CN110607303A - 用于分离精子细胞群的核酸适体及方法 - Google Patents

用于分离精子细胞群的核酸适体及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于分离精子细胞群的核酸适体，所述核酸适体为X和/或Y染色体适体，其中：所述X染色体适体源于人类X染色体着丝粒alpha卫星序列；所述Y染色体适体源于人类Y染色体的长臂末端的卫星III序列。本发明还提供了一种基于所述核酸适体分离精子细胞群的方法，所述方法使用X染色体适体和/或Y染色体适体分离精子，所述方法包括以下步骤：(i)选择人类X或Y染色体序列，筛选出X或Y染色体适体；(ii)将所获得X或Y染色体适体与待分离的精子的PBS溶液共培养。本发明基于核酸适体对精子进行标记筛选，对精子不会造成损失，可在短时间内大批量进行精子分离筛选，得到X精子或Y精子。

Description

用于分离精子细胞群的核酸适体及方法
技术领域
本发明属于遗传技术领域，尤其涉及一种基于核酸适体分离精子细胞群的方法。
背景技术
X精子和Y精子所携带的性染色体不同，这2种类型的精子之间存在着某些性状差异，这就使得利用某种相应的方法将其分离成为可能。目前己有诸多关于X精子和Y精子分离技术的报道。
其中，白蛋白梯度游动分离法的原理基础是：Y精子的体积比X精子小，并且在高密度的人血清白蛋白液柱中向下游动的速度比较快，通过丢弃白蛋白柱上层，收集最底下22％的部分而得到富集Y精子液体。该方法分离得到的Y精子用于受精后产下的男孩比率为70％～80％。然而，在这种方法中，假如给妇女施用克罗米酚柠檬酸盐以促使排卵时，出生的性别比例就会改变，女婴反而达到73％。再者，这一方法只能纯化Y精子群，不能得到X精子群。
精子表面抗原免疫学分离法利用精子细胞表面的H-Y抗原来分离精子。H-Y抗原是一种由Y染色体上的SMCY基因编码的雄性特异性组织相容性抗原，存在于所有含有Y染色体包括Y精子的细胞表面，而X精子由于不含有Y染色体，所以不编码H-Y抗原。Zavos利用单克隆H-Y抗体处理兔和牛的精液，进行人工授精后得到的雌性后代分别为79％和74％(Panayiotis M.Zavos,Ed.S.,Ph.D.Preconception sex determination via intra-vaginal administration of H-Y antisera in rabbits[J].Theriogenology,1983,20(2):235-240)。国内的罗承浩等报道，用H-Y抗原法处理奶牛精子，受精后得到81.8％的雌性率(罗承浩,蔡耀垣,丘陵等.精子性别化对乳牛性别控制的研究试验[J].草食家畜,1992(s1):110-112.)。但这种方法由于用到了抗原，可能会产生免疫原性。
自由电泳分离法根据X精子和Y精子的表面电荷可能存在差别的原理，将精子放入特制的电泳容器中，并加以一定持续电场，使得两种电荷量不同的精子朝着不同的路径泳动而得以分离。应用该方法进行人类精子的分离试验时，用F检验分析表明，分离得到的X精子样本相对纯度较高，而Y精子纯度较低，分离后的精子受到很大的影响，活力大大降低。
离心沉积分离法根据X精子和Y精子在密度、体积和形状方面的差异来分离精子。在一定的溶液中，X精子的沉降速率比Y精子快。但由于X精子本身的差异比Y精子差异大，因为该方法分离得到的XY精子的结果不稳定，缺乏重复性，不同的实验室得到不一致的结果。
精子体积差异分离法依据的原理是X精子体积比Y精子体积要大。基于体积差异这一发现，科研人员研究设计出了一种安装上相差光学系统的流式细胞仪来进行精子分离。该方法吸引人之处在于进行精子分离时不需要DNA染色。但是该方法实际分离并没有达到理论预计的效果，X或Y精子分离纯度均没有达到80％以上。
遗传学分离法涉及到小鼠17号染色体上T位点发生的同源染色体传输失真比率理论。根据这一理论，小鼠T位点上携带有能使精子尾巴致伤的畸形因子，同时也携带有调控畸形因子的Tcr因子；含有T位点的雄性小鼠往往能将T染色体传递给子代，这样，T型精子就会在精子发生过程中致伤那些不含有Tcr因子的野生型精子，而其自身仍保持受精能力。理论上，这项技术的前景十分诱人，它可能在任何动物身上建立这一染色体模型进而源源不断得到预知性别的后代。但是，该技术操作起来将十分复杂，生产每一个转基因动物的价格也十分昂贵，且该技术在非鼠科动物上尚未取得成功。
流式细胞仪分离法是利用流式细胞分离仪分离哺乳动物X精子和Y精子的性别控制技术，其根据哺乳动物X精子的DNA含量比Y精子多的原理，利用特异性荧光染料将精子的DNA染色，然后通过流式细胞仪将X精子和Y精子分离开，目前，流式细胞仪精子分离技术已经成为迄今最科学、最可靠、最高效的性别控制方法。但此技术成本高，必须在技术上降低成本。
因此，当前急需发展新型的分离X精子和Y精子的方法，以克服现有分离方法的不足之处。
发明内容
为了克服现有技术中存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种基于核酸适体分离精子细胞群的方法，以解决人类X精子和Y精子分离困难的问题。
为实现上述技术目的，本发明提供了一种用于分离精子细胞群的核酸适体，所述核酸适体为X和/或Y染色体适体，其中：
所述X染色体适体源于人类X染色体着丝粒alpha卫星序列；
所述Y染色体适体源于人类Y染色体的长臂末端的卫星III序列。
优选地，所述X染色体适体为
SEQ ID NO:1 5’-GTTCAGCTCTGTGAGTGAAA-3’；
优选地，所述Y染色体适体为
SEQ ID NO:2 5’-TCCATTCGATTCCATTTTTTTCGAGAA-3’。
本发明还提供了一种基于核酸适体分离精子细胞群的方法，所述方法包括使用X染色体适体和/或Y染色体适体分离精子。
进一步优选地，所述方法包括以下步骤：
(i)选择人类X和/或Y染色体序列，筛选出X和/或Y染色体适体；
其中，所述X染色体适体源于人类X染色体着丝粒alpha卫星序列，所述Y染色体适体源于人类Y染色体的长臂末端的卫星III序列；
(ii)将所获得X和/或Y染色体适体与待分离的精子的PBS溶液共培养；
(iii)通过洗涤，分选出人X精子或Y精子。
优选地，X染色体适体为5’-GTTCAGCTCTGTGAGTGAAA-3’。
优选地，Y染色体适体为
5’-TCCATTCGATTCCATTTTTTTCGAGAA-3’。
进一步优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)选择人类X和/或Y染色体序列，筛选出X和/或Y染色体适体；
(2)用链霉亲和素包被培养板或磁性微球；优选地，在4℃下温育过夜；
(3)用含有0.05％体积分数的Tween-20的磷酸盐缓冲液洗涤步骤(2)获得的链霉亲和素包被的培养板或磁性微球；优选地，洗涤2-5次；
(4)将生物素标记的X或Y染色体适体加入步骤(3)获得的洗涤后的包被的培养板或磁性微球中温育；优选地，在37℃下温育2-6小时，优选地，温育4小时；
(5)用磷酸盐缓冲液洗涤步骤(4)获得的温育后的培养板或磁性微球；
(6)向步骤(5)洗涤后的培养板或磁性微球加入含有待分离的精子的PBS溶液温育；优选地，在37℃下温育1-18小时；
(7)取出培养板或磁性分离磁球，洗涤培养板或磁性微球以弃去未吸附的精子，分选出人X精子和/或Y精子。
在倒置显微镜下观察精子附着情况，结果发现，X或Y染色体适体能够结合在细胞群中具有性别特异性的基因序列，即X染色体适体能够吸附X精子，Y染色体适体能够吸附Y精子。
进一步优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)选择人类X和/或Y染色体序列，筛选出X和/或Y染色体适体；
(2)将步骤(1)获得X或Y染色体适体进行荧光标记；优选地，用cy-3进行标记；
(3)加入含有待分离的精子的PBS溶液温育后用磷酸盐缓冲液洗涤；优选地，在37℃下温育1-18小时；优选地，洗涤2-5次，更优选地，洗涤3次；
(4)通过流式细胞仪进行细胞筛选。
其中，步骤(4)所述的实验结果为cy-3标记的X或Y染色体适体可与待分离的X或Y精子特异性结合，从而显强烈荧光。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过采用引物原位标记技术，利用荧光标记的适体对目标人类精子进行标记，适体部分能够结合在群体的一部分中具有性别特异性基因序列，然后将标记的精子细胞与未标记的精子细胞分离，从而实现对人X精子和Y精子进行分离，得到X精子或Y精子。
(2)本发明基于核酸适体对精子进行标记筛选，对精子不会造成损失，可在短时间内大批量进行精子分离筛选。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1所示为本发明实施例2的流式细胞图。
图2所示为本发明实施例2的结合X探针的荧光图。
图3所示为本发明实施方4的流式细胞图。
图4所示为本发明实施例4的结合Y探针的荧光图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。
实施例1采用生物素-链霉亲和素固定X染色体适体分离人类X精子
采用生物素-链霉亲和素固定X染色体适体分离人类X精子的方法包括以下步骤：
(1)选择人类X染色体序列，与人类全基因组序列比对并验证标记适体序列的有效性和特异性，筛选出X染色体适体
SEQ ID NO:1 5’-GTTCAGCTCTGTGAGTGAAA-3’；
(2)用链霉亲和素包被12孔细胞培养板，在4℃温育过夜；
(3)用含有0.05％体积分数的Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS-T)将步骤(2)获得的链霉亲和素包被的培养板洗涤3次，并分成实验组和对照组；
(4)在实验组中，将1nmol生物素标记的X染色体适体加入步骤(3)获得的洗涤后的包被的培养板中，在37℃下温育4小时；在对照组中，将1nmol生物素标记的随机序列加入步骤(3)获得的洗涤后的包被的培养板中并温育；优选地，在37℃下温育4小时；
(5)用磷酸盐缓冲液洗涤步骤(4)获得的两组温育后的培养板；
(6)加入含有待分离的精子的PBS溶液，在37℃下温育18小时，同时轻微摇动；
(7)取出两组培养板并洗涤弃去未吸附的精子，分选出人X精子。
在倒置显微镜下观察精子附着情况。实验结果如表1所示。
表1X精子附着数目
分组 附着细胞数目
实验组 287.7±10.1
对照组 8.9±7.3
由表1可知，实验组中X精子的附着数目明显多于对照组，因此，说明X染色体适体能够结合在细胞群中具有性别特异性的基因序列，即X染色体适体能够吸附X精子，可用于分选人X精子。
实施例2采用流式细胞分选法分离人类X精子
采用流式细胞分选法分离人类X精子的方法包括以下步骤：
(1)选择人类X染色体序列，与人类全基因组序列比对并验证标记适体序列的有效性和特异性，筛选出X染色体适体5’-GTTCAGCTCTGTGAGTGAAA-3’；
(2)将步骤(1)获得的X染色体适体用cy-3进行标记；
(3)将含有约1亿个精子的10mL PBS与4nmol步骤(2)获得的cy-3标记的X染色体适体在37℃下温育1小时，然后洗涤三次；
(4)利用流式细胞仪进行细胞筛选，分选出人X精子。
实验结果见表2、图1和2。图1为流式细胞图。图2为结合X探针的荧光图。由表2、图1和2可以看出，cy-3标记的X染色体适体可与人的X精子结合，从而显强烈荧光，说明本发明的X染色体适体可捕获人的X精子，可用于分选人X精子。
表2样本1统计表格
实施例3采用生物素-链霉亲和素固定Y染色体适体磁性分离人类Y精子
采用生物素-链霉亲和素固定Y染色体适体磁性分离人类Y精子的方法包括以下步骤：
(1)选择人类Y染色体序列，与人类全基因组序列比对并验证标记适体序列的有效性和特异性，筛选出Y染色体适体
SEQ ID NO:2 5’-TCCATTCGATTCCATTTTTTTCGAGAA-3’；
(2)用链霉亲和素包被磁性微球，在4℃下温育过夜；
(3)用含有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液将步骤(2)获得的磁性微球洗涤3次，并分成实验组和对照组；
(4)在实验组中，将1nmol生物素标记的Y染色体适体加入步骤(3)获得的洗涤后的包被的磁性微球中，在37℃下温育4小时；在对照组中，将1nmol生物素标记的随机序列加入步骤(3)获得的洗涤后的包被的磁性微球中，在37℃下温育4小时；
(5)用磷酸盐缓冲液溶液洗涤步骤(4)获得的两组温育后的磁性微球；
(6)分别加入含有待分离的精子的PBS溶液，在37℃下温育12小时，同时轻微摇动；
(7)通过磁性分离磁球，洗涤磁性微球弃去未吸附的精子，分选出人Y精子。
在倒置显微镜下观察精子附着情况。实验结果如表2所示。
表3 Y精子附着数目
分组 附着细胞数目
实验组 374.4±9.7
对照组 7.8±5.6
由表3可知，实验组中Y精子的附着数目明显多于对照组，因此，说明Y染色体适体能够结合在细胞群中具有性别特异性的基因序列，即Y染色体适体能够吸附Y精子，可用于分选人Y精子。
实施例4采用流式细胞分选法分离人类Y精子
采用流式细胞分选法分离人类Y精子的方法包括以下步骤：
(1)选择人类Y染色体序列，与人类全基因组序列比对并验证标记适体序列的有效性和特异性，筛选出Y染色体适体5’-TCCATTCGATTCCATTTTTTTCGAGAA-3’；
(2)将步骤(1)获得的Y染色体的适体用cy-3进行标记；
(3)将含有约1亿个精子的10mL PBS与4nmol步骤(2)获得的cy-3标记的Y染色体适体在37℃下温育1小时，然后洗涤三次；
(4)利用流式细胞仪进行细胞筛选，分选出人Y精子。
实验结果见表4、图3和4。图3为流式细胞图。图4为结合Y探针的荧光图。由表4、图3和4可以看出，cy-3标记的Y染色体适体可与人的Y精子结合，从而显强烈荧光，说明本发明的Y染色体适体可捕获人的Y精子，可用于分选人Y精子。
表4样本2统计表格
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 多能干细胞再生医学科技（广州）有限公司
<120> 用于分离精子细胞群的核酸适体及方法
<130> DIC18110077
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttcagctct gtgagtgaaa 20
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccattcgat tccatttttt tcgagaa 27

Claims (7)

1.一种用于分离精子细胞群的核酸适体，所述核酸适体为X和/或Y染色体适体，其中：
所述X染色体适体源于人类X染色体着丝粒alpha卫星序列；
所述Y染色体适体源于人类Y染色体的长臂末端的卫星III序列。
2.根据权利要求1所述的核酸适体，其中，所述X染色体适体为5’-GTTCAGCTCTGTGAGTGAAA-3’；优选地，所述Y染色体适体为5’-TCCATTCGATTCCATTTTTTTCGAGAA-3’。
3.一种基于核酸适体分离精子细胞群的方法，其特征在于，所述方法使用X染色体适体和/或Y染色体适体分离精子，所述方法包括以下步骤：
(i)选择人类X和/或Y染色体序列，筛选出X和/或Y染色体适体；
其中，所述X染色体适体源于人类X染色体着丝粒alpha卫星序列，所述Y染色体适体源于人类Y染色体的长臂末端的卫星III序列；
(ii)将所获得X和/或Y染色体适体与待分离的精子的PBS溶液共培养；
(iii)通过洗涤，分选出人X精子或Y精子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述X染色体适体为5’-GTTCAGCTCTGTGAGTGAAA-3’。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Y染色体适体为5’-TCCATTCGATTCCATTTTTTTCGAGAA-3’。
6.如权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)选择人类X和/或Y染色体序列，筛选出X和/或Y染色体适体；
(2)用链霉亲和素包被培养板或磁性微球；优选地，在4℃下温育过夜；
(3)用含有0.05％体积分数的Tween-20的磷酸盐缓冲液洗涤步骤(2)获得的链霉亲和素包被的培养板或磁性微球；优选地，洗涤2-5次；
(4)将生物素标记的X或Y染色体适体加入步骤(3)获得的洗涤后的包被的培养板或磁性微球中温育；优选地，在37℃下温育2-6小时，优选地，温育4小时；
(5)用磷酸盐缓冲液洗涤步骤(4)获得的温育后的培养板或磁性微球；
(6)向步骤(5)洗涤后的培养板或磁性微球加入含有待分离的精子的PBS溶液温育；优选地，在37℃下温育1-18小时；
(7)取出培养板或磁性分离磁球，洗涤培养板或磁性微球以弃去未吸附的精子，分选出人X精子和/或Y精子。
7.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)选择人类X和/或Y染色体序列，筛选出X和/或Y染色体适体；
(2)将步骤(1)获得X和/或Y染色体适体进行荧光标记；优选地，用cy-3进行标记；
(3)加入含有待分离的精子的PBS溶液温育后用磷酸盐缓冲液洗涤；优选地，在37℃下温育1-18小时；优选地，洗涤2-5次，更优选地，洗涤3次；
(4)通过流式细胞仪进行细胞筛选，分选出人X精子或Y精子。
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