CN105647965A - 一种柑橘原生质体转化及提纯方法 - Google Patents

一种柑橘原生质体转化及提纯方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种柑橘原生质体转化方法，包括以下步骤：(1)向柑橘原生质体中添加质粒和浓度在40-60％之间的聚乙二醇-钙溶液，每100μl柑橘原生质体加入10-15μg质粒和110μl所述聚乙二醇-钙溶液，混匀静置；(2)将混合物45-47℃热激处理5-9分钟；(3)向经热激处理的混合物加入W5溶液，每100μl柑橘原生质体对应W5溶液440μl，混匀后离心留取沉淀物；(4)向获得的沉淀物加入WI溶液，每100μl柑橘原生质体对应WI溶液600-800μl，培养24至48小时。本发明提供的原生质体转化方法，转化率大幅提高。

Description

一种柑橘原生质体转化及提纯方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种柑橘原生质体转化及提纯方法。
背景技术
我国是世界柑橘的重要起源地之一，种质资源丰富，类型多样。随着人们生活质量的不断提高，果实品质已经成为果品市场竞争力的核心。柑橘以其食用方便、风味独特及营养价值丰富而倍受消费者的青睐，然而珠心胚、性器官败育、童期长、遗传上高度杂合等生物学特征导致柑橘育种工作进展缓慢，短时间难以满足市场需求的优良品种。随着基因工程的迅速发展，转基因技术为柑橘品种遗传改良提供了一条新途径。
瞬时表达技术指的是在短时间内将目标基因转入到受体细胞，在受体细胞内建立起高效的表达系统，获得该目标基因短暂而高水平表达的技术。相较于稳定基因表达技术，瞬时表达技术转染中，外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，并未与受体基因组染色体相整合，为基因-蛋白质研究提供了一种快速、方便的方法，并且对稳定遗传进行基因功能鉴定给与了极大的参考意义。
柑橘原生质体首次分离由Vardietal.(1975)完成后，邓秀新等完善分离提纯技术后，柑橘原生质体融合及植株再生等技术日趋成熟，而原生质体瞬时表达技术却比较滞后，张倩(2009)利用电击诱导柑橘不同品种原生质体转化，但转化效率最高仅10.9％。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种原生质体转化方法，利用聚乙二醇热激处理诱导原生质体瞬时转化，极大地提高了瞬时转化效率；由于瞬时转化效率得到了极大的提高，因此首次成功在柑橘果实果皮和汁胞材料上，实现了原生质体的分离与瞬时转化。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种柑橘原生质体转化方法，包括以下步骤：
(1)向柑橘原生质体中添加质粒和浓度在40-60％之间的聚乙二醇-钙溶液，每100μl柑橘原生质体加入10-15μg质粒和110μl所述聚乙二醇-钙溶液，混匀静置；
(2)将步骤(1)中获得的混合物45-47℃热激处理5-9分钟；
(3)向步骤(2)中经热激处理的混合物加入W5溶液，每100μl柑橘原生质体对应W5溶液440μl，混匀后离心留取沉淀物；
(4)向步骤(3)中获得的沉淀物加入WI溶液，每100μl柑橘原生质体对应WI溶液600-800μl，培养24至48小时。
优选地，所述柑橘原生质体转化方法，其所述柑橘原生质体按照如下方法获得：
A、将柑橘材料细碎后，加入0.7M甘露醇水溶液浸泡20至30分钟；
B、用酶液置换所述甘露醇水溶液，真空渗透30分钟后，水平摇床40rpm处理5h，摇晃混匀并滤除酶液，再加入等体积的W5溶液，水平摇床80rpm处理30分钟，过滤得到粗提物；
C、将步骤B中获得的粗提物离心，沉淀即为原生质体。
优选地，所述柑橘原生质体转化方法，其所述柑橘原生质体按照如下方法精制处理：
加入W5溶液洗涤，并用预冷的MMg溶液调整原生质体密度在2-3×106个/ml；
优选地，所述柑橘原生质体转化方法，其所述柑橘材料为幼嫩叶片、悬浮培养愈伤、有色层果皮或成熟汁胞粒。
优选地，所述柑橘原生质体转化方法，其所述酶液含纤维素酶、果胶酶、0.7M甘露醇、0.01M2-(N-吗啉)乙磺酸-水合物、1mMCaCl2、以及0.1％牛血清白蛋白。
优选地，所述柑橘原生质体转化方法，其所述W5溶液含154mMNaCl、125mMCaCl2、5mMKCl和2mMMES，PH调至5.8。
优选地，所述柑橘原生质体转化方法，其所述MMg溶液含0.7M甘露醇、15mMMgCl2和24mMMES，PH调至5.8。
优选地，所述柑橘原生质体转化方法，其所述WI溶液含0.7M甘露醇、4mMMES和4mMKCl，PH调至5.8。总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，本发明旨在利用PEG诱导原生质体瞬时转化，从PEG种类、PEG浓度、质粒使用量、金属浴热激时间以及转化后共培养时间等变量来进行探索，大大地提高了柑橘原生质体瞬时转化效率，为柑橘基因功能研究提供良好的技术平台。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明的原生质体分离提纯方法中，酶液现配现用，采用真空渗透加速酶解，原生质体二次释放，极大地缩短了酶解时间，减少了酶液对原生质体的伤害，提高了原生质体的均一性。
2)本发明的原生质体瞬时转化方法中，优化了一系列转化条件，明确了PEG种类为PEG4000，PEG4000浓度为40％，转化质粒使用量为10-15μg，转化时47℃金属浴时间为5-7分钟，以及转化后原生质体共培养时间为36-42h，大幅提高了柑橘原生质体瞬时转化效率。
3)柑橘原生质体瞬时转化方法可应用于亚细胞定位、双分子荧光互补等试验，为柑橘基因瞬时功能验证提供了良好的平台，也为柑橘育种工作提供了便捷的技术。
附图说明
图1是实施例的纽荷尔脐橙汁胞原生质体瞬时转化电镜照片；
图2是实施例2制备的原生质体电镜照片，其中图2A为叶肉提取的原生质体；图2B为愈伤组织提取的原生质体；图2C为汁胞提取的原生质体；图2D为果皮提取的原生质体；
图3是实施例2叶肉提取的原生质体转化结果图，其中图3A为转化后共培养的叶肉原生质体明场；图3B为转化后共培养的叶肉原生质体荧光；
图4是实施例3转化质粒使用量对柑橘原生质体瞬时转化率的影响结果图；
图5是实施例4PEG-Ca溶液中PEG种类对柑橘原生质体瞬时转化率的影响结果图；
图6是实施例5PEG4000的浓度对柑橘原生质体瞬时转化率的影响结果图；
图7是实施例6金属浴时间对柑橘原生质体瞬时转化率的影响结果图；
图8是实施例7共培养时间对柑橘原生质体瞬时转化率的影响结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
(1)向柑橘原生质体中添加质粒和聚乙二醇-钙溶液，每100μl柑橘原生质体加入10-20μg质粒和110μl聚乙二醇-钙溶液，混匀静置。所述质粒优选用量15μg，柑橘原生质体瞬时转化效率最高。
所述聚乙二醇-钙溶液含质量分数40％至60％的聚乙二醇、0.4M至0.6M的甘露醇和0.1M至0.3M的CaCl2。所述聚乙二醇分子量在4k至8k之间，优选4k。所述聚乙二醇浓度优选40％。
所述原生质体按照如下步骤制备：
A、将柑橘材料细碎后，加入0.7M甘露醇水溶液浸泡20至30分钟；
所述柑橘材料，优选柑橘幼嫩叶片、愈伤组织、果皮或汁胞1-2g。优选地，所述幼嫩叶片是手术刀片划成0.5-1mm的条状叶片、愈伤是悬浮培养30天左右的细碎化愈伤材料、有色层果皮是手术刀片切取成熟果子1cm×2cm大小的有色层果皮；成熟汁胞是镊子夹取成熟果子赤道面的汁胞粒。
B、酶解：用酶液置换所述甘露醇水溶液，真空渗透30分钟后，水平摇床40rpm处理5h，摇晃混匀并滤除酶液；再加入等体积的W5溶液洗涤，减少酶液对原生质体的胁迫作用，水平摇床80rpm处理30分钟，过滤得到粗提物；
所述酶液含有10mM2-(N-吗啉)乙磺酸-水合物、质量分数2.4％纤维素酶、质量分数1.2％离析酶、质量分数0.1％牛血清白蛋白和1mMCaCl2，余量为0.7M甘露醇，pH值为5.8。所述酶解液中纤维素酶为CelluloseR-10(YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,Japan)，离析酶为MacerozymeR-10(YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,Japan)。
所述W5溶液含154mMNaCl、125mMCaCl2、5mMKCl和2mMMES，PH调至5.8。
C、将步骤B中获得的粗提物离心，沉淀即为原生质体。
具体步骤为：采用325目细胞筛过滤酶解液，收集柑橘酶解底物，加入20mlW5溶液，水平摇床80rpm继续处理30分钟；收集过滤液，100g水平转筒离心5分钟，吸出上清液，沉淀即为原生质体；
优选地，所述原生质体按照如下方法精制处理：
加入W5溶液洗涤，并用预冷的MMg溶液调整原生质体密度在2-3×106个/ml；
具体步骤如下：用10mlW5重悬步骤D中沉淀，轻柔吸打混匀后，使用血细胞计数板统计原生质体密度，并计算原生质体总数，黑暗常温静置1-2h；100g水平转筒离心3分钟，吸出上清液，用预冷的MMg溶液重悬沉淀，并调整原生质体密度至2-3×106个/ml。
所述MMg溶液含0.7M甘露醇、15mMMgCl2和24mMMES，PH调至5.8。
(2)将步骤(1)中或得的混合物45-47℃热激处理6-8分钟；具体方法如下：
将步骤(1)中获得的混合物45-47℃金属浴5-9分钟，优选47℃金属浴7分钟。
(3)向步骤(2)中经热激处理的混合物加入W5溶液，每100μl柑橘原生质体对应W5溶液440μl，混匀后离心留取沉淀物；
(4)向步骤(3)中获得的沉淀物加入WI溶液，每100μl柑橘原生质体对应WI溶液600-800μl，共培养24至48小时，优选36小时。
所述WI溶液含0.7M甘露醇、4mMMES和4mMKCl，PH调至5.8。
作为优选技术方案，所述幼嫩叶片需要用手术刀片细分化至0.5-1mm的条状，悬浮愈伤为培养10-15天的愈伤组织，有色层果皮需要手术刀片切取成熟果子表面1cm×2cm大小，成熟汁胞需要镊子夹取赤道面的汁胞粒。
作为优选技术方案，所述酶解液应该现配现用，建议在加入BSA和CaCl2之前，55℃水浴8-10分钟，以提高酶解效果。
作为优选技术方案，所述酶解液中纤维素酶为CelluloseR-10(YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,Japan)，离析酶为MacerozymeR-10(YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,Japan)。
作为优选技术方案，所述步骤(4)和(5)中收集原生质体的离心管均为50ml大离心管；所述所有离心环节，离心机加速度均为slow。
作为优选技术方案，原生质体在转化前，应该常温黑暗静置1-2h，让其处于零胁迫状态，方便转化。
作为优选技术方案，所述PEG-Ca溶液应该现配现用，建议在步骤(5)过程中配制，且应55℃水浴1-2h让PEG充分溶解。
作为优选技术方案，转化用质粒要求大小10k以下，且要求浓度达1500ng/μl，建议质粒抽提试剂盒为QIAGENplasmidMidiKit(Catno.12143)。
作为优选技术方案，柑橘从酶解环节开始，所有操作步骤应该在避光或弱光环境下完成，以免细胞壁再生。
作为优选技术方案，所有与原生质体接触的枪头，都应该去掉尖头并在火焰上烫过。
本发明所用的转化PEG种类为PEG4000。
本发明所用的转化PEG4000浓度为40％。
本发明所用的转化质粒量为10-15μg。
本发明所用转化时间为5-7分钟。
本发明所用的共培养时间为36-42h。
以下为实施例：
实施例1
本实施例涉及柑橘汁胞原生质体的提纯及转化，柑橘品种为纽荷尔脐橙Citrussinensis(L.)Osbeck，汁胞黄色，采摘自国家果树脱毒种质资源室内保存中心。具体包括如下步骤：
制备原生质体：
A、将采摘的纽荷尔脐橙清洗果皮后，取其赤道面果肉，将剥离出的粒化汁胞置于常温20ml0.7M甘露醇水溶液中预处理20分钟；
B、用10ml酶解液替换出步骤1中甘露醇水溶液，真空渗透30分钟后水平摇床40rpm处理5h，10ml酶液配制方法为先依次加入7.5ml0.93M甘露醇、1ml0.1MMES、0.24gCelluloseRS和0.12gMacerozyme，55℃水浴10分钟后，待其冷却后加入0.01gBSA和10ul1MCaCl2，用无菌蒸馏水定容至10ml；
加入等体积W5溶液，水平摇床60rpm继续处理10分钟，经325目细胞筛过滤酶解液，收集柑橘汁胞酶解底物，加入20mlW5溶液，水平摇床80rpm继续处理30分钟，用325目细胞筛过滤得到粗提物。W5溶液配制方法为5ml1.54MNaCl、6.25ml1MCaCl2、1.25ml0.2MKCl和1ml0.1MMES，用无菌蒸馏水定容至50ml；
C、将步骤B中获得的粗提物使用BeckmanCoulterAvantiJ-26XP离心机100g水平转筒离心5分钟，吸出上清液，沉淀即为原生质体。
试剂准备：
将制备得到的原生质体用10mlW5重悬步骤4中沉淀，轻柔吸打混匀后，使用血细胞计数板统计原生质体密度，并计算原生质体总数，黑暗常温静置1-2h。
配制PEG-Ca溶液，配制方法为称取0.4gPEG4000溶于0.55ml0.4M甘露醇，55℃水浴1-2h至PEG溶液澄清透明，冷却后加入100ul1MCaCl2，用无菌蒸馏水定容至1ml。
100g水平转筒离心3分钟，吸出上清液，用预冷的MMg溶液重悬沉淀，并调整原生质体密度至3×106个/ml，MMg溶液的配制方法为7.5ml0.93M甘露醇、0.3ml0.5MMgCl2和0.4ml0.1MMES，用无菌蒸馏水定容至10ml；
原生质体转化：
(1)2ml离心管内加入15μg质粒，再加入100μl原生质体，混匀后静置10分钟；加入110μlPEG-Ca溶液，轻柔混匀。
(2)将步骤(1)中获得的混合物进行47℃金属浴7分钟；
(3)金属浴结束后，加入440μl预冷的W5溶液，混匀后200g水平转筒离心5分钟，吸出上清液留取沉淀物；
(4)向步骤10中加入800μlWI溶液，常温黑暗环境共培养36h；
镜检观察柑橘原生质体瞬时转化情况，如图1所示。
实施例2
采用不同的柑橘材料，按照实施例1中的步骤制备原生质体，结果如图2所示，其中：图2A为叶肉提取的原生质体；图2B为愈伤组织提取的原生质体；图2C为汁胞提取的原生质体；图2D为果皮提取的原生质体。
将叶肉提取的原生质体，按照实施例1中的方案进行转化，结果如图图3所示，其中图3A为转化后共培养的叶肉原生质体明场；图3B为转化后共培养的叶肉原生质体荧光。
实施例3
方法同实施例1，仅步骤(1)中质粒的使用量分别为：5μg、10μg、15μg和20μg，结果显示质粒使用量为15μg时，柑橘原生质体瞬时转化效率最高，具体瞬时转化结果见图4。
实施例4
方法同实施例1，仅步骤(1)中聚乙二醇分别采用：PEG4000、PEG6000和PEG8000三种聚乙二醇，实验结果显示，PEG4000诱导质粒转化柑橘原生质体效果最佳，具体转化结果见图5。
实施例5
方法同实施例1，仅步骤(1)中聚乙二醇浓度分别为：20％、30％、40％和50％四个梯度，实验结果显示PEG4000浓度为40％时，柑橘原生质体瞬时转化效率最高，具体转化结果见图6。
实施例6
方法同实施例1，仅步骤(2)金属浴时间分别为：3分钟、5分钟、7分钟、9分钟和12分钟五个实验梯度，结果显示47℃热激处理时间为7分钟时，柑橘原生质体瞬时转化率最高，具体转化结果见图7。
实施例7
方法同实施例1，仅步骤(4)仅共培养之间，分别为24小时、27小时、30小时、33小时、36小时、39小时、42小时、45小时、48小时。实验结果显示，转化后共培养原生质体36h，瞬时表达率最高，具体实验结果见图8。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种柑橘原生质体转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向柑橘原生质体中添加质粒和浓度在40-60％之间的聚乙二醇-钙溶液，每100μl柑橘原生质体加入10-15μg质粒和110μl所述聚乙二醇-钙溶液，混匀静置；
(2)将步骤(1)中获得的混合物45-47℃热激处理5-9分钟；
(3)向步骤(2)中经热激处理的混合物加入W5溶液，每100μl柑橘原生质体对应W5溶液440μl，混匀后离心留取沉淀物；
(4)向步骤(3)中获得的沉淀物加入WI溶液，每100μl柑橘原生质体对应WI溶液600-800μl，培养24至48小时。
2.如权利要求1所述的柑橘原生质体转化方法，其特征在于，所述柑橘原生质体按照如下方法获得：
A、将柑橘材料细碎后，加入0.7M甘露醇水溶液浸泡20至30分钟；
B、用酶液置换所述甘露醇水溶液，真空渗透30分钟后，水平摇床40rpm处理5h，摇晃混匀并滤除酶液，再加入等体积的W5溶液，水平摇床80rpm处理30分钟，过滤得到粗提物；
C、将步骤B中获得的粗提物离心，沉淀即为原生质体。
3.如权利要求1或2所述的柑橘原生质体转化方法，其特征在于，所述柑橘原生质体按照如下方法精制处理：
加入W5溶液洗涤，并用预冷的MMg溶液调整原生质体密度在2-3×106个/ml；
4.如权利要求3所述的柑橘原生质体转化方法，其特征在于，所述柑橘材料为幼嫩叶片、悬浮培养愈伤、有色层果皮或成熟汁胞粒。
5.如权利要求3所述的柑橘原生质体转化方法，其特征在于，所述酶液含纤维素酶、果胶酶、0.7M甘露醇、0.01M2-(N-吗啉)乙磺酸-水合物、1mMCaCl2、以及0.1％牛血清白蛋白。
6.如权利要求3所述的柑橘原生质体转化方法，其特征在于，所述W5溶液含154mMNaCl、125mMCaCl2、5mMKCl和2mMMES，PH调至5.8。
7.如权利要求3所述的柑橘原生质体转化方法，其特征在于，所述MMg溶液含0.7M甘露醇、15mMMgCl2和24mMMES，PH调至5.8。
8.如权利要求3所述的柑橘原生质体转化方法，其特征在于，所述WI溶液含0.7M甘露醇、4mMMES和4mMKCl，PH调至5.8。
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