CN109777764A - 一种香橼叶肉原生质体的分离方法 - Google Patents

一种香橼叶肉原生质体的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种香橼叶肉原生质体的分离方法，包括以下步骤：取香橼实生苗的幼嫩叶片进行预质壁分离处理、酶解、加入CPW洗液纯化，即可收集得到纯化后的原生质体沉淀。本发明可获得高活性、高产量的原生质体，为开展香橼原生质体胞融合、遗传转化等研究提供实验材料，为香橼实生选种提供新途径。

Description

一种香橼叶肉原生质体的分离方法
技术领域
本发明属于植物繁殖技术领域，具体涉及一种香橼叶肉原生质体的分离方法。
背景技术
香橼（Citrus medica L.）是芸香科柑橘属果树，具有丰富的营养和药用价值。香橼种子是单胚性种子，通过授粉受精发育成有性胚，实生播种后，每一个单株都是杂种，变异类型丰富。因此，用香橼种子播种可以用来开展实生选种，而且种子一般不带病毒。
植物原生质体是指去除细胞壁以后裸露的、由细胞膜包被的单个细胞。原生质体融合可克服远缘杂交亲和性差的困难，用于远缘杂交；由于没有细胞壁，且具有全能性，原生质体能用于细胞无性系变异以及突变体的筛选；原生质体再生植株也是一种种苗培育途径。
关于柑橘原生质体的研究很多，但是以香橼为材料的研究尚未有报道。本发明以香橼实生苗的叶片为材料，建立了叶肉原生质体的分离方法，为香橼通过体细胞融合培育新品种奠定基础，也为香橼实生选种提供了一种新途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种香橼叶肉原生质体的分离方法，其可获得高活性、高产量的原生质体，为开展香橼原生质体胞融合、遗传转化等研究提供实验材料，为香橼实生选种提供新途径。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种香橼叶肉原生质体的分离方法，其包括以下步骤：
（1）实生苗获得：选择充分成熟、无病虫害的果实，取出种子，用50℃热水浸种30min，再用冷水浸泡12h，然后用300倍的40%福尔马林浸种1～2h，捞出，晾干至种子手摸不发黏，立即播种；通常播种的种子数量为所需种苗数量的1.5～2倍；播种时采用腐熟的有机肥作基肥，与土质疏松的沙壤土一起搅拌均匀，使得土壤最终的pH为5.5～6.0；整畦开沟，均匀播种，然后先覆盖一层1cm的薄土，适量喷水至土壤手捏成团、不沾手即可，再覆盖一层稻草保湿，播种深度为2cm；
（2）叶片处理：取刚展开的实生苗幼嫩叶片，用蒸馏水洗净，晾干，暗处理1天；去除主脉，切成宽1mm的细条；
（3）预质壁分离：将切好的细条置于5wt%甘露醇溶液中浸泡1h；
（4）酶解：将于甘露醇溶液中浸泡后的细条置于酶解液中，在25℃、黑暗条件下于40 r/min的摇床上酶解2～3h；所述酶解液的配方成分为：5wt%甘露醇+1.5wt%离析酶R-10+1.5wt% 纤维素酶R-10；
（5）纯化：酶解后将溶液用孔径425μm的滤网过滤，滤液以500 r/min离心10min，去除上清液，用13%CPW洗液将沉淀的原生质体小球悬浮，离心5min，用吸管收集下层原生质体；所述13%CPW洗液配方成分为：27.2 mg/L碳酸二氢钾+101.0 mg/L硝酸钾+1480.0 mg/L二水合氯化钙+246.0 mg/L七水合硫酸镁+0.16 mg/L碘化钾+0.025 mg/L五水合硫酸铜+13%甘露醇。
本发明通过对香橼实生苗叶片进行黑暗预处理、预质壁分离、酶解、纯化等步骤，首次建立了香橼原生质体的分离方法。其中，在酶解之前采用甘露醇溶液浸泡进行预质壁分离，可以改变细胞的生理状态，提高细胞膜的强度，继而减少对原生质体的伤害。本发明可为香橼利用细胞工程进行遗传改良提供新思路，也为香橼开展实生选种提供了一种新途径。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例
一种香橼叶肉原生质体的分离方法，其包括以下步骤：
（1）实生苗获得：选择充分成熟、无病虫害的果实，取出种子，用50℃热水浸种30min，再用冷水浸泡12h，然后用300倍的40%福尔马林浸种1～2h，捞出，晾干至种子手摸不发黏，立即播种；通常播种的种子数量为所需种苗数量的1.5～2倍；播种时采用腐熟的有机肥作基肥，与土质疏松的沙壤土一起搅拌均匀，使得土壤最终的pH为5.5～6.0；整畦开沟，均匀播种，然后先覆盖一层1cm的薄土，适量喷水至土壤手捏成团、不沾手即可，再覆盖一层稻草保湿，播种深度为2cm；
（2）叶片处理：取3g刚展开的实生苗幼嫩叶片，用蒸馏水洗净，晾干，暗处理1天；去除主脉，切成宽1mm的细条；
（3）预质壁分离：将切好的细条置于5wt%甘露醇溶液中浸泡1h；
（4）酶解：将于甘露醇溶液中浸泡后的细条置于酶解液中，在25℃、黑暗条件下于40 r/min的摇床上酶解2～3h；所述酶解液的配方成分为：5wt%甘露醇+1.5wt%离析酶R-10+1.5wt%纤维素酶R-10；
（5）纯化：酶解后将溶液用孔径425μm的滤网过滤，滤液以500 r/min离心10min，去除上清液，用13%CPW洗液将沉淀的原生质体小球悬浮，离心5min，用吸管收集下层原生质体；所述13%CPW洗液的配方成分为：27.2 mg/L碳酸二氢钾+101.0 mg/L硝酸钾+1480.0 mg/L二水合氯化钙+246.0 mg/L七水合硫酸镁+0.16 mg/L碘化钾+0.025 mg/L五水合硫酸铜+13%甘露醇。
以原生质体产量及原生质体活力为指标，考察不同条件下的分离效果，结果见表1-3。原生质体产量的测定：吹打收集的原生质体悬浮液，用移液枪吸取一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，计算结果以每克叶片原生质体数表示个/g，连续计数三次，取平均值。原生质体活力采用荧光素双醋酸酷染色法进行检测，其计算方法为：原生质体活力=（暗视野下发荧光原生质体数/明视野下原生质体数）×100%。
表1 预质壁分离效果
表2 不同酶解液组合效果
表3 不同酶时间效果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种香橼叶肉原生质体的分离方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）实生苗获得：选择充分成熟、无病虫害的果实，取出种子，用50℃热水浸种30min，再用冷水浸泡12h，然后用300倍的40wt%福尔马林浸种1～2h，捞出，晾干至种子手摸不发黏，立即播种；
（2）叶片处理：取刚展开的实生苗幼嫩叶片，用蒸馏水洗净，晾干，暗处理1天；去除主脉，切成宽1mm的细条；
（3）预质壁分离：将切好的细条置于5wt%甘露醇溶液中浸泡1h；
（4）酶解：将于甘露醇溶液中浸泡后的细条置于酶解液中，在25℃、黑暗条件下于40 r/min的摇床上酶解2～3h；
（5）纯化：酶解后将溶液用孔径425μm的滤网过滤，滤液以500 r/min离心10min，去除上清液，用13%CPW洗液将沉淀的原生质体小球悬浮，离心5min，用吸管收集下层原生质体。
2.根据权利要求1所述的香橼叶肉原生质体的分离方法，其特征在于：步骤（1）中播种的种子数量为所需种苗数量的1.5～2倍；播种时采用腐熟的有机肥作基肥，与土质疏松的沙壤土一起搅拌均匀，使得土壤最终的pH为5.5～6.0；整畦开沟，均匀播种，然后先覆盖一层1cm的薄土，喷水至土壤手捏成团、不沾手的程度，再覆盖一层稻草保湿，播种深度为2cm。
3. 根据权利要求1所述的香橼叶肉原生质体的分离方法，其特征在于：步骤（4）所述酶解液的配方成分为：5wt%甘露醇+1.5wt% 离析酶R-10+1.5 wt% 纤维素酶R-10。
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