CN105132405B

CN105132405B - 一种不育系快速转育方法

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Publication number: CN105132405B
Application number: CN201510206556.0A
Authority: CN
Inventors: 聂琼; 刘仁祥; 姜超英; 徐如宏; 曾陨涛; 夏范讲
Original assignee: CAREER SERVICE CENTER OF BIT; Guizhou University
Current assignee: CAREER SERVICE CENTER OF BIT; Guizhou University
Priority date: 2015-04-28
Filing date: 2015-04-28
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2035-04-28
Also published as: CN105132405A

Abstract

本发明公开了一种不育系快速转育方法，即通过体细胞杂交和分子标记选择相结合的方法快速转育不育系。属于作物育种技术领域。首先，分离供体（不育）胞质和受体（可育）原生质体；然后，用碘乙酰胺（IOA）处理受体原生质体使其细胞质失活，再按2:1(v/v)的比例混合供体胞质和受体原生质体，采用电融合法或化学融合法使供、受体融合；最后，在适合的培养条件下使融合体再生，选择与受体基因型、表现型一致的不育再生植株，用受体花粉授粉后正常结实的即为受体不育系。

Description

一种不育系快速转育方法

技术领域

本发明涉及一种快速的不育系转育方法，通过体细胞杂交技术和分子标记选择技术相结合的方法快速转育不育系，属于作物育种技术领域。

背景技术

利用雄性不育系制种，可以省去人工去雄这一环节，既节省劳力，又能提高制种质量，降低种子生产成本，还具有较强的知识产权保护功能。雄性不育性受细胞质控制，转育容易。目前，在生产上应用的雄性不育系大多都是经人工转育获得。传统的不育系转育方法是回交转育法，此法简单，易操作。通过已有的雄性不育系(非轮回亲本)和需转育成不育系的材料(轮回亲本)杂交和连续回交5－7代，每代定向选择与轮回亲本性状一致的不育系，一般至少需3-4年才能获的与轮回亲本一样的稳定不育系。传统的不育系转育方法和技术存在的问题：1、周期长。如果一年两季，也至少需3-4年。2、成本高。杂交一次，回交5－7代，每代定向选择，需较大的人力、物力。近年来，也报道了许多快速获得雄性不育系的方法，如利用分子标记辅助选择回交后代，也大大减少回交代数和种植样本数，节省了劳力和成本，但也至少需2-3年。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种快速的不育系转育方法，通过体细胞杂交技术和分子标记选择技术相结合的方法快速转育不育，以解决现有技术存在的问题。

本发明的技术方案是：一种不育系快速转育方法，材料选择、酶解和离心，得到原生质体和胞质分离；然后通过对供、受体的有效钝化、融合，获得胞质融合体；融合体的培养和再生，最后，通过形态学和分子标记选择获得不育系再生植株。

一种不育系快速转育方法，包含以下步骤：

(1)供受体的原生质体的分离

1)材料：培养50-80天的烟草无菌苗；

2)酶解：1％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.6mol/L甘露醇+0.1％MES的酶液组合，在25-28℃下酶解，离心；

3)胞质体：0.6mol/L甘露醇+15％、30％、45％蔗糖梯度，离心获得胞质体；

(2)非对称融合技术

1)钝化：0.1mM IOA处理受体后离心；

2)化学融合：在25～30℃下,40％的PEG融合20～25min；

3)电融合：以①U’～1.5V；t1:40s；②U_∏50V；t2:50μs；n2和③U”～1.5V；t3:40s的参数融合；

(3)融合体的培养和再生

1)融合体的培养：以DPD培养基培养，50％以上融合体开始分裂后加入新鲜培养基KM8P，此后每周加入渗透压减半的新鲜培养基KM8P；

2)愈伤的增值和分化：增值培养基：1/2MS+2.5mg/L IBA+1.5mg/L KT，分化培养基：MS+0.25mg/LIAA+2.0mg/LKT；

(4)不育系的鉴定筛选

1)基因型：SSR、ISSR分子标记鉴定；

2)表现型：与受体表现性状一致，但不育，能接受受体和其他烟草材料的花粉而结实；

3)倍性：气孔保卫细胞叶绿体计数法。

本发明的有益效果：1、周期较短，1年左右即可获得转育的不育系，缩短转育时间；2、不需要大量的人力及土地，节工省本；3、雄性不育系植株的生长发育、开花结实性状以及配合力都正常；4、雄性不育性稳定，不育株率和不育度均能达到100％。

附图说明

图1为本发明的操作流程图；

图2酶解时间、离心速度对原生质体产质量的影响；

图3原生质体融合过程(聚乙二醇法)；图中1：刚游离出来的叶肉原生质体；2：在PEG的作用下，叶肉原生质体刚发生粘连；3：在高Ca++/高pH作用下原生质体开始融合；4：用CPW-10.5M洗涤原生质体继续融合；5：洗涤后两个原生质体最终融合成为一个细胞；

图4融合体的再生与鉴定。

具体实施方式

1)高产、高活力原生质体制备技术

原生质体制备就是植物细胞脱去细胞壁形成原生质体,它是原生质培养的第一步,同时也是非常关键的一环,原生质体的产量和活力直接影响着原生质体细胞培养的成功与否。就影响原生质体分离时的产量与活力来说,主要应考虑如下因素：植物基因型，制取原生质体的材料，酶的种类及其组合，酶液的渗透压，原生质膜的稳定剂，酶解时间与温度，分离与纯化的方法，离心转速以及时间等。

a、酶解液对烟草原生质体产量和活力的影响

采用目前常用的纤维素酶Cellulase R-10、果胶酶Pectinase Y-23和离析酶Macer-ozyme R-10，设置不同浓度组合探讨酶液对烟草叶肉和愈伤组织原生质体产量和活力的影响。

b、酶解时间对原生质体的影响：

从酶解后2h开始，每隔2h在倒置显微镜下观察原生质体酶解情况并计数。获得最佳酶解时间。

c、离心转速和离心时间的影响

酶液组合和酶解时间取如上实验中最佳值，设置离心转速分别为300r/min、500/min、700/min、1000/min四个转速，分别离心3min和5min。探讨离心转速和离心时间的影响对原生质体产率和活力的影响。

d、渗透压稳定剂浓度影响

选择如上最佳酶组合，酶解时间，离心转速和离心时间，酶解液中甘露醇的浓度分别为0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L(洗涤液中使用同样浓度的甘露醇溶液)制备原生质体，观察原生质体的产率和活率情况，选择最适渗透压稳定剂浓度。

e、酶解温度对原生质体产量的影响

依据上述试验所获得的最佳条件，设15℃、20℃、25℃、30℃、35℃5个温度处理.比较在不同温度条件下叶片原生质体的产量，获得最佳酶解温度。

通过以上各影响因素的优化，获得制备高活力、高产量的原生质体制备技术体系。

2)设置与原生质体等渗的蔗糖梯度密度，不同的超速离心转速与离心时间，探索获得高纯度、高活力的供体胞质体的分离方法。

3)胞质-原生质体非对称融合技术的优化：

a.碘乙酰胺钝化受体原生质体

设置不同的碘乙酰胺(IOA)浓度和处理方法处理原生质体，探索烟草原生质体钝化的临界处理剂量。

b.用聚乙二醇(PEG-高钙高PH)法诱导胞质-原生质体融合

对融合时PEG的浓度、PEG用量、融合时间及融合温度进行优化，得到一种融合率较高的方法。

c、采用Multiporator多功能电转电融合仪，优化融合参数。

通过以上各影响因素的优化，获得最佳融合技术，提高胞质-原生质体融合率。

4)融合体再生体系的建立

a、培养基的选择：

选择KM8P、DPD、MS培养基为基础培养基，进行液体浅层培养。综合比较培养效果及成本，选择最佳培养基。

b、培养方法的选择

利用最佳培养基进行液体浅层培养和液体一固体双层培养，检测融合体形成细胞团的起始时间和细胞团个数，对比分析不同培养方法对融合体再生的影响。

c、开展不同激素组合对融合体细胞分裂和克隆形成的影晌的研究

以最佳培养基为基础，添加不同浓度的NAA，2,4-D，6-BA三种激素，培养融合体，根据原生质体的分裂和生长情况来选择最有利于融合体分离和克隆的激素配比。

d、获得微小愈伤后用已建立的烟草愈伤组织扩繁、分化和生根培养基获得融合体再生植株。

5)不育系的鉴定筛选

a.分子标记筛选与受体基因型一致的再生植株。

b.气孔保卫细胞叶绿体数法鉴定再生植株的倍性。

C.表型及育性鉴定。

实施例

烟草叶肉原生质体制备技术的优化

1.1不同酶液组合对原生质体产量和活力的影响

酶解是原生质体游离中最重要的一步，本实验中，以K326叶片为材料，在其他条件一致的情况下，设计了6种不同的酶浓度组合(表1)，其原生质体分裂情况如下：

表1酶液浓度对烟草叶肉原生质体产量和活力的影响

注：其它酶液成分为0.1％MES+0.6mol/L甘露醇+CPW盐，PH5.8.“+”指很少，“++”指较少，“++”指较多，“++++”指极多，下同。

由表1数据可从原生质体产量、活力、细胞碎片、成本等多方面综合考虑，烟草原生质体分离的最佳酶液组合为纤维素酶Cellulase R-10的浓度为1.0％，果胶酶PectinaseY-23的浓度为0.5％。

不同酶解时间对原生质体产量和活力的影响

由图2所示：随着酶解时间的增加，原生质体产量不断提高，其活率则有逐步降低的趋势，当酶解时间为6h时，原生质体的产量达到最高，再延长时间，原生质体产量不仅不再提高，反而急速下降(图2所示1～5)，且其活率继续下降。因此，最佳酶解时间为6h。

不同离心转速和离心时间对原生质体游离的影响

在原生质体游离中，许多外界物理因子，也是影响原生质体游离产率和完整率的重要因素。其中在原生质体纯化中，离心是关键的步骤，而在离心中，离心转速和离心时间则是决定因子。

表2不同离心速度及离心时间对烟草原生质体产量和活力的影响

注：酶成分为1％纤维素酶Cellulase R-10，果胶酶Pectinase Y-23，酶解时间为6h，其他条件同上。

表2结果显示，离心转速为700r/min，离心7min是获得的原生质体产率最高而且完整率相对适中(如附图2中7～9)。

图2说明：1.酶解2h原生质体较少；2.酶解4h原生质体稍多；3.酶解6h原生质体量达到最佳；4.酶解8h原生质体较少，破碎原生质体增加；5.酶解10h原生质体大幅减少，破碎率剧增。6.用血球计数板对原生质体进行计数。7.离心速度过低(300r/min,3min)原生质体产量较少；8.离心速度适中(700r/min,3min)原生质体产量达到理想状态；9.离心速度过大(1000r/min,5min)原生质体破碎率增加。10.酶液为1.0％Cellulase R-10+0.5％Pectinase Y-23，酶解6h,700r/min离心洗涤的原生质体(10×)；11,12.酶液为1.0％Cellulase R-10+0.5％Pectinase Y-23，酶解6h,700r/min离心洗涤的原生质体(40×)。

不同基因型材料对原生质体产量和活力的影响

材料的基因型不同，分离的原生质体产量和活力也有一定的差异，以实验室60d苗龄无菌组培苗为材料分离原生质体，结果见表3

表3不同基因型材料对原生质体游离产量和活力的影响

注：酶液组合为酶成分为1％纤维素酶Cellulase R-10，果胶酶Pectinase Y-23，0.6mol/L甘露醇，酶解时间为6h，其它条件同上。

由表3可知，在相同的酶解条件下,不同基因型材料对烟草原生质体游离的效果相差较大。故此认为,在相同的解离条件下，烟草叶肉原生质体的分离效果与供体材料的基因型有关。生理状态相近的供体组织因基因型不同而在产生原生质体的能力上存在明显差异。

碘乙酰胺(IOA)对烟草原生质体的钝化作用

IOA浓度设置0.1mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1.0mM 5种，将不同浓度的IOA(溶于DPD培养基中，pH＝5.8)过滤灭菌后，分别取5ml于三支离心管中并做标记，共15支，然后吸取1ml密度为1.0×10⁵个/ml的原生质体加于各离心管中与IOA溶液摇匀。各浓度的三支分别进行不静置直接700r/min离心5min，静置5min后700r/min离心5min以及静置3min后700r/min离心2min 3种操作，离心后弃上清液，用DPD培养基洗涤1次后，加DPD培养基混匀为1ml，取一滴原生质体悬浮液于载玻片上测定其活力，其余转入一次性无菌塑料小培养皿(直径3cm)中，使其刚好铺成一层，25～28℃，黑暗下进行液体浅层培养。以不做钝化处理为对照。每隔2d放置于倒置显微镜下观察其形态及分裂情况。

观察统计培养前原生质体活力、细胞破碎情况及培养4d后原生质体活力、细胞破碎程度、细胞分裂与临界状态原生质体的情况(下同)，获得不同浓度IOA及其不同处理下对烟草原生质体的钝化效果如表4。结果表明：以0.1mM的IOA静置3min后700r/min离心2min的处理为IOA对烟草原生质体钝化的临界处理。在此处理下，无细胞分裂出现，临界状态下的原生质体所占比例最高，且细胞破碎程度相对较低，有利于实现较高比例的原生质体间不对称融合。

表4不同浓度碘乙酰胺溶液对烟草原生质体的钝化效果

注：浓度后的(1)表示不静置直接700r/min离心5min，(2)表示静置5min后700r/min离心5min，(3)表示静置3min后700r/min离心2min；“+”指较少，“++”指较多，“+++”指很多，“++++”指极多，统计结果均为3次实验所得平均值，下同。

胞质融合

3.1化学融合法(聚乙二醇法)

取分离提纯的浓度为3×10⁵个/m1左右的胞质体(供体)和IOA钝化后的原生质体(受体)悬浮液各50μL混匀，滴入30mm培养皿中，静置2min使原生质体在皿底形成一薄层。用移液枪将60μL 40％PEG诱融剂溶液从相对的方向滴在悬浮液上，静置20min，此时可在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连，然后加入0.5ml PEG洗涤液(即高Ca++/高pH液)洗涤10min，依次间隔5min加入0.5ml、1ml和2ml CPW-10.5M洗涤，最后用DPD液体培养基洗涤1～2次，并将浓度调到2×10⁵个/m1左右即可进行培养。融合率始终保持在24％以上，甚至可以接近30％的融合率。双融合率为23％左右。

物理融合法(电融合)

以0.7M的山梨醇稀释胞质体(供体)和IOA钝化后的原生质体(受体)悬浮液，使其浓度为3×10⁵个/m1左右，各取100μL混匀注入融合杯的底部，插入电极，小心拧紧入位，放电进行融合，第一步和第三步的融合参数为：交流电压U/和U//为1.5V，持续时间t1和t3为40s；第二步的融合参数为：脉冲电压U∏为55V，脉冲持续时间t2为50μs，融合脉冲次数n为2。融合率最高能达到43％，其中双融合率为24％左右。融合后用DPD液体培养基洗涤1～2次，并将浓度调到2×10⁵个/m1左右即可进行培养。

融合体培养及植株再生

取1ml用DPD培养基(含2,4-D+NAA+6-BA)稀释的融合体于直径3cm的培养皿使其刚好铺成一层，于25～28℃，黑暗下进行液体浅层培养。当观察到50％以上的细胞进入第一次分裂时,向每培养皿中加入300μL新鲜KM8P培养基，1周后加入渗透压减半的新鲜KM8P培养基500ul，并加入几粒活性炭，1周之后加入KM8P培养基500ul和50ul柠檬酸，出现微小愈伤后统计植板率,同时转为光照12h/d、光强为1000lx下培养。微小愈伤长到2mm左右时转移到增值培养基(1/2MS+IBA+KT)中，促使愈伤组织生长,当愈伤组织长到约5-8mm时,把愈伤组织转移到分化培养基(MS+IAA+KT)诱导不定芽形成。当不定芽长至1～2cm时,将其切下,插入无激素的MS培养基中,使再生植株正常生长并生根。待根系形成并伸长至2～3cm时,洗尽根部残留的培养基,移栽于装有经高温灭菌的基质营养钵中，当有5-6片真叶时，剪叶炼苗(剪下的叶用于DNA的提取)，形成壮苗后移栽于大田。

融合体再生植株的鉴定及不育系的筛选

5.1形态学鉴定

移栽到大田后15d开始进行田间植株的农艺性状、生长势、育性的观察，与供、受体比较。选择与受体性状一致，但不育的植株。

倍性鉴定

从第5片真叶上撕取烟叶下表皮置于载玻片上,用1％碘-碘化钾染色,加上盖玻片后，在显微镜下观察计数,每片叶随机选取5个气孔观察其保卫细胞叶绿体数,取其平均值。筛选叶绿体数则在14个以上26个以下的植株。前人的研究表明：单倍体95％以上的叶绿体数在14个以下,双倍体95％以上的叶绿体数则在14个以上26个以下，大于26的基本为多倍体。在第5叶展开时鉴定，其准确率达95％以上。

SSR和ISSR标记分析

我们筛选出12对SSR引物和5个ISSR引物在K326及其不育系MS K326之间有差异条带。

利用此17个引物对不育再生植株进行扩增。筛选与受体条带完全相同(或含有MSK326特有条带)的再生不育株。

不育系的繁殖

选择农艺性状、分子扩增条带与受体一致，气孔保卫细胞叶绿体数则在14个以上26个以下的不育植株，用受体的花粉给其授粉即可获得不育系。

Claims

1.一种不育系快速转育方法，其特征在于：材料选择、酶解和离心，得到原生质体；然后通过对受体的有效钝化、融合，获得胞质融合体；融合体的培养和再生，最后，通过形态学和分子标记选择获得不育系再生植株；具体包含以下步骤：（1）供受体的原生质体的分离：1)材料：培养50-80天的烟草无菌苗；2) 酶解：1%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.6mol/L甘露醇+0.1%MES的酶液组合，在25-28℃下酶解，离心；3）原生质体：0.6mol/L甘露醇+15%、30%、45%蔗糖梯度，离心获得原生质体；（2）非对称融合技术：1）钝化：0.1mM IOA处理受体后离心；2）化学融合：在25～30℃下，40%的PEG融合20～25min；3）电融合：第一步和第三步的融合参数为：交流电压U' 和U" 为1.5V，持续时间t1和t3为40s；第二步的融合参数为：脉冲电压U_∏为50V，脉冲持续时间t2为50μs，融合脉冲次数n为2；（3）融合体的培养和再生：1）融合体的培养：以 DPD培养基外加1.0 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA 培养，50%以上融合体开始分裂后加入新鲜培养基KM8P，此后每周加入渗透压减半的新鲜培养基KM8P；2）愈伤的增殖和分化：增殖培养：1/2MS+IBA+KT，分化培养基：MS+IAA+KT；所述的增殖培养基：1/2MS+2.5 mg/L IBA+ 1.5 mg/L KT，分化培养基：MS+0.25 mg/L IAA+2.0 mg/L KT；（4）不育系的鉴定筛选：1）基因型：SSR、ISSR分子标记鉴定；2）表现型：与受体表现性状一致，但不育，能接受受体和其他烟草材料的花粉而结实；3）倍性：气孔保卫细胞叶绿体计数法。