CN103184277A - 梅花遗传图谱构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种梅花遗传图谱构建方法，其包括如下步骤：1)构建梅花F1代拟测交群体；2)提取父母本及其子代基因组DNA；3)利用限制性内切位点相关的DNA测序方法对父母本及其子代基因组进行重测序，获得符合孟德尔遗传规律的单核苷酸多态性标记；4)根据所获得的单核苷酸多态性标记，应用拟测交策略构建梅花遗传图谱。本发明在克服梅花品种杂交结实率低、育种周期长，构建F1群体困难的基础上，利用RAD的方法和拟测交策略相结合的方法快速构建梅花的遗传图谱程。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种梅花遗传图谱构建方法。
背景技术
梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)是中国目前唯一获得国际品种登录权的植物，虽然近几十年对梅花的研究成绩斐然，在种质资源(包满珠，1993；刘青林，1996；康素红和刘晓祥，1997；张永春和刘小祥，1999)、繁殖生理(胡金良和徐汉卿，1994；徐汉卿和王庆亚，1995；赵守边和刘小祥，1999)等研究领域取得相当的进展，但是在分子育种方面比较滞后。
遗传图谱的构建具有重要的应用价值。分离群体是构建遗传图谱使用的遗传材料，群体亲本的选择直接影响到构建遗传图谱的难易程度及图谱的应用范围。由于农作物育种历史悠久，生长周期短，构建近交系、纯系群体相当容易，但是果树类、林木类等多年生木本植物生长周期长，高度杂合等特点，目前在树木中多利用拟测交策略构建遗传图谱(Weeden et al.1994；Yamamoto et al.2002)。由于梅花分布广、资源变异丰富，不同生态区域的梅花，其遗传基础相差较大，加上梅花起源复杂、有性生殖困难等特性，目前还没有获得一张梅花的遗传图谱，严重限制了梅花的分子育种工作的开展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种梅花遗传图谱构建方法。
本发明提供的梅花遗传图谱构建方法，其包括如下步骤：
1)构建梅花F1代拟测交群体；
2)提取父母本及其子代基因组DNA；
3)利用限制性内切位点相关的DNA测序方法对父母本及其子代基因组进行重测序，获得符合孟德尔遗传规律的单核苷酸多态性标记；
4)根据所获得的单核苷酸多态性标记，应用拟测交策略构建梅花遗传图谱。
本发明中，根据作图亲本选配原则，选择结实率高，子房饱满的梅花品种为母本，选择花药饱满，散粉量大，花粉生活力高的梅花品种为父本，在保留母本花萼的情况下，用镊子去雄，采取一次授粉的方法，进行人工杂交选育，用收获的子代构建F1代拟测交群体。
其中父本花药在温度20～25℃，湿度10～40％下，散粉15～20小时，收集花粉。收集的花粉可立即授粉，也可以在干燥条件下4℃冷藏备用。
优选的，以‘粉瓣’为母本，以‘扣子玉蝶’为父本进行杂交，构建F1代拟测交群体。
本发明的一个实施方案中，利用限制性内切酶对父母本及其子代基因组DNA进行酶切，利用Solexa方法对纯化的父母本及其子代的酶切片段进行单末端测序，使用SOAPsnp软件获得符合孟德尔遗传规律的单核苷酸多态性标记。
在获得符合孟德尔遗传规律的单核苷酸标记后，根据卡平方检验作图群体中符合孟德尔期望分离比为1∶2∶1或1∶1的标记，P＜0.01，过滤掉SNP分子标记中偏分离的标记，利用JoinMap3.0的软件，设置LOD≥3，构建梅花高密度遗传图谱。
本发明在克服梅花品种结实率低、育种周期长，构建F1群体困难的基础上，利用二代测序技术对父母本及其子代进行重测序，通过RAD的方法和拟测交策略相结合快速构建梅花的遗传图谱，该方法为快速构建木本植物高密度图谱提供新的思路和方法，促进其遗传图谱构建进程。
附图说明
图1A为梅花遗传图谱1～4连锁群。
图1B为梅花遗传图谱5～8连锁群。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1构建拟测交群体
本实施例选择梅花品种‘粉瓣’为母本，主要性状为：花芽1-2朵着生，主要分布在短花枝和中花枝，花极繁密，花径2.99cm(2.75-3.31cm)，花蕾粉色，顶端有复色，花瓣为5-8枚，单瓣浅碗型，粉色，有色晕，子房饱满，柱头发育良好，结实率高；‘扣子玉蝶’为父本，主要性状：花芽1-2朵着生，主要分布在短花枝和束花枝，花较繁密，花径2.32cm(1.6-2.68cm)，花蕾顶端有复色，花瓣为14-16枚，重瓣浅碗型，白色，花药饱满，散粉量大，花粉的生活力高。
在父本初花期与盛花期时，选取中等长势的枝条上且无病虫害及生理缺陷的枝条上大蕾与中蕾期的花蕾，用消毒后的医用镊子剥离花药平铺在硫酸纸上，室温(20-25℃)湿度(40％以下)，自然散粉15-20小时，4℃保存备用。在母本初花期，选择生长健壮的中短花枝，适当修剪，先去除已开的花朵和过小花蕾，在保留花萼的情况下，用医用镊子小心地将梅花的花瓣，雄蕊去除，去雄完成后，在10-16时，柱头上具有发亮的粘液时，用毛笔蘸取花粉，轻轻的涂于柱头，完成授粉，计数并挂牌，用硫酸纸做成纸袋，马上套袋，仅进行一次授粉，一次套袋，共杂交2120朵花。授粉完成后7天，待柱头干燥变黑，子房膨大，去掉纸袋；在杂交果实发育85天时，为防止采前落果，进行收前套网；果实发育115天时，人工采收，共采收561粒杂交种子，采收后通风阴凉处，放置15-20天，让杂交种子在果实中充分成熟。将收获的果实去除果肉后，将种子取出，洗净，晾干，置于4℃冷库中砂藏催芽；待种子刚露白，可进行播种。种子催芽后，在温室中将露白的342粒种子，播种于直径为12cm×12cm的花盆中，待其生长到20-30cm时将310棵杂种苗移栽到大田中，每周灌水一次，注意期间的病虫害防护。
根据作图亲本选配原则，选择具有优良性状、生长健壮的品种为杂交亲本，选择结实率高，子房饱满，柱头发育良好的梅花品种为母本，花药饱满，散粉量大，花粉的生活力高的梅花品种为父本，采用保留梅花花萼的情况下，用镊子去雄，仅进行一次授粉的方法，进行人工杂交选育，与传统方法相比，改进之处见表1。
表1：本发明与传统杂交相比创新之处
通过上述的改进，既克服了去掉花萼时对子房的伤害，又节约了大量花粉，避免了多次授粉对柱头的机械损伤，从而将梅花的结实率由5％提高到20％。
实施例2构建遗传图谱
首先，在实施例1获得的F1群体中随机选取260棵用于构建遗传图谱的F1杂交子代。采取顶叶以下1-3片嫩叶，采用天根公司植物基因组提取试剂盒(DP305-02)提取叶片总DNA，使DNA的浓度达到50ng/μl。
再者，每个样品的1μg基因组DNA在50μl体系中分别用20U的EcoRI限制性内切酶(酶切位点：5’G^AATTC3’)于37℃完全酶切1小时，然后于65℃孵育20分钟使内切酶失活。然后用T4DNA连接酶(ENZYMATIC)给每个个体的酶切产物连上带有EcoRI粘性末端和不同index(见表2)的Solexa P1接头(P1接头：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTXXXXXTTAA-3′x代表index接头)，再次65℃孵育20分钟使连接酶失活。24个体每个取等量的连接产物混合，然后用Covaris DNA超声打断仪将连接产物打成主带长度为300-500bp的小片段，打断后的DNA先经过Qiagen PCR column纯化，再经电泳(2％低熔点琼脂糖胶，1X TBE)，用洁净刀片切取含300bp-500bpDNA的胶块。回收的胶块经过Qiagen gel extraction kit纯化获得目的DNA，再经末端修复、加A后连上带有T末端突出的Solexa P2接头(P2接头：5′-ACTCAGGCATCACTCGATTCCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3′)。然后5μl连接产物经高保真扩增酶phusion(NEB)PCR扩增，(20μL反应体系：5μl连接产物，2μL 10×buffer，2μL dNTP(10mM)，1μL P1引物(10μM)(5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)，1μL P2引物(10μM)(ACTCAGGCATCACTCGATTCCTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG)，1.5U高保真扩增酶phusion(NEB)和8.5μL的灭菌水)。扩增程序：预变性95℃4分钟；变性95℃30秒；退火55℃30秒，延伸72℃30秒；后延伸72℃6分钟。最后再经过胶回收即得到适用Hiseq 2000上机的RAD文库，260个子代中每24个F1子代为一组(最后一组为20个)被放到同一个测序池中，利用Illumina公司的HiSeq2000测序平台进行单末端上机测序，大约产生了830Mb 50bp-reads(平均每个子代有3.1Mb reads)见表3，使用SOAP软件将短序列比对回参考序列，然后用SOAPSNP软件寻找SNP位点。
表224个核苷酸多元化标签的接头
| 序列号 | 标签的条形码 |
| 1 | ACCTCT |
| 2 | ACGACTAC |
| 3 | ACGTGTT |
| 4 | AGGC |
| 5 | ATAATC |
| 6 | CATCT |
| 7 | CCATGGGT |
| 8 | CCGGATAT |
| 9 | CGCTGAT |
| 10 | CGGTAGA |
| 11 | CGTGTGGT |
| 12 | CTCC |
| 13 | GATC |
| 14 | GCTGTGGA |
| 15 | GGATTGGT |
| 16 | GGCTAC |
| 17 | GTGAGGGT |
| 18 | TAGCGGA |
| 19 | TCAC |
| 20 | TCACC |
| 21 | TCGTT |
| 22 | TGCAAGGA |
| 23 | TGGAGA |
| 24 | TTCCAC |
最后，应用拟测交策略进行图谱构建：选择在双亲中表现多态的SNP位点，且在作图群体中发生1∶1或1∶2∶1分离的位点进行连锁分析，最后将以上得到连锁位点输入作图软件JoinMap 3.0进行图谱的构建，设置LOD＝12，共获得了8条梅花连锁群，包含781个SNP标记位点，总图距为730.2CM，见表3，图1A、图1B。
表3亲本与子代进行RAD测序数据与RAD-tag统计
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种梅花遗传图谱构建方法，其包括如下步骤：
1)构建梅花F1代拟测交群体；
2)提取父母本及其子代基因组DNA；
3)利用限制性内切位点相关的DNA测序方法对父母本及其子代基因组进行重测序，获得符合孟德尔遗传规律的单核苷酸多态性标记；
4)根据所获得的单核苷酸多态性标记，应用拟测交策略构建梅花遗传图谱。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，根据作图亲本选配原则，选择结实率高，子房饱满的梅花品种为母本，选择花药饱满，散粉量大，花粉生活力高的梅花品种为父本，在保留母本花萼的情况下，用镊子去雄，采取一次授粉的方法，进行人工杂交选育，用收获的子代构建F1代拟测交群体。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，其中父本花药在温度20～25℃，湿度10～40％下，散粉15～20小时，收集花粉。
4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，以‘粉瓣’为母本，以‘扣子玉蝶’为父本进行杂交，构建F1代拟测交群体。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用限制性内切酶对父母本及其子代基因组DNA进行酶切，利用Solexa方法对纯化的父母本及其子代的酶切片段进行单末端测序，使用SOAPsnp软件获得符合孟德尔遗传规律的单核苷酸多态性标记。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用卡平方检验作图群体是否符合孟德尔期望分离比为1∶2∶1或1∶1的标记，P＜0.01，过滤掉SNP分子标记中偏分离的标记，利用JoinMap3.0的软件，设置LOD值≥3，构建梅花高密度遗传图谱。
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