CN104830896A - 一种用植物花瓣细胞原生质体表达蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用植物花瓣细胞原生质体表达蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(1)以植物花瓣作为材料，酶解获得花瓣细胞原生质体；(2)将所述花瓣细胞原生质体在2-8℃静置20-40min；(3)用PEG和Ca²⁺介导法将质粒转化入原生质体，表达目的蛋白。与现有技术相比，本发明的有益效果是可以在短时间内表达目的蛋白，此原生质体蛋白表达系统可用于目的蛋白的亚细胞定位、蛋白分子的相互作用的研究。原生质体活性正常，经目的蛋白表达检测，可用于研究活体细胞内基因转录水平、蛋白表达水平、物质代谢水平的变化，是一种方便而快捷的研究目的基因功能的方法。

Description

一种用植物花瓣细胞原生质体表达蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种用植物花瓣细胞原生质体表达蛋白的方法及其应用。

背景技术

生物体内的基因大都是通过编码蛋白来行使其功能的。对植物功能基因的研究，终究要归结于蛋白功能的研究。目前基因的研究和功能验证多是通过转基因到模式植物(比如拟南芥、烟草等)来完成的。由于木本植物与草本植物之间的差异，以及物种之间的差异，转基因模式植物所表现出来的表型不一定能反映目的基因在其他植物中的真实功能。以梅花为例，梅花目前没有成熟的遗传转化体系，无法通过获得转基因梅花株系的方法验证基因功能，而且即使将来有了梅花的遗传转化体系，从梅花转基因再生植株到开花也至少需要3年的时间，这些限制了对梅花功能基因的研究。而用植物自身组织制备原生质体表达目的蛋白的方法，研究植物基因功能的优势在于：其一，可以大大缩短实验周期，从原生质体制备到蛋白表达只需2天的时间；其二，可以简化实验操作步骤，使得目的基因的表达可以在2mL离心管里完成；其三，在除去细胞壁的原生质体单个细胞中，可以更直接清楚地观察到目的蛋白的亚细胞定位和动态变化，从而更有利于功能机制的研究。

原生质体的制备选材多样，多以嫩叶、胚芽、愈伤组织等为材料，观赏植物现有的原生质体的制备方法多以愈伤组织为材料，愈伤组织细胞疏松、细胞壁薄，酶解细胞壁较为容易。但是，愈伤组织的细胞没有组织器官特异性，用它来研究花香和花色等相关基因的功能，不如花瓣细胞接近花朵的真实状态。

因此，有必要提供一种外源蛋白转化表达效果好、操作简单，缩短研究周期的在植物原生质体中表达蛋白的方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种用植物花瓣细胞原生质体表达蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

(1)以植物花瓣作为材料，酶解获得花瓣细胞原生质体；

(2)将所述花瓣细胞原生质体在2-8℃静置20-40min进行冷处理；

(3)用PEG和Ca²⁺介导法将质粒转化入原生质体，表达目的蛋白。

优选的情况下，为了获得更高的质粒转化效率，将所述花瓣细胞原生质体在2-4℃静置25-35min进行冷处理。

可选的，酶解中所使用的酶解液的组成成分包括：

1.5-2.5％(m/v)纤维素酶R-10、1.5-2.5％(m/v)离析酶R-10、0.4M甘露醇、20mM KCl、10mM CaCl₂、pH为5.7的20mM MES、0.1％BSA和5mMβ-巯基乙醇。

可选的，酶解过程包括以下步骤：将所述植物花瓣切割成长度为1-1.5cm，宽度为0.3-0.8mm的细丝，将切割后的花瓣细丝与酶解液在真空条件下接触25-35min，然后于22℃摇床中以45-65rpm的转速酶解2-3小时，获得原生质体。

具体的可以将盛有酶解液和花瓣细丝的容器置于真空泵中，开盖抽真空，使得酶解液与花瓣的组织细胞充分接触，从而提高酶解的效率，而后再将容器从真空泵中取出后盖上盖，置于摇床中继续进行酶解。

本发明所提供的方法还包括在获得原生质体后对含有原生质体的酶解液进行过滤收集能够穿过滤网的组分，滤网的尺寸优选为200目，例如，可以为200目的尼龙布。

本发明所提供的方法还包括在过滤后将所述能够穿过滤网的组分在60-100g的离心力下，离心3-5-min收集原生质体，再利用细胞清洗液对原生质体进行清洗，清洗的方法为用细胞清洗液轻柔地悬起原生质体，随后在60-100g的离心力下，离心3-5min收集原生质体，弃去上清。

其中，所述细胞清洗液的配方为：154mM NaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl、2mM MES，pH值为5.7。

可选的，在步骤(2)中，在所述冷却处理过程中将花瓣细胞原生质体悬浮于细胞清洗液中。

可选的，在步骤(3)中，首先用转化悬浮液将冷处理后的原生质体悬浮，所述转化悬浮液的pH值为5.7，组成成分包括：0.4M甘露醇、15mM MgCl₂、4mM MES。

可选的，转化过程包括以下步骤：

离心收集冷处理后的原生质体，用转化悬浮液进行悬浮，使原生质体的浓度达到3-8×10⁶个/mL后利用PEG和Ca²⁺介导质粒转化。

其中，质粒转化过程中所使用的PEG转化液的组成包括：40％(m/v)PEG 4000、0.2M甘露醇、100mM CaCl₂

可选的，所述花瓣为梅花花瓣或碧桃花花瓣，优选的情况下，所述花瓣为梅花花瓣。

可选的，本发明所述的酶解液的制备过程包括：按照酶解液中各组分的终浓度为1.5-1.25％(m/v)纤维素酶R-10、1.5-2.5％(m/v)离析酶R-10、0.4M甘露醇、20mM KCl、10mM CaCl₂和20mMMES(pH5.7)(MES起稳定溶液pH的作用，母液配置过程中调节pH至5.7)，在55℃水浴锅加热10分钟，冷却到20-25℃后加入BSA至终浓度为0.1％(m/v)。

本发明所提供的方法通过低温、PEG、Ca²⁺处理原生质体，提高了质粒转化细胞的效率。

本发明所述的方法还包括将完成质粒转化的原生质体静置于22℃恒温培养箱，培养12-30个小时，表达目的蛋白。

在本发明所提供的方法中，经检测成功表达外源基因的原生质体可以接着做后续实验。如果表达的外源蛋白融合荧光蛋白GFP标签，可以直接在激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白在原生质体中表达的情况，并可以动态观察蛋白在不同处理条件下的反应；融合其它标签的目的蛋白可以用蛋白免疫印迹实验检测原生质体中目的蛋白表达的情况。

在本发明的一种实施方式中，用梅花花瓣原生质体表达目的蛋白，从而验证与花朵的花香、花色以及其它在细胞水平上能够检测的表型相关的基因的功能。

本发明还提供了所述方法在利用植物细胞表达外源蛋白中的应用。

本发明还提供了所述方法在目的基因功能研究中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是可以在短时间内(外源质粒在原生质体内表达蛋白需要12-30个小时)表达目的蛋白，此原生质体蛋白表达系统可用于目的蛋白的亚细胞定位、蛋白分子的相互作用的研究。原生质体活性正常，经目的蛋白表达检测，可用于研究活体细胞内基因转录水平、蛋白表达水平、物质代谢水平的变化，是一种方便而快捷的研究目的基因功能的方法。

附图说明

图1为梅花花瓣原生质体的制备和目的蛋白表达的情况。

a为梅花材料的选择、b为花瓣的分离、c为花瓣的叠放、d为花瓣切成细丝的状态。

e为在20×激光共聚焦显微镜下观察到的原生质体的形态，标尺为200μm，从左到右分别为：484nm激发光下、明场下、合成后观察到的原生质体中绿色荧光蛋白GFP表达的情况。

图2为碧桃花瓣原生质体的制备和目的蛋白表达的情况。

a为碧桃花朵材料的选择、b为花瓣的分离、c为花瓣的叠放、d为切成的花瓣细丝在酶解液中酶解的状态。

e为在20×激光共聚焦显微镜下观察到的原生质体的形态，标尺为200μm。从左到右分别为：484nm激发光下、明场下、合成后观察到的原生质体中绿色荧光蛋白GFP表达的情况。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1

下面以梅花品种“长蕊绿萼”的花瓣为材料，以pSuper启动子驱动的编码绿色荧光蛋白的载体pSuper1300-GFP为待转化外源目的基因，结合附图对本发明做进一步说明。

组织处理：选取六朵新盛开的梅花花朵(如图1a)，摘下花瓣(如图1b)，将10-20片花瓣叠在一起(如图1c)，用刀片将花瓣切成细丝(长度为1-1.5cm，宽度为0.3-0.8mm如图1d)，切得越细，越有利于酶解；

酶解：配置好的酶解液20mL(2％(m/v)纤维素酶R-10、2％(m/v)离析酶R-10、0.4M甘露醇、20mM KCl、10mM CaCl₂、pH为5.7的20mM MES、0.1％(m/v)BSA和5mMβ-巯基乙醇)加入到90mm半径的玻璃培养皿中，将切好的花瓣细丝转移到酶解液中，用镊子使花瓣细丝与酶解液充分接触，抽真空30分钟后盖上培养皿盖，置22℃摇床60rpm转速，酶解2小时，使细胞释放出来；

细胞收集：用200目的尼龙布过滤含原生质体的酶解液到50mL塑料离心管中，100g，水平转头，离心3分钟(离心机的升降速率都设置成最低档)，将原生质体收集于管底；

细胞清洗：弃上清，加入10mL细胞清洗液(154mM NaCl、125mMCaCl₂、5mM KCl、2mM MES，pH值为5.7。)，重悬原生质体，100g离心3分钟，收集原生质体；

低温处理原生质体：弃上清，加入10mL预冷至4℃的细胞清洗液，再次重悬原生质体，4℃静置30分钟，100g离心3分钟，弃上清；

PEG介导质粒转化细胞：用适量转化悬浮液(pH值为5.7，组成成分包括：0.4M甘露醇、15mM MgCl₂、4mM MES)悬起原生质体(六朵花约2mL)，镜检，使原生质体的浓度达到5×10⁶个/mL，转化反应在2mL圆底塑料离心管内进行，取200μL原生质体，加入20μL(浓度为1-2μg/μL)质粒pSuper1300-GFP，轻轻颠倒混匀，加入220μL PEG转化液(PEG转化液的组成成分包括：40％PEG 4000(m/v)、0.2M甘露醇、100mM CaCl₂)，混匀，静置反应10分钟后，加入800μL细胞清洗液终止反应；

细胞清洗：100g离心3分钟，收集原生质体，并用1mL细胞清洗液重悬原生质体，离心，弃上清；

细胞培养：将清洗好的原生质体再次悬浮在1mL细胞清洗液中，在22℃恒温培养箱中静置培养20小时；

镜检观察：100g离心3分钟，收集原生质体，去掉部分上清(剩余约100μL左右)，悬起原生质体，吸取15μL细胞悬浮液于载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞的状态和蛋白表达的情况。

如图1e，是在20×激光共聚焦显微镜下观察到的原生质体的形态和绿色荧光蛋白GFP表达的情况，标尺为200μm，从左到右分别是：484nm激发光下、明场下、合成后所得的图片。从图中可以看出利用本方法制备的原生质体活性好，运用上述的PEG和Ca²⁺介导质粒转化细胞的方法可以正常地表达外源目的基因，经统计转化效率约为90％。

实施例2

本实施例用于说明碧桃花瓣原生质体的制备和外源绿色荧光蛋白GFP的表达情况。方法与实施例1梅花花瓣原生质体的制备和外源基因转化相同(见图2)。

如图2e所示，是在20×激光共聚焦显微镜下观察到的碧桃花瓣原生质体的形态和绿色荧光蛋白GFP表达的情况，标尺为200μm。从左到右分别是：484nm激发光下、明场下、合成后所得的图片。经统计，转化效率约为85％，因此本套方法也非常适用于碧桃花瓣原生质体的制备和外源目的基因表达。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种用植物花瓣细胞原生质体表达蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)以植物花瓣作为材料，酶解获得花瓣细胞原生质体；

(2)将所述花瓣细胞原生质体在2-8℃静置20-40min进行冷处理；

(3)用PEG和Ca²⁺介导法将质粒转化入原生质体，表达目的蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述花瓣细胞原生质体在2-4℃静置25-35min进行冷处理。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，酶解中所使用的酶解液组成成分包括：

1.5-2.5％纤维素酶R-10、1.5-2.5％离析酶R-10、0.4M甘露醇、20mM KCl、10mM CaCl₂、pH为5.7的20mM MES、0.1％BSA和5mMβ-巯基乙醇。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，酶解过程包括以下步骤：

将所述植物花瓣切割成长度为1-1.5cm，宽度为0.3-0.8mm的细丝，将切割后的花瓣细丝与酶解液在真空条件下接触25-35min，然后于22℃摇床中以45-65rpm的转速酶解2-3小时获得原生质体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述冷处理过程中将花瓣细胞原生质体悬浮于细胞清洗液中，所述细胞清洗液的配方为：154mM NaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl、2mM MES，pH值为5.7。

6.根据权利要求1、2、4或5所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，首先用转化悬浮液将冷处理后的原生质体悬浮，所述转化悬浮液的pH值为5.7，组成成分包括：0.4M甘露醇、15mM MgCl₂、4mM MES。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

离心收集冷处理后的原生质体，用转化悬浮液进行悬浮，使原生质体的浓度达到3-8×10⁶个/mL后利用PEG和Ca²⁺介导质粒转化。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述花瓣为梅花花瓣。

9.权利要求1-8中所述的方法在利用植物细胞表达外源蛋白中的应用。

10.权利要求1-8中所述的方法在目的基因功能研究中的应用。