CN101946629A - 一种快速获得杂种小麦纯系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速获得杂种小麦纯系的方法，该方法包括以下步骤：⑴配制杂交组合；⑵种植杂种材料；⑶确定适宜的取穗时期；⑷预处理花药；⑸游离纯化小孢子；⑹调整小孢子的密度；⑺诱导形成小孢子胚；⑻分化培养形成再生植株；⑼再生苗低温越夏；⑽培养壮苗；⑾炼苗；⑿移栽；⒀移栽后管理；⒁成熟收获。本发明将供试材料直接种植在大田上，通过将小孢子从花药中游离出来进行培养，去除了花药壁的干扰，因此，有利于对各种培养因子进行优化，不但使小孢子胚的诱导频率提高，而且能够克服基因型的限制，使更多的杂交组合材料获得再生植株，从而为品种选育提供更加丰富的基础材料，对提高单倍体育种效率起到重要的作用。

Description

一种快速获得杂种小麦纯系的方法

技术领域

 本发明涉及小麦育种方法，尤其涉及一种快速获得杂种小麦纯系的方法。

背景技术

杂交育种是目前培育小麦品种普遍采用的方法，这种方法是将杂交组合在田间种植，连续自交多代，这个过程在一年一个世代的情况下，品种间杂交组合一般需要5-6年时间（远缘杂交组合需要更多的年限），这就要求在田间多年种植大量的材料，占用大量的耕地，经育种研究者大量地鉴定筛选量才能获得纯系，用于进一步鉴定筛选，耗时费力；并且，在分离世代群体材料中，由于等位基因是杂合的，只表达显性基因的性状，而隐性基因的性状不表达，在早代选择过程中容易造成携带隐性性状基因的材料被丢失，选择效率低下。为了加快育种进程，杂交育种中采用异地或人工气候室进行加代，以加速基因纯合，异地加代投入的人力物力较大，并且由于生态条件的改变，在异地难以对育种材料进行筛选，只能将加代繁殖的材料全部收获，下年全部种植在本地，这就大大增加了田间工作量和育种成本；人工气候室加代由于要建立大型专用设施，每年需要大量维护和运转经费，使用成本高，难以在一般的育种单位开展，使这种加代方法的应用受到极大的限制。

单倍体育种技术由于能够实现一代获得纯系，缩短了杂交育种中通过多年连续自交获得纯系的年限，因此，倍受育种工作者推崇。长期以来，花药培养是主要的单倍体育种技术之一，然而，由于花药壁的存在，这种方法存在着小孢子胚诱导频率低、基因型对小孢子胚的形成有决定性影响的缺点，制约了单倍体育种技术的发展和应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、成本低、有效提高小孢子胚诱导频率的快速获得杂种小麦纯系的方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种快速获得杂种小麦纯系的方法，包括以下步骤：

⑴配制杂交组合：根据育种目标，选择性状互补的品种做亲本，人工去雄授粉，成熟后，按杂交组合收获杂交穗，单独脱粒，得杂交组合材料种子；

⑵种植杂种材料：在小麦播种期，按20cm行距、10cm株距点播所述杂交组合材料种子60粒，并使播种沟地平整；

⑶确定适宜的取穗时期：取孕穗期麦穗中部的花药，在显微镜下观察小孢子的发育时期，将所述小孢子发育到单核中期-单核后期的麦穗从穗下节处折断，并剪掉叶片；

⑷预处理花药：首先用质量浓度为75%的酒精对所述步骤⑶所得的麦穗进行表面灭菌后，剥出麦穗；然后将该麦穗放入质量浓度为0.1%的HgCl 溶液中，摇晃3~5分钟，倒掉HgCl溶液，经无菌蒸馏水洗涤后，取出麦穗并吸干表面水分，取出花药；最后将所述花药用3ml预处理溶液接种，并在28~33℃温度下暗培养34~76小时，得到预处理花药；

⑸游离纯化小孢子：将所述步骤⑷所得的预处理花药经震荡、过100微米筛网过滤后，得到花药残渣；在所述花药残渣中按料液体积比为1：15~20加入小孢子提取液，经震荡、过100微米筛网过滤后，在12~15℃温度下离心分离，弃上清液，得小孢子沉淀物；在所述小孢子沉淀物中按料液体积比为1：15~20加入质量浓度为55%的甘露醇溶液，使所述小孢子沉淀物充分悬浮后，吸出悬浮液，滴加到质量浓度为21%的麦芽糖溶液中至溶液总体积为10ml，并在12~15℃温度下离心分离后，吸取麦芽糖与甘露醇界面处的小孢子；在所述小孢子中按1：5~10的料液体积比加入无麦芽糖的小孢子胚诱导培养基，在12~15℃温度下离心分离，弃上清液，再加入2ml小孢子胚诱导培养基，使所述小孢子充分悬浮；

⑹调整小孢子的密度：取所述步骤⑸所得的小孢子悬浮液1~2滴，滴到血球计数板上，计数小孢子的数量，并通过所述小孢子胚诱导培养基，将小孢子密度调整为10000个/ml；

⑺诱导形成小孢子胚：吸取3ml、密度为10000个/ml的小孢子溶液，加入到直径为6cm的无菌玻璃培养皿中，同时接种6个末授粉小麦子房，将皿口用parafilm膜封住后，在温度为28~32℃的培养箱中培养，直到小孢子胚发育到1.3~1.5mm大小；

⑻分化培养形成再生植株：将所述步骤⑺所得的小孢子胚转接到小孢子胚分化培养基中，在培养室中经8小时黑暗、光照强度为2000~3000 LUX 的16小时光照培养，直至形成再生苗；

⑼再生苗低温越夏：当再生苗长至0.3~0.5cm时，将其放入温度为4℃且经8小时黑暗、光照强度为2000~3000 LUX 的16小时光照培养室中培养40~60天，得到绿苗； 

⑽培养壮苗：将所述绿苗接种在壮苗培养基中，在夜间温度为20℃、白天温度为25℃、采用自然散射光，并每天补充光照强度为2000~3000 LUX的16小时光照的培养室中培养20~30天，得到壮苗；

⑾练苗：当所述壮苗的麦苗高6~7cm时，移至玻璃温室中，在自然光照条件下闭瓶练苗5~7天后，冲洗干净根部培养基，并置于自然光下练苗7~10天，待新根长出0.2~0.5cm时可移栽到土壤中；

⑿移栽：整地7~10天后，在整好的土地上开沟、移栽，地表见干时，中耕一次，同时使行与行之间的距离为25cm；其中冬小麦材料于播种期直接移栽到大田中，春小麦材料于立冬前10天移栽到玻璃温室中；

⒀移栽后管理：移栽成活后，按小麦育种试验田进行管理；

⒁成熟收获：小麦籽粒变硬时，按单株收获，挂牌标记；充分风干后，按单株脱粒，将不同单株的籽粒装入不同的牛皮纸种子袋中，做好标记和登记，以备下年田间试验用。

所述步骤⑷中的预处理溶液由1240 mg/L KCl、240 mg/L MgSO₄·7H₂O、140 mg/L CaCl₂·2H₂O、136 mg/L KH₂PO₄、3 mg/L H₃BO₃、3 mg/L ZnSO₄·4H₂O、8 mg/L MnSO₄·4H₂O、55000~75000 mg/L甘露醇和50 mg/L 2-羟基-烟酸（2-HNA）组成。

所述步骤⑸中的小孢子提取液由55000 mg/L甘露醇、1100 mg/L CaCl₂·2H₂O和1000 mg/L 2-吗啉乙磺酸（MES）组成。

所述步骤⑸中的小孢子胚诱导培养基由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、生长调节物质和90000~110000mg/L麦芽糖组成；其中

所述大量元素为140 mg/L CaCl₂·2H₂O、2000 mg/L KNO₃、200 mg/L MgSO₄·7H₂O、700 mg/L K₂SO₄和380 mg/L NH₄H₂PO₄；

所述微量元素为5 mg/L MnSO₄·4H₂O、3 mg/L ZnSO₄·4H₂O、5 mg/L H₃BO₃、0.4 mg /L KI、0.05 mg/L NaMoO₄·5H₂O、0.0125 mg/L CuSO₄·5H₂O和0.0125 mg/L CoCl₂·6H₂O；

所述有机成分为2 mg/L甘氨酸、4 mg/L盐酸硫胺素、0.5 mg/L盐酸吡哆辛、0.5 mg/L烟酸、1.5 mg/L生物素、500 mg/L谷氨酰胺、0.5~2 mg/L苯乙酸（PAA）、1~10 mg/L阿拉伯半乳聚糖（AG）和10~50 mg/L阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGP）；

所述铁盐为27.8 mg/L　FeSO₄·7H₂O和37.3 mg/L Na₂-EDTA；所述生长调节物质为0.2~0.8 mg/L激动素（KT）和1~2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）。

所述步骤⑻中的小孢子胚分化培养基由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、生长调节物质、30000 mg/L蔗糖和4500mg/L琼脂粉组成；其中

所述大量元素为1900 mg/L KNO₃、1650 mg/L NH₄NO₃、370 mg/L MgSO₄·7H₂O、170 mg/L KH₂PO₄和440 mg/L CaCl₂·2H₂O；

所述微量元素为22.3 mg/L MnSO₄·4H₂O、86 mg/L ZnSO₄·7H₂O、62 mg/L H₃BO₃、0.83 mg /L KI、0.25 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025 mg/L Cu SO₄·5H₂O和0.025 mg/L CoCl₂·6H₂O；

所述有机成分为2 mg/L甘氨酸、0.4mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、100mg/L肌醇和200~500 mg/L水解乳蛋白；

所述铁盐为27.85 mg/L FeSO₄·7H₂O和37.25 mg/L Na₂-EDTA；所述生长调节物质为0.2~0.5 mg/L 吲哚乙酸（IAA）和0.4~1 mg/L激动素（KT）。

所述步骤⑻中的培养室是指黑暗温度为20℃、光照温度为25℃的培养室。

所述步骤⑽中的壮苗培养基由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、生长调节物质、20000 mg/L蔗糖和4500mg/L琼脂粉组成；其中

所述大量元素为1140 mg/L KNO₃、990 mg/L NH₄NO₃、220 mg/L MgSO₄·7H₂O、105 mg/L KH₂PO₄和440 mg/L CaCl₂·2H₂O；

所述微量元素为11.2 mg/L MnSO₄·4H₂O、45 mg/L ZnSO₄·7H₂O、30 mg/L H₃BO₃、0.50 mg /L KI、0.25 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025 mg/L Cu SO₄·5H₂O和0.025 mg/L CoCl₂·6H₂O；

所述有机成分为2 mg/L甘氨酸、0.4mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸和100mg/L肌醇； 

所述铁盐为27.85 mg/L FeSO₄·7H₂O和37.25 mg/L Na₂-EDTA；所述生长调节物质为0.4~1.0 mg/L a-萘乙酸（NAA）和0.2~0.5 mg/L激动素（KT）。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、由于本发明将小孢子从花药中游离出来进行培养，去除了花药壁的干扰，因此，有利于对各种培养因子进行优化，不但使小孢子胚的诱导频率提高，而且能够克服基因型的限制，使更多的杂交组合材料获得再生植株，从而为品种选育提供更加丰富的基础材料，对提高单倍体育种效率起到重要的作用。

2、由于本发明将供试材料直接种植在大田，因此，在普通植物组织培养实验中即可完成；而且获得的再生植株移栽普通玻璃温室中，不需大型专用设备，通过一代培养即可获得纯系，缩短了杂交育种中通过自交获得纯系的时间4年左右；同时，由于这些植株在染色体水平上是纯合的，因而在当代显性和隐性性状在田间都能够充分表达，育种者就能对所有性状进行考察，选留目标性状材料，用于下年的鉴定筛选，淘汰非目标性状材料，从而节约土地和时间，降低育种成本，并减少了育种者的工作量和工作强度，提高了选择效率。

3、与现有单倍体育种方法相比，研究成本低，效率高。

染色体消失单倍体育种方法需要要把异源材料种植在人工气候室，调整花期，使之与小麦花期相遇才能授粉，并且异源材料的基因型和小麦的基因型要匹配才能获得单倍体胚进行离体培养，获得再生单倍体植株，经人工加倍后才能获得正常二倍体小麦材料进行品种选育，增加了研究成本。本发明取田间种植的小麦杂交材料的小孢子进行培养，利用培养过程中自然加倍获得小麦纯系，由于自然加倍频率高，省去了人工加倍过程，因此，方法简单，研究成本低。

4、由于本发明将小孢子从花药中游离出来进行培养，在不增加研究成本的前提下，与花药培养相比，能够提高小孢子胚诱导频率和绿苗率，并能使花药培养中不能获得再生植株的基因型杂交组合获得再生植株，因此，使更多基因型杂交组合获得纯系材料用于鉴定筛选，克服了花药培养的缺点，提高了绿苗生产率（参见表1）。

表1：小孢子培养与花药培养效果比较

5、国外研究者将供试材料种植在人工气候室中，通过光照、温度、湿度和营养调控供体植株的生理状态，使小孢子胚的诱导和再生频率提高。国内研究者利用大田种植的京花1号、石4185、Bobwhite等模式品种为试验材料进行了小孢子培养再生体系研究。本发明将育种杂交材料直接种植在大田中，与国外研究相比，降低了研究成本，与国内研究相比，通过诱导培养基因优化，使育种杂交组合材料的小孢子胚的绿苗率增加。

6、本发明与分子标记和基因工程相结合，有效地节省了时间，提高了效率。

构建分子标记群体材料是标记重要农艺性状的基础，目前常采用的方法是将两个亲本杂交，通过7~8个世代的连续自交获得重组近交系，在每个世代要对后代材料进行无偏选择，尽量保留所有的基因型；在转基因育种中，将转基因材料种植在转基因专用温室中，连续自交数代（3~5个世代）才能获得转基因纯系植株进行基因功能分析和品种选育；这就要占用大量的土地，需要大量的劳力，耗费大量的研究经费。本发明对杂交组合材料（或转基因材料）进行小孢子培养，一代即可获得纯系，不但缩短了通过自交纯合获得纯系的年限，节约研究成本，节省土地，而且也减少了研究者的工作量和劳动强度。

具体实施方式

实施例1     一种快速获得杂种小麦纯系的方法，包括以下步骤：

⑴配制杂交组合：

根据育种目标，选择性状互补的品种做亲本，人工去雄授粉，成熟后，按杂交组合收获杂交穗，单独脱粒，得杂交组合材料种子，保存，以备下年播种。

⑵种植杂种材料：

在小麦播种期，在田间按20cm行距、10cm株距点播杂交组合材料种子60粒，播种完毕后，用耙子顺播种沟将地耙平整。田间管理要注意防虫治病，保证杂交组合材料健壮生长。

⑶确定适宜的取穗时期：

取孕穗期麦穗中部的花药，在显微镜下观察小孢子的发育时期，将小孢子发育到单核中期-单核后期的麦穗从穗下节处折断，并剪掉叶片，插入装有20ml自来水的烧杯中带回实验室。

⑷预处理花药：

首先用质量浓度为75%的酒精对步骤⑶所得的麦穗进行表面灭菌后放入无菌超净工作台上，待表面的酒精挥发完后，剥出麦穗；然后将该麦穗放入无菌三角瓶中，加入质量浓度为0.1%的HgCl 溶液，并不断摇晃3分钟，倒掉HgCl溶液，用无菌蒸馏水洗涤麦穗三次后，取出麦穗，用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌镊子取出花药；最后将花药接种在盛有3ml预处理溶液的三角瓶中，用无菌膜封口，并将三角瓶置于28℃温度下暗培养76小时，得到预处理花药。

其中：预处理溶液由1240 mg/L KCl、240 mg/L MgSO₄·7H₂O、140 mg/L CaCl₂·2H₂O、136 mg/L KH₂PO₄、3 mg/L H₃BO₃、3 mg/L ZnSO₄·4H₂O、8 mg/L MnSO₄·4H₂O、75000 mg/L甘露醇和50 mg/L 2-HNA组成。

⑸游离纯化小孢子：

取出盛有步骤⑷所得的预处理花药的三角瓶，放在无菌超净工作台上，揭去封口膜，用玻璃棒挤压花药，将三角瓶置于涡旋混合器上震荡1~3分钟，用吸管吸出三角瓶中的溶液，经100微米的筛网过滤到10ml的无菌离心管中，得到花药残渣；用吸管按料液体积比为1：15吸取小孢子提取液加入到盛有花药残渣的三角瓶中，在涡旋混合器上震荡3分钟，用吸管将溶液吸出，经100微米的筛网过滤到上次的离心管中，盖紧盖子；在12℃温度、600转/分钟下离心分离5分钟，弃上清液，得小孢子沉淀物。其中：小孢子提取液由55000 mg/L甘露醇、1100 mg/L CaCl₂·2H₂O和1000 mg/L MES组成。

在盛有小孢子沉淀物的离心管中按料液体积比为1：15加入用吸管吸取的质量浓度为55%的甘露醇溶液，盖紧盖子，来回颠倒离心管5次，使管底部的使小孢子沉淀物充分悬浮后，用吸管吸出悬浮液，滴加到10ml、装有质量浓度为21%的麦芽糖溶液离心管中至溶液总体积为10ml，盖紧离心管盖子，在12℃温度、1000转/分钟下离心分离5分钟后，用吸管吸取麦芽糖与甘露醇界面处的小孢子加入到另一10ml无菌离心管中；用另一吸管吸取无麦芽糖的小孢子胚诱导培养基加入到小孢子中，其中小孢子与无麦芽糖的小孢子胚诱导培养基的体积比为1：5，盖紧离心管盖子，在12℃温度、500转/分钟下离心分离5分钟，弃上清液，再加入2ml小孢子胚诱导培养基，摇晃离心管，使小孢子充分悬浮。

上述小孢子胚诱导培养基由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、生长调节物质和90000 mg/L麦芽糖组成；其中

大量元素为140 mg/L CaCl₂·2H₂O、2000 mg/L KNO₃、200 mg/L MgSO₄·7H₂O、700 mg/L K₂SO₄和380 mg/L NH₄H₂PO₄；

微量元素为5 mg/L MnSO₄·4H₂O、3 mg/L ZnSO₄·4H₂O、5 mg/L H₃BO₃、0.4 mg /L KI、0.05 mg/L NaMoO₄·5H₂O、0.0125 mg/L CuSO₄·5H₂O和0.0125 mg/L CoCl₂·6H₂O；

有机成分为2 mg/L甘氨酸、4 mg/L盐酸硫胺素、0.5 mg/L盐酸吡哆辛、0.5 mg/L烟酸、1.5 mg/L生物素、500 mg/L谷氨酰胺、0.5 mg/L PAA、10 mg/L AG和50 mg/L AGP；

铁盐为27.8 mg/L　FeSO₄·7H₂O和37.3 mg/L Na₂-EDTA；所述生长调节物质为0.2 mg/L KT和1 mg/L 2,4-D。

⑹调整小孢子的密度：

取步骤⑸所得的小孢子悬浮液1~2滴，滴到血球计数板上，计数小孢子的数量，，并换算成1毫升溶液中的小孢子数量，据此在离心管中加入小孢子胚诱导培养基，将小孢子密度调整为10000个/ml。

⑺诱导形成小孢子胚：

在无菌超净工作台上，用吸管吸取3ml、密度为10000个/ml的小孢子溶液，加入到直径为6cm的无菌玻璃培养皿中，同时接种6个末授粉小麦子房，将皿口用parafilm膜封住后，在温度为28℃的培养箱中培养，直到小孢子胚发育到1.3~1.5mm大小。

⑻分化培养形成再生植株：

在无菌超净工作台上，打开培养皿，用镊子夹出步骤⑺所得的小孢子胚，转接到装有小孢子胚分化培养基的三角瓶中，用无菌封口膜将瓶口封住，将三角瓶置于培养室（该培养室是指黑暗温度为20℃、光照温度为25℃的培养室。）中，经8小时黑暗、光照强度为2000~3000 LUX 的16小时光照培养，直至形成再生苗。

上述小孢子胚分化培养基由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、生长调节物质、30000 mg/L蔗糖和4500mg/L琼脂粉组成；其中

大量元素为1900 mg/L KNO₃、1650 mg/L NH₄NO₃、370 mg/L MgSO₄·7H₂O、170 mg/L KH₂PO₄和440 mg/L CaCl₂·2H₂O；

微量元素为22.3 mg/L MnSO₄·4H₂O、86 mg/L ZnSO₄·7H₂O、62 mg/L H₃BO₃、0.83 mg /L KI、0.25 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025 mg/L Cu SO₄·5H₂O和0.025 mg/L CoCl₂·6H₂O；

有机成分为2 mg/L甘氨酸、0.4mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、100mg/L肌醇和200 mg/L水解乳蛋白；

铁盐为27.85 mg/L FeSO₄·7H₂O和37.25 mg/L Na₂-EDTA；所述生长调节物质为0.2 mg/L IAA和0.4 mg/L KT。

⑼再生苗低温越夏：

当再生苗长至0.3~0.5cm时，将其放入温度为4℃且经8小时黑暗、光照强度为2000 LUX 的16小时光照培养室中培养60天，得到绿苗。

⑽培养壮苗：

在无菌超净工作台上，打开培养瓶封口膜，用镊子夹出绿苗，将绿苗接种在装有壮苗培养基的三角瓶中，用无菌封口膜封住瓶口，将三角瓶置于夜间温度为20℃、白天温度为25℃、采用自然散射光，并每天补充光照强度为2000 LUX的16小时光照的培养室中培养30天，得到壮苗。

上述壮苗培养基由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、生长调节物质、20000 mg/L蔗糖和4500mg/L琼脂粉组成；其中

大量元素为1140 mg/L KNO₃、990 mg/L NH₄NO₃、220 mg/L MgSO₄·7H₂O、105 mg/L KH₂PO₄和440 mg/L CaCl₂·2H₂O；

微量元素为11.2 mg/L MnSO₄·4H₂O、45 mg/L ZnSO₄·7H₂O、30 mg/L H₃BO₃、0.50 mg /L KI、0.25 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025 mg/L Cu SO₄·5H₂O和0.025 mg/L CoCl₂·6H₂O；

有机成分为2 mg/L甘氨酸、0.4mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸和100mg/L肌醇； 

铁盐为27.85 mg/L FeSO₄·7H₂O和37.25 mg/L Na₂-EDTA；所述生长调节物质为1.0 mg/L NAA和0.5 mg/L KT。

⑾练苗：

当壮苗的麦苗高6~7cm时，将三角瓶移至玻璃温室中，在自然光照条件下闭瓶练苗5~7天后，揭去封口膜，用镊子夹出麦苗，自来水冲洗干净根部培养基，将根浸入装自来水的塑料杯中，并置于自然光下练苗7~10天（每天更换一次清水），待新根长出0.2~0.5cm时可移栽到土壤中。

⑿移栽：

整地7~10天后，人工用铲子在整好的土地上开沟，左手拿麦苗，使根完全伸展，右手拥土并压紧，栽完一沟后，用洒壶沿沟浇透水，并做好标记和记载，开始下一行移栽，同时使行与行之间的距离为25cm；地表见干时，人工用铲子中耕一次，其中冬小麦材料于播种期直接移栽到大田中，春小麦材料于立冬前10天移栽到玻璃温室中。

⒀移栽后管理：

移栽成活后，按小麦育种试验田进行管理，全生育期注意防虫治病，拔除杂草，防止人、畜、鼠及鸟害。

⒁成熟收获：

小麦籽粒变硬时，按单株收获，挂牌标记；充分风干后，按单株脱粒，将不同单株的籽粒装入不同的牛皮纸种子袋中，做好标记和登记，以备下年田间试验用。

实施例2     一种快速获得杂种小麦纯系的方法，包括以下步骤：

⑴配制杂交组合；⑵种植杂种材料；⑶确定适宜的取穗时期均同实施例1。

⑷预处理花药：

首先用质量浓度为75%的酒精对步骤⑶所得的麦穗进行表面灭菌后放入无菌超净工作台上，待表面的酒精挥发完后，剥出麦穗；然后将该麦穗放入无菌三角瓶中，加入质量浓度为0.1%的HgCl 溶液，并不断摇晃4分钟，倒掉HgCl溶液，用无菌蒸馏水洗涤麦穗三次后，取出麦穗，用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌镊子取出花药；最后将花药接种在盛有3ml预处理溶液的三角瓶中，用无菌膜封口，并将三角瓶置于30℃温度下暗培养58小时，得到预处理花药。

其中：预处理溶液由1240 mg/L KCl、240 mg/L MgSO₄·7H₂O、140 mg/L CaCl₂·2H₂O、136 mg/L KH₂PO₄、3 mg/L H₃BO₃、3 mg/L ZnSO₄·4H₂O、8 mg/L MnSO₄·4H₂O、60000 mg/L甘露醇和50 mg/L 2-HNA组成。

⑸游离纯化小孢子：

取出盛有步骤⑷所得的预处理花药的三角瓶，放在无菌超净工作台上，揭去封口膜，用玻璃棒挤压花药，将三角瓶置于涡旋混合器上震荡2分钟，用吸管吸出三角瓶中的溶液，经100微米的筛网过滤到10ml的无菌离心管中，得到花药残渣；用吸管按料液体积比为1：17吸取小孢子提取液加入到盛有花药残渣的三角瓶中，在涡旋混合器上震荡2分钟，用吸管将溶液吸出，经100微米的筛网过滤到上次的离心管中，盖紧盖子；在15℃温度、800转/分钟下离心分离4分钟，弃上清液，得小孢子沉淀物。

在盛有小孢子沉淀物的离心管中按料液体积比为1：16加入用吸管吸取的质量浓度为55%的甘露醇溶液，盖紧盖子，来回颠倒离心管8次，使管底部的使小孢子沉淀物充分悬浮后，用吸管吸出悬浮液，滴加到10ml、装有质量浓度为21%的麦芽糖溶液离心管中至溶液总体积为10ml，盖紧离心管盖子，在15℃温度、1200转/分钟下离心分离5分钟后，用吸管吸取麦芽糖与甘露醇界面处的小孢子加入到另一10ml无菌离心管中；用另一吸管吸取无麦芽糖的小孢子胚诱导培养基加入到小孢子中，其中小孢子与无麦芽糖的小孢子胚诱导培养基的体积比为1：8，盖紧离心管盖子，在15℃温度、600转/分钟下离心分离4分钟，弃上清液，再加入2ml小孢子胚诱导培养基，摇晃离心管，使小孢子充分悬浮。

其中：小孢子提取液同实施例1。

小孢子胚诱导培养基的麦芽糖浓度为100000 mg/L，PAA浓度为1 mg/L，AG浓度为5 mg/L，AGP 浓度为30 mg/L； KT浓度为0.5 mg/L，2,4-D浓度为1.5mg/L，其余化合物浓度同实施例1。

⑹调整小孢子的密度同实施例1。

⑺诱导形成小孢子胚：

在无菌超净工作台上，用吸管吸取3ml、密度为10000个/ml的小孢子溶液，加入到直径为6cm的无菌玻璃培养皿中，同时接种6个末授粉小麦子房，将皿口用parafilm膜封住后，在温度为31℃的培养箱中培养，直到小孢子胚发育到1.3~1.5mm大小。

⑻分化培养形成再生植株：

接种培养小孢子胚的方法同实施例1，其中的小孢子胚分化培养基中水解乳蛋白浓度为320 mg/L，生长调节物质为IAA浓度为0.4 mg/L， KT浓度为0.8 mg/L，其余化合物浓度同实施例1。

⑼再生苗低温越夏：

当再生苗长至0.3~0.5cm时，将其放入温度为4℃且经8小时黑暗、光照强度为3000 LUX 的16小时光照培养室中培养40天，得到绿苗。

⑽培养壮苗：

在无菌超净工作台上，打开培养瓶封口膜，用镊子夹出绿苗，将绿苗接种在装有壮苗培养基的三角瓶中，用无菌封口膜封住瓶口，将三角瓶置于夜间温度为20℃、白天温度为25℃、采用自然散射光，并每天补充光照强度为3000 LUX的16小时光照的培养室中培养20天，得到壮苗。

上述壮苗培养基中生长调节物质NAA浓度为0.6 mg/L，KT浓度为0.4 mg/L，其余化合物浓度同实施例1。

⑾练苗；⑿移栽；⒀移栽后管理；⒁成熟收获均同实施例1。

实施例3     一种快速获得杂种小麦纯系的方法，包括以下步骤：

⑴配制杂交组合；⑵种植杂种材料；⑶确定适宜的取穗时期均同实施例1。

⑷预处理花药：

首先用质量浓度为75%的酒精对步骤⑶所得的麦穗进行表面灭菌后放入无菌超净工作台上，待表面的酒精挥发完后，剥出麦穗；然后将该麦穗放入无菌三角瓶中，加入质量浓度为0.1%的HgCl 溶液，并不断摇晃5分钟，倒掉HgCl溶液，用无菌蒸馏水洗涤麦穗三次后，取出麦穗，用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌镊子取出花药；最后将花药接种在盛有3ml预处理溶液的三角瓶中，用无菌膜封口，并将三角瓶置于33℃温度下暗培养34小时，得到预处理花药。

其中：预处理溶液由1240 mg/L KCl、240 mg/L MgSO₄·7H₂O、140 mg/L CaCl₂·2H₂O、136 mg/L KH₂PO₄、3 mg/L H₃BO₃、3 mg/L ZnSO₄·4H₂O、8 mg/L MnSO₄·4H₂O、55000 mg/L甘露醇和50 mg/L 2-HNA组成。

⑸游离纯化小孢子：

取出盛有步骤⑷所得的预处理花药的三角瓶，放在无菌超净工作台上，揭去封口膜，用玻璃棒挤压花药，将三角瓶置于涡旋混合器上震荡1~3分钟，用吸管吸出三角瓶中的溶液，经100微米的筛网过滤到10ml的无菌离心管中，得到花药残渣；用吸管按料液体积比为1：20吸取小孢子提取液加入到盛有花药残渣的三角瓶中，在涡旋混合器上震荡3分钟，用吸管将溶液吸出，经100微米的筛网过滤到上次的离心管中，盖紧盖子；在13℃温度、1000转/分钟下离心分离5分钟，弃上清液，得小孢子沉淀物。

在盛有小孢子沉淀物的离心管中按料液体积比为1：20加入用吸管吸取的质量浓度为55%的甘露醇溶液，盖紧盖子，来回颠倒离心管10次，使管底部的使小孢子沉淀物充分悬浮后，用吸管吸出悬浮液，滴加到10ml、装有质量浓度为21%的麦芽糖溶液离心管中至溶液总体积为10ml，盖紧离心管盖子，在13℃温度、1500转/分钟下离心分离5分钟后，用吸管吸取麦芽糖与甘露醇界面处的小孢子加入到另一10ml无菌离心管中；用另一吸管吸取无麦芽糖的小孢子胚诱导培养基加入到小孢子中，其中小孢子与无麦芽糖的小孢子胚诱导培养基的体积比为1：10，盖紧离心管盖子，在13℃温度、800转/分钟下离心分离5分钟，弃上清液，再加入2ml小孢子胚诱导培养基，摇晃离心管，使小孢子充分悬浮。

其中：小孢子提取液同实施例1。

小孢子胚诱导培养基的麦芽糖浓度为110000 mg/L，PAA浓度为2mg/L，AG浓度为1mg/L，AGP 浓度为10mg/L；生长调节物质KT浓度为0.8mg/L，2,4-D浓度为2mg/L，其余化合物浓度同实施例1。

⑹调整小孢子的密度同实施例1。

⑺诱导形成小孢子胚：

在无菌超净工作台上，用吸管吸取3ml、密度为10000个/ml的小孢子溶液，加入到直径为6cm的无菌玻璃培养皿中，同时接种6个末授粉小麦子房，将皿口用parafilm膜封住后，在温度为32℃的培养箱中培养，直到小孢子胚发育到1.3~1.5mm大小。

⑻分化培养形成再生植株：

接种培养小孢子胚的方法同实施例1，其中的小孢子胚分化培养基中水解乳蛋白浓度为500 mg/L，生长调节物质IAA浓度为0.5 mg/L， KT浓度为1 mg/L，其余化合物浓度同实施例1。

⑼再生苗低温越夏：

当再生苗长至0.3~0.5cm时，将其放入温度为4℃且经8小时黑暗、光照强度为2500 LUX 的16小时光照培养室中培养50天，得到绿苗。

⑽培养壮苗：

在无菌超净工作台上，打开培养瓶封口膜，用镊子夹出绿苗，将绿苗接种在装有壮苗培养基的三角瓶中，用无菌封口膜封住瓶口，将三角瓶置于夜间温度为20℃、白天温度为25℃、采用自然散射光，并每天补充光照强度为2500 LUX的16小时光照的培养室中培养25天，得到壮苗。

上述壮苗培养基中生长调节物质NAA浓度为0.4 mg/L，KT浓度为0.2 mg/L，其余化合物浓度同实施例1。

⑾练苗；⑿移栽；⒀移栽后管理；⒁成熟收获均同实施例1。

Claims (7)

1.一种快速获得杂种小麦纯系的方法，其特征在于：包括以下步骤，

⑴配制杂交组合：根据育种目标，选择性状互补的品种做亲本，人工去雄授粉，成熟后，按杂交组合收获杂交穗，单独脱粒，得杂交组合材料种子；

⑵种植杂种材料：在小麦播种期，按20cm行距、10cm株距点播所述杂交组合材料种子，并使播种沟地平整；

⑶确定适宜的取穗时期：取孕穗期麦穗中部的花药，在显微镜下观察小孢子的发育时期，将所述小孢子发育到单核中期～单核后期的麦穗从穗下节处折断，并剪掉叶片；

⑷预处理花药：首先用质量浓度为75%的酒精对所述步骤⑶所得的麦穗进行表面灭菌后，剥出麦穗；然后将该麦穗放入质量浓度为0.1%的HgCl 溶液中，摇晃3~5分钟，倒掉HgCl溶液，经无菌蒸馏水洗涤后，取出麦穗并吸干表面水分，取出花药；最后将所述花药用3ml预处理溶液接种，并在28~33℃温度下暗培养34~76小时，得到预处理花药；

⑸游离纯化小孢子：将所述步骤⑷所得的预处理花药经震荡、过100微米筛网过滤后，得到花药残渣；在所述花药残渣中按料液体积比为1：15~20加入小孢子提取液，经震荡、过100微米筛网过滤后，在12~15℃温度下离心分离，弃上清液，得小孢子沉淀物；在所述小孢子沉淀物中按料液体积比为1：15~20加入质量浓度为55%的甘露醇溶液，使所述小孢子沉淀物充分悬浮后，吸出悬浮液，滴加到质量浓度为21%的麦芽糖溶液中至溶液总体积为10ml，并在12~15℃温度下离心分离后，吸取麦芽糖与甘露醇界面处的小孢子；在所述小孢子中按1：5~10的料液体积比加入无麦芽糖的小孢子胚诱导培养基，在12~15℃温度下离心分离，弃上清液，再加入2ml小孢子胚诱导培养基，使所述小孢子充分悬浮；

⑹调整小孢子的密度：取所述步骤⑸所得的小孢子悬浮液1~2滴，滴到血球计数板上，计数小孢子的数量，并通过所述小孢子胚诱导培养基，将小孢子密度调整为10000个/ml；

⑺诱导形成小孢子胚：吸取3ml、密度为10000个/ml的小孢子溶液，加入到直径为6cm的无菌玻璃培养皿中，同时接种6个末授粉小麦子房，将皿口用parafilm膜封住后，在温度为28~32℃的培养箱中培养，直到小孢子胚发育到1.3~1.5mm大小；

⑻分化培养形成再生植株：将所述步骤⑺所得的小孢子胚转接到小孢子胚分化培养基中，在培养室中经8小时黑暗、光照强度为2000~3000 LUX 的16小时光照培养，直至形成再生苗；

⑼再生苗低温越夏：当再生苗长至0.3~0.5cm时，将其放入温度为4℃且经8小时黑暗、光照强度为2000~3000 LUX 的16小时光照培养室中培养40~60天，得到绿苗； 

⑽培养壮苗：将所述绿苗接种在壮苗培养基中，在夜间温度为20℃、白天温度为25℃、采用自然散射光，并每天补充光照强度为2000~3000 LUX的16小时光照的培养室中培养20~30天，得到壮苗；

⑾练苗：当所述壮苗的麦苗高6~7cm时，移至玻璃温室中，在自然光照条件下闭瓶练苗5~7天后，冲洗干净根部培养基，并置于自然光下练苗7~10天，待新根长出0.2~0.5cm时可移栽到土壤中；

⑿移栽：整地7~10天后，在整好的土地上开沟、移栽，地表见干时，中耕一次，同时使行与行之间的距离为25cm；其中冬小麦材料于播种期直接移栽到大田中，春小麦材料于立冬前10天移栽到玻璃温室中；

⒀移栽后管理：移栽成活后，按小麦育种试验田进行管理；

⒁成熟收获：小麦籽粒变硬时，按单株收获，挂牌标记；充分风干后，按单株脱粒，将不同单株的籽粒装入不同的牛皮纸种子袋中，做好标记和登记，以备下年田间试验用。

2.如权利要求1所述的一种快速获得杂种小麦纯系的方法，其特征在于：所述步骤⑷中的预处理溶液由1240 mg/L KCl、240 mg/L MgSO₄·7H₂O、140 mg/L CaCl₂·2H₂O、136 mg/L KH₂PO₄、3 mg/L H₃BO₃、3 mg/L ZnSO₄·4H₂O、8 mg/L MnSO₄·4H₂O、55000~75000 mg/L甘露醇和50 mg/L 2-羟基-烟酸组成。

3.如权利要求1所述的一种快速获得杂种小麦纯系的方法，其特征在于：所述步骤⑸中的小孢子提取液由55000 mg/L甘露醇、1100 mg/L CaCl₂·2H₂O和1000 mg/L 2-吗啉乙磺酸组成。

4.如权利要求1所述的一种快速获得杂种小麦纯系的方法，其特征在于：所述步骤⑸中的小孢子胚诱导培养基由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、生长调节物质和90000~110000 mg/L麦芽糖组成；其中

所述大量元素为140 mg/L CaCl₂·2H₂O、2000 mg/L KNO₃、200 mg/L MgSO₄·7H₂O、700 mg/L K₂SO₄和380 mg/L NH₄H₂PO₄；

所述微量元素为5 mg/L MnSO₄·4H₂O、3 mg/L ZnSO₄·4H₂O、5 mg/L H₃BO₃、0.4 mg /L KI、0.05 mg/L NaMoO₄·5H₂O、0.0125 mg/L CuSO₄·5H₂O和0.0125 mg/L CoCl₂·6H₂O；

所述有机成分为2 mg/L甘氨酸、4 mg/L盐酸硫胺素、0.5 mg/L盐酸吡哆辛、0.5 mg/L烟酸、1.5 mg/L生物素、500 mg/L谷氨酰胺、0.5~2 mg/L苯乙酸、1~10 mg/L阿拉伯半乳聚糖和10~50 mg/L阿拉伯半乳聚糖蛋白；

所述铁盐为27.8 mg/L　FeSO₄·7H₂O和37.3 mg/L Na₂-EDTA；所述生长调节物质为0.2~0.8 mg/L激动素和1~2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸。

5.如权利要求1所述的一种快速获得杂种小麦纯系的方法，其特征在于：所述步骤⑻中的小孢子胚分化培养基由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、生长调节物质、30000 mg/L蔗糖和4500mg/L琼脂粉组成；其中

所述大量元素为1900 mg/L KNO₃、1650 mg/L NH₄NO₃、370 mg/L MgSO₄·7H₂O、170 mg/L KH₂PO₄和440 mg/L CaCl₂·2H₂O；

所述微量元素为22.3 mg/L MnSO₄·4H₂O、86 mg/L ZnSO₄·7H₂O、62 mg/L H₃BO₃、0.83 mg /L KI、0.25 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025 mg/L Cu SO₄·5H₂O和0.025 mg/L CoCl₂·6H₂O；

所述有机成分为2 mg/L甘氨酸、0.4mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、100mg/L肌醇和200~500 mg/L水解乳蛋白；

所述铁盐为27.85 mg/L FeSO₄·7H₂O和37.25 mg/L Na₂-EDTA；所述生长调节物质为0.2~0.5 mg/L 吲哚乙酸和0.4~1 mg/L激动素。

6.如权利要求1所述的一种快速获得杂种小麦纯系的方法，其特征在于：所述步骤⑻中的培养室是指黑暗温度为20℃、光照温度为25℃的培养室。

7.如权利要求1所述的一种快速获得杂种小麦纯系的方法，其特征在于：所述步骤⑽中的壮苗培养基由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、生长调节物质、20000 mg/L蔗糖和4500mg/L琼脂粉组成；其中

所述大量元素为1140 mg/L KNO₃、990 mg/L NH₄NO₃、220 mg/L MgSO₄·7H₂O、105 mg/L KH₂PO₄和440 mg/L CaCl₂·2H₂O；

所述微量元素为11.2 mg/L MnSO₄·4H₂O、45 mg/L ZnSO₄·7H₂O、30 mg/L H₃BO₃、0.50 mg /L KI、0.25 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025 mg/L Cu SO₄·5H₂O和0.025 mg/L CoCl₂·6H₂O；

所述有机成分为2 mg/L甘氨酸、0.4mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸和100mg/L肌醇； 

所述铁盐为27.85 mg/L FeSO₄·7H₂O和37.25 mg/L Na₂-EDTA；所述生长调节物质为0.4~1.0 mg/L a-萘乙酸和0.2~0.5 mg/L激动素。