CN110896842B - 一种柑桔脱毒黄化砧木的高效培育方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业种植技术领域，尤其涉及一种柑桔脱毒黄化砧木的高效培育方法及其应用。方法主要包括：将新鲜果实中枳壳种子取出，在45℃温水浸泡，自然冷却，种子继续在200mg/L的聚‑γ‑谷氨酸(PGA)中浸泡8小时。然后，撕开外种皮(无须去除外种皮)，将种子播种到含有1/2垤石和1/2沙的培养基质中，在培养钵中26℃，黑暗条件下培养2周，培育出的黄化砧木整齐一致，粗度达2‑3mm，黄化砧木经严格的消毒，被方便地用于柑桔茎尖微芽嫁接脱毒。本发明的黄化砧木的准备程序与传统的无菌条件培养砧木相比，具有操作简单，节省时间，降低劳动强度，降低成本，节省能源的优点。

Description

一种柑桔脱毒黄化砧木的高效培育方法及其应用

技术领域

本发明属于农业种植技术领域，尤其涉及一种柑桔脱毒黄化砧木的高效培育方法及其应用。

背景技术

柑桔是全世界的大宗水果，柑桔黄龙病和其它病毒病对柑桔生产造成毁灭性的打击。无病毒苗木的生产成为柑桔产业健康发展的必经之路。

由于病毒类病害的系统侵染性，目前尚无有效的治疗方法，采用柑桔无病毒苗木是控制柑桔病毒病传播，促进柑桔生产可持续发展非常重要的措施之一。当前世界各国预防柑桔病毒类病害的通行做法是采用茎尖嫁接或热处理加茎尖嫁接方式对病毒进行脱除，然后栽种无病毒苗木。但目前，柑桔脱毒操作技术要求高，操作环节复杂，获得无病毒素苗木十分困难。

如申请号为CN201410132037.X，名称为《柑桔接穗预处理促使复合感染病原脱除的技术》的中国发明专利，是本申请的发明人早前研发的通过小分子杀细菌三氯生(TCL)及几种抗生素处理，获得脱除柑桔衰退病(CTV)和柑桔黄龙病(HLB)病原的无病毒茎尖材料。为茎尖微芽嫁接或嫩芽嫁接提供了病原浓度低或无病毒的茎尖材料。

申请号为CN201510896416.0，名称为《一种高效脱除柑橘碎叶病毒的方法》的中国发明专利，通过将感染了柑橘碎叶病毒的柑橘植株采用脉冲温度进行热处理，解决了传统高温热处理柑桔植株不能正常生长，导致植株热伤害，萌发无毒化嫩芽数量少的问题，从而促进萌发更多数量的无毒化嫩芽茎尖。

上述两篇现有技术主要是提供无毒茎尖材料，而茎尖嫁接中的黄化砧木的培养通常采用组织培养无菌操作，准备工作繁琐，工作量大，技术要求高。

申请号为CN201711375148.3，名称为《一种生物控制剂在脱除柑橘幼树黄龙病病原中的应用》的中国发明专利，是本申请的发明人早前针对柑橘幼树黄龙病病原去除研发的相关技术，主要通过对苗木喷施特定芽孢杆菌菌株的发酵液来降低茎尖带毒浓度，从而提高脱毒效率。

但是，上述方法仅是解决了苗木上黄龙病病原去除的问题，而在茎尖嫁接中的黄化砧木准备过程中依然存在着准备工作十分繁琐，劳动强度大，成本高，技术要求高，人员素质要求高等问题，从而影响出苗效率及后续脱毒工作。因此，在柑桔茎尖嫁接脱毒操作中，简化黄化砧木的培育程序至关重要。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种柑桔脱毒黄化砧木的高效培育方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种柑桔脱毒黄化砧木的高效培育方法，包括：将新鲜果实中枳壳种子取出，在45℃温水浸泡后，自然冷却；之后继续在200mg/L的聚-γ-谷氨酸中浸泡；然后，撕开外种皮，将种子播种到由垤石和沙组成的培养基质中，在培养钵中26℃，黑暗条件下培养，培育出黄化砧木。培育出的黄化砧木整齐一致，粗度达2-3mm，黄化砧木经严格的消毒，被方便地用于柑桔茎尖微芽嫁接脱毒。

进一步地，所述聚-γ-谷氨酸的浓度为200mg/L。

进一步地，在聚-γ-谷氨酸中浸泡时间为8小时。

进一步地，在撕开外种皮后无需去除外种皮和内种皮。

进一步地，培养基中所述垤石和沙的比例为1：1。

进一步地，黑暗条件下的培养时间为2周。

如上述的一种柑桔脱毒黄化砧木的高效培育方法在培育柑桔脱毒黄化砧木中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

黄化砧木准备的轻简化技术与常规方法相比，具有下列优点：

(1)传统方法需要准备固体MT培养基，如果用50升全自动高温高压高压灭菌锅灭菌，一次可以灭2升固体或液体培养基，加上无菌水和配套的容器，培养皿，滤纸等准备工作，需要花3.5-4小时灭菌。在砧木准备过程中，轻简化黄化砧木培育方法无需这个高温高压灭菌过程。

(2)通常，在无菌操作时，每支试管中适合播种2-3粒/支种子，以100支试管计算，可以播种200-300粒种子。彻底剥去内种皮和外种皮，加上接种需要时间约8-10小时。轻简化黄化砧木准备方法对200-300粒种子撕开外种皮的工作需要时间约3小时。

(3)传统的微芽嫁接砧木准备时，需要将种子的外种皮和内种皮彻底清理干净，才能进行接种。而改进后的方法不需要将外种皮和内种皮都去除干净，只需要将种子吸涨水分之后，将外种皮破开，不需要去掉，加上聚-γ-谷氨酸(PGA)处理，可以促进黄龙苗的健壮生长，这样，节省了约3倍的操作时间，不需要在超净工作台上消毒后再播种，可以直接播种。通过比较，可知，用传统的无菌条件下去掉外种皮和内种皮，每小时可播种20-30粒/小时，改成撕破外种皮后，无需无菌条件，直接播种，1小时内可以准备好100粒种子。且出苗木质量好，整齐一致。只要严格地把控好消毒步骤，就能充分发挥黄化砧木准备的轻简化技术的优势。

该黄化砧木的准备程序与传统的无菌条件培养砧木相比，具有操作简单，节省时间，降低劳动强度，降低成本，节省能源的优点。茎尖嫁接的原理是茎尖分生组织病毒浓度低或不带病毒；也可能是由于茎尖的疏导组织未形成，植物病毒在植物体内的分布是不均匀的，在受侵染的植物体内，一定大小的顶端分生组织是无毒或只带有浓度很低的病毒，在较老的组织中病毒数量随着与茎尖距离的加大而增加。通常情况下，用于培养黄化砧木的种子是不带毒的。但砧木的生长状况，如：砧木粗度会直接影响到茎尖嫁接的成活率。PGA是一种绿色环保、无毒、水溶性多肽，对苗木的生长具有明显的促进效果，使用PGA后，黄化苗木粗壮，整齐，直径达2-3mm,也有利于提高后续茎尖微芽嫁接的成活率。由于木本植物茎尖培养难以生根，利用率茎尖培育无病毒苗木必须要准备砧木，用于微芽嫁接。

严格控制好砧木的消毒操作，就能简化砧木准备的操作程序，大大提高工作效率。这项黄化砧木的改进技术，对于国外引进的柑桔优良品种母本及地方优良品种母本的脱毒，加快柑桔无病毒苗木的生产有着重要的指导意义，对于柑橘产业的可持续发展具有重要的现实意义。

表1 黄化砧木培育方法和后续嫁接效果的比较

*注：由于枳壳砧木与接穗品种的亲合力存在差异，茎尖微芽嫁接后茎尖保持绿色的百分率存在差异。如：南丰蜜桔22-9/枳壳，第6天绿色茎尖达45％，甜柚/枳壳第6天绿色茎尖达5％，无菌条件和有菌条件下获得的黄化砧木均可以用于柑桔的脱毒操作。

附图说明

图1是改进后的黄化砧培育方法与传统黄化砧无菌培养的过程比较。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种柑桔脱毒黄化砧木的高效培育方法及其应用，本发明的研究内容受国家自然科学基金项目(NO.31872064)，国家重大科技研发计划(2018YFD0201500)和(2019YFD1001800)资助。具体方法如下实施例所示。

实施例1本发明改进后的轻简化的黄化砧木的准备

黄化砧木的准备流程见图1中的a-g所示，具体过程描述如下：

(1)将1/2垤石和1/2沙混合，用作种子培养的基质，浇水使基质湿透，待用。

(2)从新鲜的枳壳果实中取出种子，用5％的NaoH去果胶，再用自来水将种子清洗干净，然后，种子在45℃温水中浸泡，自然冷却。种子继续在200mg/L的聚-γ-谷氨酸(PGA)中浸泡8小时。

(3)将外种皮撕开，不需要完全去掉外种皮和内种皮。将种子直接播种于基质中。在一个高30cmx直径28cm的黑色培养钵中，一次可以播种60－80粒种子。用黑色塑料袋遮光或用培养钵倒扣遮光，用黑色塑料膜遮住孔避光。种子在26℃培养2周，这时，黄化苗木出苗整齐一致，且一次培养的黄化苗木数量多，获得大约成活率达98％的黄化砧木，幼苗干径达到2-3mm。

(4)将黄化砧木取出，摘去叶子，用适量的中性洗涤剂浸泡3min，再用自来水冲洗15分钟，黄化苗置于超净工作台上。

(5)切去过长的根部，保留根长约4-5cm长，切去多余部分主干，保留胚轴约3-4cm。

后续的消毒操作程序是：先用70％的酒精浸泡3分钟，然后，用无菌水洗一次，再按体积比(取次氯酸钠4ml(有效成分20％)，加无菌水96ml,以v/v＝4ml/96ml比例配制漂白水消毒剂，消毒剂中加入1滴吐温，吐温起展着剂的作用，使消毒更彻底。黄化苗置于大烧杯中，将黄化苗浸入漂白水消毒剂浸泡20min-25min，边浸泡边搅动，然后，用无菌水洗4-5次，用无菌水浸泡，待微芽嫁接用。

实施例2茎尖微芽嫁接和试管苗的移栽

具体流程见图1中的h-i所示，具体过程描述如下：

(1)取1-3cm长的幼嫩茎尖，在自来水中洗干净，用70％酒精浸5秒钟，再用体积比v/v＝2ml/98ml的次氯酸钠消毒5min,然后，用无菌水清洗4-5次，待微芽嫁接用。

(2)事先准备好的MT液体培养基。试管中加入了滤纸桥，为后续嫁接苗提供支撑。

(3)取1-3cm长的茎尖，在双目实体显微镜下，取大小为0.15mm大小的茎尖进行茎尖微芽嫁接。将含有2-3个叶原基和一个生长点的茎尖嫁接到梯形切口上，形成层与横切面吻合，嫁接苗木植于滤纸桥上，小苗放入液体培养基中，在26℃，光照强度为4000-8000lux条件下培养。

(4)在26℃，光照条件下培养，第6-12天时可以判断芽是保持绿色还是发生了褐变。如果嫁接成活，培养二周时的茎尖将保持绿色，在茎尖与砧木之间形成层部位愈伤组织逐渐形成。如果嫁接未成活，茎尖在第3-6天将变成褐色。

(6)如果嫁接成活，待芽长出2-3片叶时，进行试管苗的锻炼和移栽。

对比传统黄化砧木的准备过程

传统的砧木脱毒操作均是在无菌条件下进行，流程见图1中的m-q。具体过程如下：

(1)播种前要准备MT固体培养基，培养基经高温高压灭菌，待用。

(2)从新鲜的枳壳果实中取枳壳种子，用5％的NaoH揉洗去表面的果胶，再用自来水清洗干净。

(3)种子先用70％的酒精浸泡5min，然后，用无菌水洗一次，再按体积比，v/v＝4ml/96ml比例配制漂白水消毒剂，即：次氯酸钠4ml(有效成分占20％)，加无菌水96ml,在无菌的大烧杯中加入1滴吐温，加95％的1ml洒精溶解吐温，吐温起展着剂的作用，使消毒更为彻底。将枳壳种子浸入漂白水消毒剂中，浸泡10min-15min，边浸泡边搅动，再用无菌水清洗4-5次。

(4)在超净工作台上，将种子的外种皮和内种皮彻底剥开，并去除干净，再进行接种。每支试管接种2－3粒。

(5)播种后，装有种子的试管在26℃，黑暗条件下培养箱中进行培养，培养至14天时，黄化砧木可以用于茎尖微芽嫁接。茎尖微芽嫁接和试管苗的移栽过程同实施例2。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种柑桔脱毒黄化砧木的高效培育方法，其特征在于，包括：将新鲜果实中枳壳种子取出，在45℃温水浸泡后，自然冷却；之后继续在聚-γ-谷氨酸中浸泡，所述聚-γ-谷氨酸的浓度为200mg/L，在聚-γ-谷氨酸中浸泡时间为8小时；然后，撕开外种皮，在撕开外种皮后无需去除外种皮，将种子播种到由垤石和沙组成的培养基质中，培养基质中所述垤石和沙的比例为1：1；在培养钵中26℃，黑暗条件下培养，黑暗条件下的培养时间为2周；培育出黄化砧木。

2.如权利要求1所述的一种柑桔脱毒黄化砧木的高效培育方法在培育柑桔脱毒黄化砧木中的应用。

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