CN116965336A - 一种野生型巴戟天组织培养快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种野生型巴戟天组织培养快速繁殖的方法，以野生型巴戟天幼嫩部分的茎段为原材料，包括以下步骤：首先对外植体消毒：将原材料用0.05%～0.15%氯化汞溶液消毒6～12min，然后将野生型巴戟天外植体接种于诱导培养基、增殖培养基、生根培养基中依次进行培养，得到野生型巴戟天组培苗。本发明的消毒方法和培养基培养适用于野生型巴戟天，污染率低，成活率高，使其生长正常健康，能在在短时间内获得大量优质的野生型巴戟天脱毒幼苗，为野生型巴戟天的再生体系提供了技术依据，为充分挖掘野生型巴戟天优良特性提供了充足材料，同时也为巴戟天品种选育、改良遗传和质量评价奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养类技术，具体地说，涉及到一种野生型巴戟天组织培养快速繁殖的方法。
背景技术
巴戟天为茜草科（Rubiaceae）植物。其干燥根可入药，具有强健筋骨、滋补肾阳、祛风除湿的功效，为四大南药之一。巴戟天具有“药用”及“保健”功效，近年来，随着中医药保健事业的发展，巴戟天作为传统补益类中药也逐渐受到重视。
现有的人工栽培的巴戟天，由于其长期无性繁殖为病毒的累积创造了条件，病害等较多，严重影响了巴戟天药材的产量和质量，直接影响药材品质和疗效。而野生型巴戟天野生资源生长环境复杂，隐蔽性高，经过野外驯化后，具有一些栽培品没有的优良特性，如产量高、有效成分含量高、抗寒、抗病等，是值得保护和培育巴戟天新品种潜在的优良种质资源。
野生种质资源是培育优质高产的农作物和中药材的物质基础，是确保食品和药物安全的重要环节。野生种质资源中包含了物种长期进化过程中形成性状的各种原因，既是药用植物育种的物质基础，也是研究分析药用植物起源、进化、分类、遗传的基础材料。在保护认识不足、管理体系不健全、生态环境的恶化及耕作模式改变等因素的影响下，野生种质资源处于自生自灭状态，且多数品种正逐渐濒危，给中药及农作物生产安全带来无法弥补的损失。因此，需加强对野生种质资源的安全保护与研究，防止物种遗传基因消失。
组织培养技术是获得优质种苗的主要方法，通过组织培养可获得脱毒种苗进行复壮以提高种苗的质量。由于野生型巴戟天的生长环境较为复杂，其中含有的内生菌以及生长条件与其他栽培巴戟天有很大的不同，因此野生型巴戟天组织培养体系极其难以建立。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种野生型巴戟天组织培养快速繁殖的方法。
本发明所采取的技术方案是：
第一个方面，本发明提供一种野生型巴戟天组织培养快速繁殖的方法，以野生型巴戟天幼嫩部分的茎段为原材料，包括以下步骤：
1) 外植体消毒：将原材料用0.05%～0.15%氯化汞溶液消毒6～12min，然后漂洗得到野生型巴戟天外植体；
2) 腋芽诱导：将野生型巴戟天外植体接种于诱导培养基中培养，得到野生型巴戟天腋芽；
3) 腋芽增殖：将野生型巴戟天腋芽接种于增殖培养基中，得到野生型巴戟天丛生芽苗；
4) 诱导生根：将野生型巴戟天丛生芽苗接种于生根培养基中，得到野生型巴戟天组培苗；
步骤2）中的诱导培养基为含有1.4～1.6 mg/L的6-BA和含有0.18～0.22 mg/L的IBA的MS培养基；
步骤3）中的增殖培养基为含有1.4～1.6 mg/L的6-BA和含有0.18～0.22 mg/L的IBA的MS培养基；
步骤4）中的生根培养基为含有0.18～0.22 mg/L的IBA的MS培养基。
在一些实例中，所述步骤1）中的消毒方法为：将原材料用0.1%氯化汞溶液消毒8min。
在一些实例中，所述步骤2）中的诱导培养基为含有1.5 mg/L的6-BA和含有0.2mg/L的IBA的MS培养基。
在一些实例中，所述步骤3）中的增殖培养基为含有1.5 mg/L的6-BA和含有0.2mg/L的IBA的MS培养基。
在一些实例中，所述步骤4）中的生根培养基为含有0.2 mg/L的IBA的MS培养基。
第二个方面，本发明提供一种培育野生型巴戟天的方法，利用第一个方面所述的方法制备得到的野生型巴戟天组培苗进行炼苗和移栽培养，即得野生型巴戟天。
在一些实例中，所述移栽培养中，野生型巴戟天组培苗移栽之后，需要先避免阳光直射培养15～20天。
在一些实例中，所述炼苗操作具体为：将根系生长良好的组培苗移入组培瓶中，保持温度20～25℃，相对湿度55％～65％，组培瓶密封置于自然光照条件下，放置3～4d后打开瓶口，自然光下炼苗3～4d，避免阳光直射。
在一些实例中，所述移栽培养具体为：将炼苗结束的野生型巴戟天组培苗去除培养基后，灭菌清洗后移栽至泥炭土和珍珠岩体积比1.5:1～2.5:1混匀的栽培基质中，先避免阳光直射培养15～20天，之后正常浇水培养。
在一些实例中，所述泥炭土和珍珠岩体积比为2:1。
本发明的有益效果是：
本发明的消毒方法和培养基培养适用于野生型巴戟天，污染率低，成活率高，使其生长正常健康，而且本发明以直接器官发生途径为主，以茎段诱导腋芽，通过生根、炼苗及移栽等一系列过程获得野生型巴戟天的离体再生植株，能在在短时间内获得大量优质的野生型巴戟天脱毒幼苗，为野生型巴戟天的再生体系提供了技术依据，为充分挖掘野生型巴戟天优良特性提供了充足材料，同时也为巴戟天品种选育、改良遗传和质量评价奠定了基础。
附图说明
图1为野生型巴戟天植株图。
图2为野生型巴戟天移栽第1天情况图，其中A、B、C为正视图，D、E、F为俯视图。
图3为野生型巴戟天移栽第30天情况图，其中A、B、C为正视图，D、E、F为俯视图。
图4为不同消毒处理对野生型巴戟天外植体茎段的影响中野生型巴戟天染菌组培苗消毒污染情况图，其中，A为2%次氯酸20min；B为2%次氯酸钠27min；C为2%次氯酸钠30min；D为2%次氯酸钠33min；E为2%次氯酸钠35min。
图5为不同消毒处理对野生型巴戟天外植体茎段的影响中野生型巴戟天染菌组培苗消毒污染情况图，其中，A为0.1%氯化汞6min；B为0.1%氯化汞8min；C为0.1%氯化汞10min；D为0.1%氯化汞12min。
图6为诱导培养基中植物生长调节剂对野生型巴戟天茎段诱导腋芽的影响中野生型巴戟天完全消毒茎段腋芽诱导生长情况图。其中，A、B、C均为野生型巴戟天完全消毒茎段在1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA的MS培养基中培养30天；
图7为诱导培养基中植物生长调节剂对野生型巴戟天茎段诱导腋芽的影响中野生型巴戟天完全消毒茎段腋芽诱导生长情况图。其中A、B为野生型巴戟天完全消毒茎段在3.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的MS培养基中培养1天；C、D为野生型巴戟天完全消毒茎段在3.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的MS培养基中培养8天。
图8为诱导培养基中植物生长调节剂对野生型巴戟天茎段诱导腋芽的影响中野生型巴戟天完全消毒茎段腋芽诱导生长情况图。其中A、B为野生型巴戟天完全消毒茎段在5.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的MS培养基中培养1天；C、D为野生型巴戟天完全消毒茎段在5.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的MS培养基中培养8天。
图9为增殖培养基中植物生长调节剂对野生型巴戟天腋芽生长的影响中野生型巴戟天腋芽增殖情况图。其中A为野生型巴戟天腋芽在添加了1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA的MS培养基中培养1天；B为野生型巴戟天腋芽在添加了1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA的MS培养基中培养24天；
图10为增殖培养基中植物生长调节剂对野生型巴戟天腋芽生长的影响中野生型巴戟天腋芽增殖情况图。其中，A为野生型巴戟天腋芽在添加了2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA的MS培养基中培养1天；B为野生型巴戟天腋芽在添加了2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的MS培养基中培养29天
图11为生根培养基中植物生长调节剂对不同巴戟天生根的影响中野生型巴戟天芽苗的生根情况图。其中，A为野生型巴戟天在添加了0.2 mg/L IBA的MS培养基中的生根情况；B为野生型巴戟天在添加了0.5 mg/L IBA的MS培养基中的生根情况；C为野生型巴戟天在添加了1.0mg/L IBA的MS培养基中的生根情况。
图12为对比例1培养的巴戟天芽苗的植株图。其中A图为大叶型巴戟天，B图为小叶型巴戟天，C图为野生型巴戟天，D图为野生型巴戟天在该培养基中出现内生菌外溢现象。
具体实施方式
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。
本发明实验材料为：
野生型巴戟天植株收集自广西壮族自治区防城港市防城区那梭镇东山村水尾组，移栽至华南植物园种质资源圃，移栽后割去原有藤茎，待其在洁净大棚内长出新藤后采集。经广州中医药大学丁平研究员鉴定为茜草科植物巴戟天Morinda officinalisHow的植株。
本发明中培养基的配制如下：
培养基类型为 MS基本培养基（配方见表1），调 pH 值到 5.8-6.0 之间，分装，121℃，20min，高压灭菌备用。
表1、MS培养基配方
a：1/2MS 培养基大量元素浓度为 50 mL/L，其余与 MS培养基一致。
组织培养母液配制方法说明：
（1）大量元素溶液的配制：精密称取硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙适量，超纯水定容，制成含硝酸钾 19g/L、硝酸铵 1.65g/L、磷酸二氢钠 1.7g/L、硫酸镁1.8g/L 、氯化钙 3.3g/L 的大量元素溶液。
（2）铁元素溶液的配制：精密称取硫酸亚铁及乙二胺四乙酸二钠适量，超纯水定容，制成含硫酸亚铁 2.785 g/L、乙二胺四乙酸二钠 3.725 g/L 的铁元素溶液。
（3）微量元素溶液的配制：精密称取碘化钾、硼酸、硫酸锰，硫酸锌、硼酸钠、硫酸铜、氯化钴适量，超纯水定容，制成含碘化钾 0.86 g/L、硼酸 6.2 g/L、硫酸锰 17.08 g/L，硫酸锌8.6 g/L、硼酸钠 0.25 g/L、硫酸铜 0.025 g/L、氯化钴 0.025 g/L的微量元素溶液。
（4）维生素溶液的配制：精密称取维生素B1、维生素B6、PP烟酸适量，超纯水定容，制成含维生素B1 0.5 g/L、维生素B6 0.5 g/L、PP烟酸5g/L的微量元素溶液。
（5）甘氨酸溶液的配制：精密甘氨酸适量，超纯水定容，制成含甘氨酸 2g/L 的甘氨酸溶液。
（6）肌醇溶液的配制：精密肌醇适量，超纯水定容，制成含肌醇25g/L 的肌醇溶液。
实施例1
1. 野生型巴戟天外植体材料预处理
野生型巴戟天植株（图1）移栽至洁净大棚内，从茎基处剪去藤茎，每周向植物喷洒10%多菌灵溶液一次。待一月后长出新的藤茎作为外植体材料。
2. 野生型巴戟天外植体茎段的消毒
取样品，将野生型巴戟天茎切除叶片后置于超净工作台中，用75%酒精棉片擦拭其表面，切成带有节位的长度约为 2～3cm 的茎段；距离顶端 20cm 以内为幼嫩部位，取距离藤茎顶端 20～40cm处的半木质化茎段，距离顶端超过 40cm 的部位为完全木质化茎段；因野生巴戟天生长缓慢，因此以幼嫩部位的茎段为材料。
将野生型巴戟天外植体切除叶片，转移到超净工作台中，用75%酒精棉片，擦拭其表面，用无菌水冲洗3次，之后用0.1%氯化汞浸泡8min，后用无菌水冲洗3次，处理完后，于无菌条件下接种至MS培养基中，一瓶接种一个茎段，于接种第二天开始记录污染数，15天后统计污染率和成活率。
污染率=（污染苗数/接种苗数）×100%
成活率=（成活苗数/接种苗数）×100%
3. 野生型巴戟天外植体的腋芽诱导
处理完后，于无菌条件下接种于诱导培养基，该培养基为含有1.5 mg/L的6-BA和含有0.2 mg/L的IBA的MS培养基，观察并统计腋芽诱导率(诱导出了腋芽的外植体数/外植体总数)及腋芽生长情况。
4. 野生型巴戟天茎段腋芽增殖
将培养一个月的野生型巴戟天诱导出的腋芽（长至1cm左右）从茎段上切下，接种于增殖培养基，该培养基为含有1.5 mg/L的6-BA和含有0.2 mg/L的IBA的MS培养基中，培养30 天后观察结果。记录增殖系数（（接种30天芽苗高度–接种第一天芽苗高度）/天数），以及芽苗生长状况。
5. 野生型巴戟天的诱导生根
将培养一个月，诱导出 1.5 cm 左右高的丛生芽苗上切下，接种于生根培养基，该培养基为含有0.2 mg/L的IBA的MS培养基，每瓶1个芽苗，在培养室中培养 30 天后，统计其生根率和根系生长状况。
6. 野生型巴戟天的炼苗及移栽
挑选根系生长良好的组培苗移出培养室，保持温度20～25℃、相对湿度60%左右，闭盖置于室温自然光条件下放置3d。然后半打开瓶口，自然光下炼苗3 d，注意避免阳光直射。将炼苗结束的野生型巴戟天幼苗从组培瓶中移出，清水洗净根部残留的培养基，将根部浸泡于稀释的多菌灵溶液中3min，再用流水冲洗1min。处理后移栽至泥炭土和珍珠岩比例为2：1的栽培基质中，移栽后浇透土壤，移栽之后因野生型巴戟天苗较弱，以此用黑色遮阳网或者塑料薄膜覆盖在上面，避免阳光直射造成巴戟天苗快速脱水死亡，覆盖15～20天后，可以去掉黑色遮阳网或者塑料薄膜。随后按正常1-2天浇水一次。培养30天后，统计野生型巴戟天炼苗移栽情况。
如图2和图3所示，用了黑色遮阳网或者塑料薄膜覆盖15天之后，野生型巴戟天的存活率大大提升，培养30天后，野生型巴戟天组培苗的存活率大于90%。
不同消毒处理对野生型巴戟天外植体茎段的影响
将实施例1中的消毒处理方式进行变更，不同处理方法的污染率及成活率见表2，野生型巴戟天组培苗消毒情况见图4、图5。
表2、不同消毒处理对野生型巴戟天外植体茎段的影响
由表2可知，不同消毒处理对巴戟天茎段的污染率及成活率均有一定的影响。就单个指标而言，实施例1中采用0.1%氯化汞浸泡8min污染率最低，为20.00%，而用2%次氯酸钠浸泡20min、27min、30min、33min污染率最高，为100.00%；用2%次氯酸钠消毒20min-35min，其消毒效果都较差，成活率也较低，而随着使用0.12%氯化汞的消毒时间延长，其污染率逐渐降低，但其成活率也逐渐降低。而次氯酸钠的消毒效果较氯化汞的低，综合污染率及成活率两个指标，0.1%氯化汞浸泡8min为野生型巴戟天外植体茎段消毒的最佳方法。
诱导培养基中植物生长调节剂对野生型巴戟天茎段诱导腋芽的影响
将实施例1的步骤3中使用的诱导培养基中的植物生长调节剂进行替换，比较完全消毒的野生型巴戟天茎段在3种不同植物生长调节剂中的腋芽诱导率及其生长状况，结果见表3，利用完全消毒的野生型巴戟天茎段诱导腋芽在不同类型培养基中的生长情况见图6～图8。
表3、野生型巴戟天完全消毒茎段在不同类型培养基中诱导腋芽情况
比较野生型巴戟天完全消毒茎段诱导腋芽在3种不同类型培养基中的生长状况，结果见表 3。由表3可得，实施例1中采用以野生型巴戟天完全消毒茎段为材料，放入含有6-BA 1.5mg/L和IBA 0.2mg/L的MS培养基中，茎段的节点处与7～10天开始萌芽，长出腋芽，腋芽生长状况良好，芽体健壮腋芽诱导率为100%(图6)；以野生型巴戟天完全消毒茎段为材料，放入含有 6-BA 3.0mg/L+0.2 mg/L NAA的MS 培养基中，茎段的节点处与10～15天长出腋芽，腋芽生长状况良好，腋芽诱导率为0.40%（图7）；野生型巴戟天完全消毒茎段诱导腋芽在添加了5.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的MS 培养基中生长状况不佳，芽苗瘦弱（图8）。
增殖培养基中植物生长调节剂对野生型巴戟天腋芽生长的影响
将实施例1的步骤4中使用的增殖培养基的植物生长调节剂进行替换，对野生型巴戟天腋芽在不同类型的增殖培养基中生长状况进行统计，结果见表4，腋芽增殖情况见图9，图10。
表4、野生型巴戟天腋芽增殖情况
由表4可得，实施例1中采用以野生型巴戟天腋芽为材料进行诱导增殖，以添加了1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA的MS培养基最佳，其增值系数最高为1.36cm，且生长状况良好。
生根培养基中植物生长调节剂对不同巴戟天生根的影响
将实施例1的步骤5中使用的生根培养基中的植物生长调节剂进行替换，统计野生型芽苗移入不同类型培养基的诱导生根率及生根情况，结果见表5，芽苗生根情况见图11。
表5野生型巴戟天芽苗的生根培养情况
由表5可知，野生型巴戟天在3种添加了不同浓度的IBA的生根培养中的生根情况有明显的差异，实施例1中的野生型巴戟天在添加了0.2mg/L IBA的培养基中的生根率为100.00%，且根较为粗壮，因此野生型巴戟天的最佳生根培养基为MS+0.2mg/L IBA。
对比例1
在本发明之前已经建立了大叶型巴戟天组织培养体系，参考申请人在先的申请CN115024221A（一种大叶种巴戟天组培苗快速繁殖的方法及其应用），采用该发明的培养条件对野生型巴戟天进行培养。
从图12中的D图中可以看出，野生型巴戟天组培苗生长缓慢甚至不长的现象，甚至出现了野生型巴戟天内生菌外溢的现象，说明大叶型以及其他巴戟天的培养基不适用于野生型巴戟天组培苗。
表6.野生型等3种巴戟天生长47天情况对比
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种野生型巴戟天组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，以野生型巴戟天幼嫩部分的茎段为原材料，包括以下步骤：
外植体消毒：将原材料用0.05%～0.15%氯化汞溶液消毒6～12min，然后漂洗得到野生型巴戟天外植体；
腋芽诱导：将野生型巴戟天外植体接种于诱导培养基中培养，得到野生型巴戟天腋芽；
腋芽增殖：将野生型巴戟天腋芽接种于增殖培养基中，得到野生型巴戟天丛生芽苗；
诱导生根：将野生型巴戟天丛生芽苗接种于生根培养基中，得到野生型巴戟天组培苗；
步骤2）中的诱导培养基为含有1.4～1.6 mg/L的6-BA和含有0.18～0.22 mg/L的IBA的MS培养基；
步骤3）中的增殖培养基为含有1.4～1.6 mg/L的6-BA和含有0.18～0.22 mg/L的IBA的MS培养基；
步骤4）中的生根培养基为含有0.18～0.22 mg/L的IBA的MS培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中的消毒方法为：将原材料用0.1%氯化汞溶液消毒8min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中的诱导培养基为含有1.5mg/L的6-BA和含有0.2 mg/L的IBA的MS培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中的增殖培养基为含有1.5mg/L的6-BA和含有0.2 mg/L的IBA的MS培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4）中的生根培养基为含有0.2mg/L的IBA的MS培养基。
6.一种培育野生型巴戟天的方法，其特征在于，利用权利要求1～5任一项所述的方法制备得到的野生型巴戟天组培苗进行炼苗和移栽培养，即得野生型巴戟天。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述移栽培养中，野生型巴戟天组培苗移栽之后，需要先避免阳光直射培养15～20天。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述炼苗操作具体为：将根系生长良好的组培苗移入组培瓶中，保持温度20～25℃，相对湿度55％～65％，组培瓶密封置于自然光照条件下，放置3～4d后打开瓶口，自然光下炼苗3～4d，避免阳光直射。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述移栽培养具体为：将炼苗结束的野生型巴戟天组培苗去除培养基后，灭菌清洗后移栽至泥炭土和珍珠岩体积比1.5:1～2.5:1混匀的栽培基质中，先避免阳光直射培养15～20天，之后正常浇水培养。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述泥炭土和珍珠岩体积比为2:1。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090131937A (ko) * | 2008-06-19 | 2009-12-30 | 충북대학교 산학협력단 | 모린다 속 식물 부정근의 배양방법 |
| KR20120009620A (ko) * | 2010-07-19 | 2012-02-02 | 농업회사법인 주식회사 씨비엔플랜텍 | 모린다 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량을 증대시키는 방법 |
| CN104041417A (zh) * | 2014-07-10 | 2014-09-17 | 黄振忠 | 一种巴戟天组织培养育苗方法 |
| CN112931224A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-06-11 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 巴戟天的组织培养方法 |
| CN115024221A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-09-09 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一种大叶种巴戟天组培苗快速繁殖的方法及其应用 |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090131937A (ko) * | 2008-06-19 | 2009-12-30 | 충북대학교 산학협력단 | 모린다 속 식물 부정근의 배양방법 |
| KR20120009620A (ko) * | 2010-07-19 | 2012-02-02 | 농업회사법인 주식회사 씨비엔플랜텍 | 모린다 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성물질 함량을 증대시키는 방법 |
| CN104041417A (zh) * | 2014-07-10 | 2014-09-17 | 黄振忠 | 一种巴戟天组织培养育苗方法 |
| CN112931224A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-06-11 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 巴戟天的组织培养方法 |
| CN115024221A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-09-09 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一种大叶种巴戟天组培苗快速繁殖的方法及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 张敏: "巴戟天优良材料筛选与组培快繁技术", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑, no. 04, pages 047 - 268 * |
| 陈雄庭等: "海巴戟天的离体快速繁殖(简报)", 热带作物学报, vol. 28, no. 04, pages 44 - 46 * |
| 黄宁珍等: "巴戟天组织培养和快速繁殖研究", 广西植物, vol. 27, no. 01, pages 127 - 131 * |
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