种巴戟天组培苗，然后对所述大叶种巴戟天组培苗进行炼苗和移栽培养，即得大叶种巴戟天。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述炼苗具体为：将根系生长良好的组培苗移入组培瓶中，保持温度20～25℃，相对湿度55％～65％，组培瓶密封置于自然光照条件下，放置2～3d后打开瓶口，自然光下炼苗4～5d，避免阳光直射。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述移栽具体为：将炼苗结束的大叶种巴戟天组培苗去除培养基后，利用多菌灵溶液灭菌，清洗后移栽至草炭土和珍珠岩体积比1:1～1:1.5混匀的栽培基质中，正常浇水培养。
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