CN109337859A

CN109337859A - 一种分离细胞表面囊泡的方法

Info

Publication number: CN109337859A
Application number: CN201811171300.0A
Authority: CN
Inventors: 陈勇; 唐其省; 张晓君
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2018-10-08
Filing date: 2018-10-08
Publication date: 2019-02-15

Abstract

本发明提供了本发明提供了一种细胞表面囊泡的分离方法，包括如下步骤：1)将贴壁细胞种植在培养皿或培养瓶中，孵育24‑48小时，使细胞达到80％‑90％的融合度；2)使用0.01％‑2％Triton X‑100在4‑37℃温度下处理步骤1)中的贴壁细胞5‑30分钟；3)加入缓冲液并使其沿培养皿或培养瓶壁流入培养皿或培养瓶底部，之后，从底部吸除培养皿或培养瓶内的液体，重复上述操作2‑3次；4)加入缓冲液至培养皿或培养瓶内，将培养皿或培养瓶在水平面上轻轻摇晃；5)吸取步骤4)中的培养皿或培养瓶底部液体并转移至离心管中，低速离心，收集上清并低温保存。本发明提供的方法可以有效简单地分离细胞表面囊泡。

Description

一种分离细胞表面囊泡的方法

技术领域

本发明涉及生物分离技术领域，具体涉及一种分离细胞表面囊泡的方法。

背景技术

近十年来，由细胞释放到细胞外或血浆中而进入血液循环、被称为“细胞外囊泡”(extracellular vesicles)的细胞微纳米结构得到广泛关注和研究。大多数细胞在特定刺激下能够释放“细胞外囊泡”，包括各种免疫细胞、肿瘤细胞、血小板、内皮细胞等。根据尺寸、形成机制和表面标志物等的不同，“细胞外囊泡”主要分为50-100纳米的外泌体(exosome)、约0.1-1微米的微泡(microvesicle)或微颗粒(microparticle)和1-5微米的凋亡小体(apoptotic body)三类。它们具有一些共同的表面标志物和一些特异性的表面标志物。而且，“细胞外囊泡”还具有母体细胞上所特有的某些分子，如特异性抗原、酶、表面受体、粘附分子和信号分子以及miRNA等，因此，“细胞外囊泡”被认为是一种新的细胞间通讯方式，能远距离调节细胞的粘附、迁移、分化、衰老和凋亡甚至病毒感染等，与自身免疫疾病、心血管疾病、神经性疾病和多种癌症等相关。

在未刺激的情况下，许多种动物细胞的质膜表面就存在着微纳米尺度的囊泡(即“细胞表面囊泡”或cell-bound membrane vesicles)。一直以来，在以往的文献报道中，由于具有相似的尺寸和形貌这些“细胞表面囊泡”被是想当然地当作是“细胞外囊泡”释放前的前体物。近期的研究报道证实，“细胞表面囊泡”根本不是“细胞外囊泡”释放前的前体物，而很可能是不同于“细胞外囊泡”的一种具有特殊形态、结构和特性、甚至功能的新型未知囊泡。然而，由于缺乏有效的分离方法，目前对于这种“细胞表面囊泡”的组成、结构和功能等几乎一无所知。

“细胞外囊泡”已被释放到细胞外液体中，相对来说非常容易分离和纯化(已建立较完善的分离、纯化方法)，得到广泛、深入的研究，近几年来甚至被发展成为新一代的药物载体，得到重视和关注。而“细胞表面囊泡”只存在于细胞表面、不容易分离，至今都没有一个有效的方法将其从细胞质膜上分离出来，目前也尚未有文献公开报道从细胞表面分离出“细胞表面囊泡”的方法(要强调的是，“细胞表面囊泡”不是将细胞膜分子分离出来再体外重新自组装成的那种囊泡)。

发明内容

本发明旨在提供一种细胞表面囊泡的分离方法，能够将细胞表面囊泡从细胞表面分离出来，以利于后续的纯化(或富集)及进一步的成分、结构、功能和应用等的研究，该方法简单、快速、有效。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种细胞表面囊泡的分离方法，包括如下步骤：

1)将贴壁细胞种植在培养皿或培养瓶中，孵育24-48小时，使细胞达到80％-90％的融合度；

2)使用0.01％-2％Triton X-100(即聚乙二醇辛基苯基醚)在4-37℃温度下处理步骤1)中的贴壁细胞5-30分钟；

3)加入磷酸缓冲液(PBS)并使其沿培养皿或培养瓶壁流入培养皿或培养瓶底部，之后，从底部吸除培养皿或培养瓶内的液体，重复上述操作2-3次；

4)加入磷酸缓冲液至培养皿或培养瓶内，将培养皿或培养瓶在水平面上轻轻摇晃；

5)吸取步骤4)中的培养皿或培养瓶底部液体并转移至离心管中，低速离心(1000xg，5分钟)，收集上清并低温保存。

本发明分离得到的细胞表面囊泡，可进行后续的实验或应用，也可使用高速/超高速离心、梯度离心、过滤等传统分离纯化方法进行深度纯化，再开展后续实验或应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的方法解决了以往技术无法将细胞表面囊泡从细胞表面分离出来的问题，同时，，不破坏细胞表面囊泡，无需在分离后对细胞表面囊泡进行体外重组化；

(2)本发明提供的方法操作简单，仅需简单几个步骤操作即可完成。

(3)本发明提供的方法十分快速，耗时较短，可以在30分钟内实现细胞表面囊泡的分离，在1-2小时内实现分离后的细胞表面囊泡的纯化或富集。

(4)本发明提供的方法十分有效。

附图说明

图1为实施例1中的共聚焦显微镜图像，其中，A中的右图为在4℃下0.05％TritonX-100处理HUVEC细胞10分钟的图像，A中的左图为0.05％Triton X-100处理前的对照图像，；B中的右图为在37℃下0.05％Triton X-100处理HUVEC细胞10分钟的图像，B中的左图为0.05％Triton X-100处理前的对照图像。

图2为实施例1中的共聚焦显微镜图像，其中，A为未经Triton X-100处理的对照图像；B为在4℃下0.1％Triton X-100处理HUVEC细胞10分钟的图像；C为在37℃下0.1％TritonX-100处理HUVEC细胞10分钟的图像。

图3为实施例1中的共聚焦显微镜图像，其中，A为未经Triton X-100处理的对照图像；B诶5％Triton X-100在37℃下处理HUVEC细胞10分钟的图像。

图4为实施例2中的囊泡悬浮于PBS缓冲液中的共聚焦显微镜图像。

图5为实施例2中的透射电镜成像图。

具体实施方式

下面以分离人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表面的“细胞表面囊泡”为例，并结合附图，对本发明作进一步地说明。

实例1.不同浓度的Triton X-100分离纯化细胞表面囊泡

1)将5×10⁴个/mL的HUVEC细胞种植在petri dish培养皿中，孵育24-48小时，使细胞达到80％的融合度；

2)将步骤1)中的培养皿放置于倒置荧光共聚焦显微镜的样品台，控制相应的温度(4℃或37℃)，聚焦于特定细胞群，并拍摄图像。

3)分别用不同质量浓度的Triton X-100以不同温度孵育步骤1)中的细胞10分钟。

4)将步骤3)中的培养皿放置于倒置荧光共聚焦显微镜的样品台，控制相应的温度(与步骤3)的孵育温度相同)，聚焦于特定细胞群，并拍摄图像。

其中，步骤3)中的各处理分别为：

处理1：0.05％Triton X-100于4℃下孵育HUVEC细胞10分钟，分别得到孵育前和孵育后的镜像图，分别如图1的A所示。

处理2：0.05％Triton X-100于37℃下孵育HUVEC细胞10分钟，分别得到孵育前和孵育后的镜像图，分别如图1的B所示。

处理3：0.1％Triton X-100于4℃下孵育HUVEC细胞10分钟，分别得到孵育前和孵育后的镜像图，分别如图2中的A、B所示。

处理4：0.1％Triton X-100于37℃下孵育HUVEC细胞10分钟，孵育后的镜像图，分别如图2中的C所示。

处理5：5％Triton X-100于37℃下孵育HUVEC细胞10分钟，分别得到孵育前和孵育后的镜像图，分别如图3中的A、B所示。

本实施例中使用LSM710激光共聚焦显微镜进行成像。

从图1-4可以看出，0.05％、0.1％的Triton X-100分别在4℃或37℃下处理HUVEC细胞，能够剔除细胞的大部分结构而只留下细胞表面囊泡和细胞核，5％Triton X-100能够剔除细胞的大部分结构而只留下细胞表面囊泡和细胞核，但已有部分细胞表面囊泡也被剔除。上述实验结果表明，一定浓度的Triton X-100可以将细胞表面囊泡分离。

实例2细胞表面囊泡的简单分离、纯化和鉴定

1)将5×10⁵个/mL的HUVEC细胞种植在T25培养瓶中，孵育24-48小时，使细胞达到90％的融合度；

2)使用0.1％的Triton X-100在37℃温度下处理步骤1)中的贴壁细胞10分钟；

3)将步骤1)中的培养瓶倾斜一定角度，从顶部滴入磷酸缓冲液(Ph＝7.4)1ml，让其自由流到底部，从底部吸除培养瓶内的液体，反复2-3次，将多余的Triton X-100和被剔除的细胞成分清洗干净；

4)加入2ml的磷酸缓冲液(Ph＝7.4)，将培养瓶放平，轻轻摇晃(注意力度，摇晃过度会导致较多的细胞核脱落)，使大部分细胞表面囊泡脱落(其中不可避免的会含有一些细胞核)；

5)将培养瓶倾斜一定角度，吸取培养瓶底部含有细胞表面囊泡的液体，转移到离心管中，低速离心(1000×g，5分钟)，收集上清(去除了溶液中的细胞核(即沉淀))；

7)取一部分上清，直接用LSM710激光共聚焦显微镜成像，如图4所示；

8)再取一部分上清，磷钨酸染色后，用JEOL JEM-2100透射电子显微镜成像，如图5所示。

从图4和图5可知，共聚焦显微镜和透射电镜都观察到较均匀的几百纳米尺寸的颗粒，说明本方法成功分离到细胞表面囊泡。

综上所述，本发明提供的方法成功有效的分离了细胞表面囊泡。

Claims

1.一种细胞表面囊泡的分离方法，包括如下步骤：

2)使用一定浓度的Triton X-100溶液在一定温度下处理步骤1)中的贴壁细胞一定时间；

3)加入磷酸缓冲液并使其沿培养皿或培养瓶壁流入培养皿或培养瓶底部，之后，从底部吸除培养皿或培养瓶内的液体，重复上述操作2-3次。

2.根据权利要求1所述的一种细胞表面囊泡的分离方法，其特征在于，所述步骤2)的Triton X-100的质量浓度在0.01％-2％范围内。

3.根据权利要求1所述的一种细胞表面囊泡的分离方法，其特征在于，所述步骤2)的处理贴壁细胞的时间为5-30分钟。

4.根据权利要求1所述的一种细胞表面囊泡的分离方法，其特征在于，所述步骤2)的处理贴壁细胞的温度为4-37℃。

5.根据权利要求1所述的一种细胞表面囊泡的分离方法，其特征在于，步骤3)中使磷酸缓冲液沿培养皿或培养瓶流入培养皿或培养瓶底部的方法为：将步骤2)中的培养皿或培养瓶倾斜一定角度，从顶部滴入磷酸缓冲液，让其自由流到培养皿或培养瓶的底部。

6.根据权利要求1所述的一种细胞表面囊泡的分离方法，其特征在于，步骤3)后，加入磷酸缓冲液至培养皿或培养瓶内，将培养皿或培养瓶在水平面上轻轻摇晃，之后，吸取培养皿或培养瓶底部液体并转移至离心管中，低速离心，收集上清并低温保存。

7.根据权利要求6所述的一种细胞表面囊泡的分离方法，其特征在于，所述低速离心的速度为1000xg，时间为5分钟。