KR101032335B1 - 포유동물 정소로부터 생식선 줄기세포를 수득하는 방법 - Google Patents

포유동물 정소로부터 생식선 줄기세포를 수득하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유동물의 정소로부터 생식선 줄기세포를 수득하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 정소를 수득하여 복합효소처리함으로써 단일 세포군을 분리하고, 이를 다시 농도구배가 다른 퍼콜용액을 이용하여 세포를 회수한 뒤, 세포외기질물질 (extracellular matrix)을 처리한 배양접시에서 배양하여 부유세포를 회수함으로써, 고노사이트 (gonocyte)를 효율적으로 회수하고 순수도를 증진하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하여 생식선 줄기세포를 효율적으로 회수하여 순수도를 획기적으로 증진시킬 뿐만 아니라, 이를 이용하여 유용 가축의 생식선 줄기세포를 대량으로 확보하고 노화된 우수종모돈 등에서도 순수한 정원줄기세포를 생산할 수 있으며 또한 유용 유전자를 도입하거나 특정 유전자를 적중시킨 형질전환동물을 제작하는 데 널리 사용될 수 있다.
정소 생식선줄기세포, 효소 처리, 퍼콜 (Percoll) 용액, 세포외 기질물질 첨가, 고노사이트 (gonocyte), 순수도

Description

포유동물 정소로부터 생식선 줄기세포를 수득하는 방법{Method for separating male germ-line stem cells from testes in mammal}
본 발명은 포유동물의 정소로부터 생식선 줄기세포를 수득하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 정소를 수득하여 복합효소처리함으로써 단일 세포군을 분리하고, 이를 다시 농도구배가 다른 퍼콜용액을 이용하여 세포를 회수한 뒤, 세포외기질물질 (extracellular matrix)을 처리한 배양접시에서 배양하여 부유세포를 회수함으로써, 고노사이트 (gonocyte)를 효율적으로 회수하고 순수도를 증진하는 방법에 관한 것이다.
인간을 포함한 포유동물에 있어서 생식세포인 정자는 남성측 유전정보를 다음세대에 전달하는 매개체이다. 따라서 정자를 생산하는 일련의 복합적인 과정을 포함하는 정자형성과정 (spermatogenesis)은 종의 보존과 유전적 다양성에 있어서 필수적인 과정이다. 이러한 정자형성과정은 성체의 세포생산 시스템 중 가장 생산 적인 과정으로서, 인간의 경우 정상 성인 남성이 매일 100 x 106개의 정자를 생산하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 복합적이고 생산적인 정자형성과정에 있어서 정원줄기세포 (spermatogonial stem cells)는 남성의 생애 전반에 걸쳐 정자형성과정을 유지시키는 기본이자 토대를 제공하는 중요한 세포이다. 정원줄기세포는 여러 성체 줄기세포들이 지닌 특성과 같이 자가-증식 (self-renewal) 능력과 분화 (differentiation) 능력을 지니고 있다. 정자형성과정의 첫 단계는 최종적으로 정자로 분화되는 다양한 단계의 분화된 딸세포 (daughter progeny)를 생산할 수 있는 정원줄기세포의 분화기작 결정 (fate decision)으로부터 시작된다. 비록 현재까지 단일 정원세포 (single spermatogonia; As spermatogonia)군 중 정원줄기세포가 존재한다고 알려져 있지만, 아직까지 정확히 정원줄기세포를 구분할 수 있는 형태학적인 기준이나 마커로 활용될 수 있는 생화학적 혹은 분자생물학적 특성이 명확히 밝혀져 있지 않은 실정이다. 따라서 과거 여러 해 동안 정원줄기세포의 생물학적인 특성에 관한 연구들은 정원줄기세포를 구분하고 연구할 수 있는 분석기법이 개발되지 못한 관계로 형태학적인 관찰에 의지한 이론적인 지식에 의존되고 있었다.
1994년 브린스터 (Brinster; Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1994, 22;91(24): 11303-7) 연구팀은 생쥐 정소세포의 이식기법을 개발하여 생쥐의 정소에 정원줄기세포가 존재하는 것을 실제로 입증하고, 동시에 정원줄기세포의 기능적 특성을 직접적으로 연구할 수 있는 전기를 마련하였다. 이후 정소세포 및 정원줄기세포 이식기법은 정원줄기세포의 생물학적인 특성과 활용법 개발에 있어서 필수적이고 가 장 핵심적인 기술로 사용되고 있다.
그러나 동물 종에 따라 다소 차이는 있지만, 성체의 경우 정소 내에 극히 적은 수의 정원줄기세포가 존재하기 때문에 정원줄기세포의 특성 연구 및 활용법 개발에 많은 어려움이 있는 실정이다. 실제로 성체 생쥐의 경우 정소세포 3,333개당 1개, 성체 랫트의 경우 정소세포 500개당 1개의 정원줄기세포가 존재하고, 다른 포유류의 경우에는 현재까지 정확한 보고가 없다. 이와 같은 어려움을 극복하기 위한 방법으로 정원줄기세포를 함유하는 정소 세포를 대상으로 다양한 생물학적 혹은 면역 및 분자생물학적 방법을 이용하여 정원줄기세포의 순수도를 증진시키기 위한 연구들이 진행되고 있다. 현재까지 정원줄기세포의 순수도 증진 기술 개발은 실험동물인 생쥐나 랫트를 대상으로 진행되어 왔기 때문에 돼지와 소와 같은 유용 가축을 대상으로 실시한 연구는 극히 부진한 실정이다. 따라서 유용 가축을 대상으로 정원줄기세포의 특성연구나 활용 기술을 개발하기 위해서는 이들 가축의 정소로부터 효율적으로 정원줄기세포를 분리하고 확보하는 기술 개발이 선행되어야 한다.
포유동물의 발생에 있어서 생식선줄기세포 (germ-line stem cells)는 배아의 외배엽 (embryonic ectoderm)으로부터 생성되는 원시생식세포 (primodial germ cells; PGCs)로 구별될 수 있다. 태아 (fetus) 발생과정 중 PGCs는 세포분열 과정을 통하여 증식되면서 생식선융기부(genital ridge)로 이동한다. 여성에 있어서는 PGCs가 여성 생식세포인 난자 (oocytes)를 형성하고 이후 분열은 중지되며 성숙된 난자를 생성하기 위한 감수분열에 돌입된다.
반면, 남성에 있어서는 PGCs가 성삭 (sex cord)으로 둘러싸이게 되면서 gonocyte로 분화되고 출생 시까지 세포분열이 중지된 상태로 유지된다. 따라서 gonocyte는 남성생식선발생 (male germ-line development)에 있어서 최초로 남성 생식선줄기세포 (germ-line stem cells)로 분화된 세포로 이해되고 있다. 신생자 (neonate)의 정소 내에서 gonocyte는 유일한 남성생식선줄기세포로서 출생 후 세포분열을 다시 시작하면서 세포수가 증가되고 일부는 정소내 세정관 (seminiferous tubule)의 기저부로 이동하여 정원줄기세포로 분화되면서 정자형성과정을 시작하게 된다. 남성측에 있어서 최초의 생식선줄기세포인 gonocyte는 정원줄기세포로 분화되기 전까지 세정관의 중앙부위에 위치하게 되며 형태학적으로 독특한 특이성을 지니고 있다. 이러한 특이성은 신생자 정소에 존재하는 여러 다른 종류의 세포들과 비교하여 gonocyte는 크기가 다소 크며 (직경 12~15 um), 세포질의 복잡성 (complexity) 정도가 낮고 구형의 핵이 두드러지게 구분되며, 경우에 따라 세포막이 위족형태 (pseudopod)를 이루는 형태학적인 독특한 특징으로 대별된다. 반면 gonocyte로부터 분화된 정원줄기세포는 상기의 gonocyte와 같은 형태학적으로 두드러진 특징을 상실하게 되기 때문에 형태학적으로 정원줄기세포를 다양한 종류의 정소세포들과 구분하는 것은 불가능하게 된다.
따라서 생식선줄기세포로서 형태학적으로 구분이 가능한 특징을 지닌 gonocyte는 생식선줄기세포를 연구하고 활용기법을 개발하기 위한 선결조건인 회수 및 순수도 증진에 관한 기법을 개발하는 데 있어서 유용한 모델로 사용될 수 있는 큰 장점을 지닌다. 이에 본 발명자들은 유용 가축으로부터 생식선 줄기세포를 효과적으로 회수하는 방법을 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 동물 정소로부터 생식선줄기세포를 효율적으로 회수하고 순수도를 증진시킬 수 있는 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 유용 가축의 생식선 줄기세포를 대량으로 확보하고 노화된 우수종모돈 등에서도 순수한 정원줄기세포를 생산할 수 있으며 또한 유용 유전자를 도입하거나 특정 유전자를 적중시킨 형질전환동물을 제작하도록 하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 먼저, 생식선줄기세포 중 현미경적인 검경을 통하여 형태학적으로 구분이 가능한 gonocyte의 독특한 특징을 먼저 확인하고, 유용가축으로 돼지를 대상 동물로 선정하여 실험하였다. 그 결과, 본 발명에서는 신생돈 돼지로부터 정소를 수득하여 복합효소처리함으로써 단일 세포군을 분리하고, 이를 다시 농도구배가 다른 퍼콜용액을 이용하여 세포를 회수한 뒤, 세포외기질물질 (extracellular matrix)을 처리한 배양접시에서 배양하여 부유세포를 회수함으로써, gonocyte를 효율적으로 회수하고 순수도를 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 (a) 포유동물의 정소를 수득하는 단계; (b) 콜라게나제 (collagenase), 하이아루로니다제 (hyaluronidase), 트립신 (trypsin), Dnase I 또는 이의 혼합물을 상기 수득한 정소의 조직에 처리함으로써 정소조직 단일 세포군을 분리하는 단계; 및 (c) 불연속 농도 구배의 퍼콜 (Percoll) 용액에 상기 (b)단계에서 분리된 세포군을 주입하고 원심분리하여 퍼콜 경계면에서 세포를 회수하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 회수된 세포를 세포외 기질물질 (extracellular matrix, ECM)이 피복된 배양접시에서 배양하고, 부유세포를 회수하는 단계;를 포함하여 이루어지는 고노사이트 (gonocyte)의 수득방법.에 관한 것이다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인 것이 바람직하며, 특히 상기 돼지는 생후 3 내지 60일령의 신생돼지인 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 생후 3일 내지 16일령의 신생돼지를 사용하였다.
또한 상기 (b) 단계의 분리된 단일세포군은 다음단계를 수행하기 전에 10% 우태아 혈청이 형성된 DMEM 배양액에서 보관될 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 (c)단계의 퍼콜용액은 10% 내지 60% 농도의 퍼콜용액 중에서, 농도차이가 10% 이상이고 각각 농도가 다른 2가지 퍼콜용액의 2중층 퍼콜컬럼인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 40% 퍼콜용액(100ml 당 퍼콜 원액 40ml, 10 x DPBS 10ml, 우태아혈청 1ml, 복합항생제 0.5ml, 초순수 증류수 48.5ml 및 DNAse I 5mg 혼합)과 20%의 퍼콜용액(100ml 당 퍼콜 원액 20ml, 10 x DPBS 10ml, 우태아혈청 1ml, 복합항생제 0.5ml, 초순수 증류수 68.5ml 및 DNAse I 5mg 혼합)의 2중층 퍼콜컬럼을 사용하여, 20%와 40%의 경계면에서 생식선줄기세포가 포함된 세포군을 회수할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 Percoll층을 이용한 분리에 있어서 20%와 40%의 경계면에서 회수된 세포군에서는 gonocyte의 비율이 5±0.4%이었고 gonoctye의 회수율은 93±1.7%이었다. 이외 다른 모든 층에서는 gonocyte가 거의 확인되지 않았으며, 또한 퍼콜층을 이용한 세포분리를 통하여 정소로부터 단일세포군을 회수하는 과정에서 생성된 세포 찌꺼기들과 정소로부터 유래된 여러 혈액세포들을 깨끗이 제거할 수 있는 효과를 얻을 수 있었다(도1, 2 참고). 바람직하게는 상기 퍼콜층에 의한 이용한 세포군의 분리를 위해 퍼콜 컬럼에 주입되는 세포군은 세포수가 10 x 106/ml 의 농도인 것으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 DMEM 배지를 이용하여 상기 농도로 조정하였다.
또한 본 발명에 사용되는, 상기 (d)단계의 세포외 기질물질은 피브로넥틴 (fibronectin), 콜라겐 (collegen), 라미닌 (laminin) 및 젤라틴 (gelatin) 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 세포외 기질물질 피복된 배양접시에 배양되도록 하는, 상기 (c)단계에서 회수된 세포는 10 x 106/ml 의 농도로 조정될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 젤라틴 피복 배양접시에서 3 내지 7시간 또는 10 내지 14시간 배양하며, 상기 피브로넥틴 또는 콜라겐 피복 배양접시에서는 10 내지 30분간 배양한다. 라미닌과 젤라틴을 병행처리할 수 있는데, 이 경우에는 라미닌 피복 배양접시에서 배양 후 부유세포를 회수하여 젤라틴 피복 배양접시에서 배양하여 부유세포를 회수할 수 있다. 바람직하게는 상기 라미닌 피복 배양접시에서 10 내지 30분간 배양하고, 상기 젤라틴 피복 배양접시에서는 10 내지 14시간 배양할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 각각의 ECM들이 피복된 배양접시를 이용한 gonoctye의 회수에 있어서 각각의 처리 후 배양접시 바닥에 세포들의 부착 여부에 따라 두 가지 형태의 세포군으로 나누어 세포들을 분리할 수 있었고, 모든 처리에서 gonocyte는 ECM들이 피복된 배양접시 바닥에 부착되지 않고 떠 있는 상태로 회수하였다. 각각의 처리에 따라 부유세포의 세포군 중 gonocyte의 비율은 fibronectin, collagen, laminin, gelatin(12시간 처리) 각각에서 6±0.5%, 9±1.3%, 25±2.3%, 53±1.6%이었으며, gelatin(12시간 처리) 처리에서 가장 높은 gonoctye의 순수도를 나타내었고, laminin 처리에 있어서도 fibronectin과 collagen 처리와 비교하여 통계학적으로 유의하게 높았음을 확인하였다. 뿐만아니라, 각각의 처리에 따른 gonocyte의 회수율은 83~93%로 모든 처리에서 처리 간 통계학적으로 유의한 차이가 없는 높은 회수율을 나타냄을 확인하였다(도1, 2).
상기 본 발명의 생식선줄기세포 (gonocyte)의 수득방법에 의하여 순수도가 극대화된 생식선 줄기세포를 손쉽게 회수 및 확보할 수 있다. 특히 본 발명의 수득방법에 따라, 질병이나 노화 등에 의해 정액채취가 불가능한 우수 종모돈의 정소로부터 생식선 줄기세포를 수득하여, 젊은 수용체 돼지의 정소에 이식하여 이식된 종 모돈의 생식선줄기세포로부터 유래한 정자를 생산할 수 있고, 형질전환동물의 생산 등과 같은 적극적인 활용법으로 널리 응용될 수 있다.
따라서 본 발명의 제 2 견지에 의하면,
본 발명은 (a) 포유동물의 정소를 수득하고, 상기 정소조직에 효소처리하여 단일세포군으로 분리하고, 상기 단일세포군으로부터 농도구배가 다른 퍼콜용액을 이용하여 세포를 회수한 뒤, 세포외 기질물질을 처리한 배양접시에서 배양하여 부유세포를 회수함으로써 생식선줄기세포 중 고노사이트 (gonocyte)를 수득하는 단계; (b) 상기 수득된 고노사이트에 외래 유전자를 도입 또는 적중시키는 단계; (c) 상기 고노사이트를 수용체 동물의 정소에 이식하는 단계; 및 (d) 상기 수용체 동물의 자손을 얻어 형질전환 포유동물을 생산하는 단계를 포함하는 형질전환 포유동물의 생산방법을 제공한다. 상기 포유동물은 돼지인 것이 바람직하다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 수득방법을 따르면, 순수도가 극대화된 생식선줄기세포를 손쉽게 회수하여 확보할 수 있기 때문에, 생식선줄기세포의 마커 개발과 생물학적 특성 및 활성도 연구 분야뿐만 아니라 형질전환동물의 생산 등과 같은 적극적인 활용법으로 널리 응용될 수 있다. 또한 질병이나 노화 등으로 정액 채취가 불가능한 우수 종모돈의 정소로부터 생식선줄기세포인 정원줄기세포를 채취하고 젊은 수여자 정소에 이식하여 인공수정 등에 유용한 이식된 종모돈의 정원줄기세포 유래 정자를 생산할 수 있으므로, 우수 종모돈의 활용도를 증진시킬 수 있는 기술 개발이 가능하다. 또한 우수 종모돈을 선발하는데 소요되는 기간과 경비를 절감하는 경제적인 효과도 기대할 수 있다. 나아가, 생식선줄기세포에 유용 유전자를 도입 혹은 적중한 후 수여자 정소에 이식하고 유전자가 도입 혹은 적중된 정자를 생산하여 이를 이용한 형질전환동물을 개발하는 획기적인 신기술도 가능하여 산업적 파급 효과가 크다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1. 신생돈 정소로부터 gonocyte의 회수>
본 발명의 모든 실시예들은 실험의 정확성을 기하기 위하여 4번 반복하여 실시되었다.
(1) 본 발명에서는 생식선줄기세포의 효율적인 회수와 순수도 증진 기법을 개발하는데 있어서, 생식선줄기세포 중 현미경적인 검경을 통하여 형태학적으로 구분이 가능한 gonocyte의 독특한 특징을 먼저 조사하였다. 구체적으로, gonocyte는 크기가 직경 12 내지 15 μm 범위이고 세포질의 복잡성 (complexity) 정도는 낮으며 구형의 핵이 두드러지게 구분되고 경우에 따라 세포막이 위족 형태 (pseudopod)를 나타내는 점을 확인하여 향후 gonocyte 기술을 개발하는 대상으로 설정하였다. 또한, 유용가축으로 돼지를 대상 동물로 선정하였다.
(2) 생후 3 내지 16일령의 신생 돼지로부터 외과적인 방법으로 정소를 적출하고 4℃ 세포배양액이 담긴 용기에 넣어 실험실로 운반하였다. 그 다음 정소의 백막을 제거하고 정소조직을 수술용 가위와 메스, 핀셋 등을 이용하여 잘게 자른 후 콜라게나제 (collagenase), 하이아루로니다제 (hyaluronidase), 트립신 (trypsin) 및 Dnase I 등의 효소들을 복합처리하는 방법으로 정소로부터 gonocyte가 포함된 단일세포들을 분리하였다. 분리된 단일 세포들은 다음 단계의 처리 전까지 10% 우태아 혈청과 복합항생제가 첨가된 DMEM 배양액에 넣어 4℃에 보관하였다.
그 결과 신생돈 정소로부터 회수된 최초 단일세포군에서는 gonocyte의 비율이 3±0.2% (평균±표준오차)인 것으로 측정되었다.
<실시예 2. 돼지 정소로부터 회수한 단일세포로부터 gonocyte의 분리>
상기 실시예 1에서 기술한 방법으로 회수한 단일세포군을 대상으로 gonocyte의 순수도가 증진된 세포군을 분리하였다.
(1) 등장 퍼콜 ( iso - osmotic Percoll ) 용액의 제조
20% 퍼콜 용액 (총 100ml 당 퍼콜 원액 20ml, 10 x DPBS 10ml, 우태아혈청 1ml, 복합항생제 0.5ml, 초순수 증류수 68.5ml, DNAse I 5mg을 혼합함)과 40% 퍼콜 용액 (총 100ml 당 퍼콜 원액 40ml, 10 x DPBS 10ml, 우태아혈청 1ml, 복합항생제 0.5ml, 초순수 증류수 48.5ml, DNAse I 5mg을 혼합함)을 제조하였다.
(2) 불연속 농도 구배의 퍼콜 2중층을 이용한 gonocyte 의 회수
상기 (1) 과정에서 제조한 각각의 등장 퍼콜 용액 (20% 및 40%)을 1.5ml씩 40% 퍼콜 용액부터 20% 퍼콜 용액의 순서로 15ml 튜브 (conocal tube)에 넣고 2중층 퍼콜 컬럼을 준비하였다. 상기 실시예 1에서 분리된 정소세포를 DMEM 배지를 사용하여 세포수가 10 x 106/ml 농도로 조정한 후 2ml의 세포부유액을 2중층 퍼콜 컬럼에 주입하였다. 그 다음 튜브를 600 G에서 10분간 원심분리하였고 이후 각각의 퍼콜 층 경계면과 튜브 최하위에 위치한 세포들을 섞이지 않게 나누어 회수하였다. 각각에서 회수한 세포군들을 대상으로 gonocyte의 함유 정도를 분석하였다.
그 결과, 퍼콜 층을 이용한 분리 시 20%와 40%의 경계면에서 회수된 세포군에서는 gonocyte의 비율이 5±0.4%이었으며 gonocyte의 회수율은 93±1.7%이었다. 이외 다른 모든 층에서는 gonocyte가 거의 확인되지 않았다. 또한 퍼콜층을 이용한 세포분리를 통하여 정소로부터 단일세포군을 회수하는 과정에서 생성된 세포 찌꺼기들과 정소로부터 유래된 여러 혈액세포들을 깨끗이 제거할 수 있는 효과를 얻을 수 있었다 (도 1 및 도 2 참조).
구체적으로, 단일 세포군 부유액에 포함되어 있던 세포 찌꺼기들은 거의 모 두 퍼콜 20%층의 상부에 위치하였고 혈액세포들은 퍼콜 40%층의 최하위 부위에 위치하였다. 퍼콜층을 이용한 gonocyte의 순수도 증진 효과는 통계학적으로 유의한 상승효과를 보이지 않았지만, 세포 찌꺼기들과 혈액세포를 효과적으로 제거할 수 있는 효과와 높은 gonocyte의 회수율 (93±1.7%)로 인하여 gonocyte의 순수도 증진방법을 개발하는데 있어서는 퍼콜 20%와 40%의 경계면에서 회수된 세포군을 대상으로 하였다.
< 실시예 3. gonocyte 의 순수 정제>
또한, 본 실시예에서는 gonocyte가 신생돈 (neonatal pig) 정소 내 세정관의 중앙부위에 위치한다는 조직학적 관찰에 근거하여, gonocyte가 세포외기질물질 (extracellular matrix; ECM)에 대한 친화력이 없을 것이라는 가설을 세우고, 이러한 가설을 검증하기 위하여 다양한 세포외기질물질 등을 처리하는 실험을 하였다. 세포외 기질물질 (ECM)로는 피브로넥틴 (fibronectin), 콜라겐 타입 Ⅳ (콜라겐), 라미닌 (laminin), 젤라틴 (gelatin) 등을 사용하여 그 효과를 조사하였다.
(1) ECM 이 피복된 배양접시의 준비
피브로넥틴(fibronectin) 콜라겐(collagen) 또는 라미닌(laminin)이 각각 20ug/ml의 농도로 첨가된 DPBS 3ml을 각각의 60-mm 페트리디쉬에 주입한 후 37℃ 배양기에서 5 내지 12 시간 동안 배양하였다. 그 다음 용액을 제거하고 배양접시를 2ml의 DPBS로 3회 세척한 후 비특이적 결합을 방지하기 위하여 0.5mg/ml의 농도로 BSA가 첨가된 DPBS 3ml을 주입한 후 37℃ 배양기에서 1시간동안 전배양하였다. 전배양이 끝나고 2ml의 DPBS로 배양접시를 3회 세척한 후 세포주입 전까지 상온에 보관하였다.
젤라틴(gelatin)의 경우는 젤라틴 농도가 0.1%로 조정된 초순수 증류수 3ml을 피트리디쉬에 주입한 다음 상온에서 3 내지 5시간 동안 배양하였고 2ml의 DPBS로 배양접시를 3회 세척하고 세포주입 전까지 상온에 보관하였다.
(2) ECM 이 피복된 배양접시를 이용한 세포 회수
상기 실시예 2에서 기술한 바와 같이 20%와 40% 퍼콜 층의 경계면에 위치한 세포들을 분리하여 3ml DMEM 배지에 세포수가 10 x 106/ml 농도가 되도록 조정한 후 각각의 ECM이 피복된 배양접시에 3ml 세포희석액을 주입하고 37℃ CO2 배양기내에서 20분간 배양하였다. 젤라틴 처리의 경우에는 예외적으로 배양시간이 5시간 혹은 12시간이었다. 각각의 반응시간 동안 세포를 배양한 다음 배양접시로부터 세포배양액을 회수하고 2ml PBS 용액으로 배양접시를 각각 5회 세척하여 배양기간 중 바닥에 부착되지 않은 세포들을 회수하였다. 배양접시 바닥에 부착된 세포들을 회수하기 위하여, 트립신(0.25%)-EDTA(1 mM) 용액을 주입하고 5분간 배양한 후 수차례의 강한 피펫팅을 적용하여 바닥에 부착되었던 세포들을 회수하였다. 각각의 처리 후 배양접시에 부착되었던 세포군과 부착되지 않은 세포군을 대상으로 gonocyte 함유 정도를 분석하였다. 그 결과, 각각의 ECM들이 피복된 배양접시를 이용한 gonocyte의 회수에 있어서 각각의 처리 후 배양접시 바닥에 세포들의 부착 여부에 따라 두 가지 형태의 세포군으로 나누어 세포들을 분리할 수 있었다. 모든 처리에서 gonocyte는 ECM들이 피복된 배양접시 바닥에 부착되지 않고 떠 있는 상태로 회수되었으며, 각각의 처리에 따라 떠 있는 상태의 세포군중 gonocyte의 비율은 피브로넥틴 (fibronectin), 콜라겐 (collegen), 라미닌 (laminin), 젤라틴 (12시간 처리) 각각에서 6±0.5%, 9±1.3%, 25±2.3%, 53±1.6%인 것으로 측정되었다. 따라서, 젤라틴 (12시간 처리) 처리에서 가장 높은 gonocyte 순수도를 나타내었으며, 라미닌 처리에 있어서도 피브로넥틴과 콜라겐 처리와 비교하여 통계학적으로 유의하게 높았다. 각각의 처리에 따른 gonocyte의 회수율은 83 내지 93%로 모든 처리에서 처리 간 통계학적으로 유의한 차이가 없는 높은 회수율을 나타내었다 (도 1 및 도 2 참조).
상기 결과를 토대로 gonocyte의 순수도가 가장 높았던 젤라틴 처리에 있어서 배양시간 차에 따른 결과를 비교해본 결과 5시간 배양에서 보다 (26±1.0%) 12시간 배양에서 (53±1.6%) 통계학적으로 유의하게 높은 gonocyte의 순수도를 나타내었다. 또한 라미닌 처리 후 떠 있었던 세포군을 회수하여 젤라틴 처리 (12시간)를 실시하였던 병행 처리군에서 83±2.5%의 높은 gonocyte 순수도를 지닌 세포군을 얻을 수 있었다 (도 3 참조). 각각의 처리에서 gonocyte의 회수율은 69 내지 83%로 통계학적으로 유의한 차이가 없었다 (도 4 참조).
< 실시예 4. 회수된 gonocyte 의 생식선 줄기세포 특이 유전자의 발현 양상 조사>
본 실시예에서는 신생돈 정소로부터 회수되고 순수도가 증진된 gonocyte들이 실제적으로 생식선줄기세포의 특성을 지니고 있는지 여부를 확인하기 위하여, 각각의 처리에서 얻어진 세포군을 대상으로 유전자 발현 양상을 조사하였다. 조사 유전자로는 줄기세포에서 특이 발현되는 것으로 알려진 oct -3/4 유전자와 nanog 유전자를 대상으로 하였고 또한 생식세포에서 특이 발현되는 것으로 알려진 vase 유전자 및 대조군으로서 모든 종류의 세포에서 발현되는 유전자인 gapdh 유전자의 발현 양상을 조사하였다.
먼저 각각의 처리로부터 회수된 세포에서 트리졸 (Trizol), 클로로포름, 에탄올 처리하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA에서 cDNA의 합성을 위하여 키트 (SuprerScript First-strand Kit; Invitrogen, USA)를 이용하였고 제조사에서 제공한 사용법에 따라 cDNA를 합성하였다. 추출된 RNA로부터 합성된 cDNA를 적절한 농도로 희석한 후 Green Mix PCR Kit (Promega, USA)를 이용하여 중합효소연쇄반응 (PCR)을 시행하였다.
PCR에 사용한 각각의 프라이머는 다음과 같다.
Oct 3/4 (PCR 산물:153bp)
: 5’-AACGATCAAGCAGTGACTATTCG-3’(포워드 프라이머, 서열번호 1), 5’-GAGTACAGGGTGGTGAAGTGAGG-3’(리버스 프라이머, 서열번호2),
nanog (PCR 산물: 164bp)
: 5'AATCTTCACCAATGCCTGAG-3’(포워드 프라이머, 서열번호 3), 5’-GGCTGTCCTGAATAAGCAGA-3’(리버스 프라이머, 서열번호4),
vasa (PCR 산물; 165bp)
: 5’-TTGCAGGACGAGATTTGATG-3’(포워드 프라이머, 서열번호 5), 5’-CCAATTCTCGAGTTGGTGT-3’(리버스 프라이머, 서열번호6),
gapdh (PCR 산물: 226bp)
: 5’-AAGTATGACAACTCCCTCAAGAT-3’(포워드 프라이머, 서열번호 7), 5’-TAGAAGCAGGGATGATGTTC-3’(리버스 프라이머, 서열번호8)
PCR 반응에서 아닐링 온도는 Oct 3/4(56℃), nanog(51℃), vasa(52℃), gapdh(49℃)로 설정하였으며, 반응 횟수는 모든 유전자에 대하여 35회로 수행하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR 산물은 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 확인하였다.
그 결과, gonocyte의 순수도가 5%이었던 퍼콜 20%와 40%의 경계면에서 회수된 세포군과 gonocyte의 순수도가 83%이었던 라미닌과 젤라틴(12시간 처리) 병행 처리에서 회수되었던 세포군을 대상으로 유전자 발현을 조사한 결과, 대조군 유전자로 사용되었던 gapdh 유전자의 발현은 두 세포군 모두 유사한 발현 양상을 보였으나 oct -3/4, nanog, vasa 유전자 모두 gonocyte의 순수도가 낮았던 퍼콜 회수군보다 gonocyte의 순수도가 약 17배 정도 높았던 라미닌과 젤라틴 병행 처리군에서 증가된 발현 양상을 나타내었다. 상기 결과로부터 본 발명에 의하여 남성 생식선줄기세포인 gonocyte를 효과적으로 회수하고 순수도를 증진시키는 것을 확인할 수 있었다. (도 6 참고)
본 발명은 바람직한 실시형태를 참고하여 보다 자세하게 설명되었지만, 당업
에 통상의 지식을 가진 자에게 본 명세서의 기술의 도움으로 본 발명의 범주나 정
신에서 벗어나지 않는 범위내에서의 어떤 변화 및 변형이 가능할 수 있음은 명백할
것이다. 따라서 본 발명은 하기의 특허청구범위에 의해서만 제한된다.
본 발명에 의하여 생식선 줄기세포를 효율적으로 회수하여 순수도를 획기적으로 증진시킬 뿐만 아니라, 이를 이용하여 유용 가축의 생식선 줄기세포를 대량으로 확보하고 노화된 우수종모돈 등에서도 순수한 정원줄기세포를 생산할 수 있으며 또한 유용 유전자를 도입하거나 특정 유전자를 적중시킨 형질전환동물을 제작하는 데 널리 사용될 수 있다.
도 1은 신생돼지(3~16일령)의 정소로부터 효소처리 통하여 단일세포군을 회수하고 Percoll 2중층 (20%, 40%)을 이용한 원심분리법과 세포외기질물질이 피복된 배양접시를 이용한 세포회수 후 각각의 처리에서 얻어진 세포군에서 생식선줄기세포인 gonoctye의 함유율(순수도)을 나타낸 것이다.
(단, * 그래프내 삽입그림: 최초 정소로부터 회수된 단일세포군의 사진. 화살표로 표시된 세포가 현미경으로 관찰된 gonocyte; * Initial: 최초 정소로부터 회수된 단일세포군; * Percoll: Percoll 2중층을 이용한 원심분리후 20%와 40%층의 경계면에서 회수된 세포군; * Fibronectin, collagen, laminin, gelatin(12시간 처리): 각각의 세포외기질물질이 피복된 배양접시에 단일세포군을 주입하고 배양한 후 배양접시바닥에 부착되지 않고 떠 있었던 세포군 (각각의 처리를 위한 단일세포군은 Percoll 처리 후 20%와 40%층의 경계면에서 회수된 세포군이었음); * a, b, c, d, e는 각각의 막대 그래프 상부에 표기된 동일한 알파벳은 통계학적으로 유의한 차이가 없었음을 나타냄)
도 2는 도 1에서 각각의 처리에 따른 gonocyte의 회수율을 나타낸 것이다.
(단, * Percoll: initial 세포군 대비 회수율[(Percoll 처리 후 20%와 40%층의 경계면에서 회수된 세포수 x Percoll 처리 후 20%와 40%층의 경계면에서 회수된 세포군의 gonocyte 함유 퍼센트/100) / (Percoll 처리에 사용된 initial 세포수 x initial 세포군의 gonocyte 함유 퍼센트/100) x 100]
* Fibronectin, collagen, laminin, gelatin(12시간 처리): Percoll 처리 후 20%와 40%층의 경계면에서 회수된 세포군 대비 회수율 [(각각의 처리 후 배양접시에서 떠 있었던 세포수 x 떠 있었던 세포군의 gonocyte 함유 퍼센트/100) / (각각의 처리에 사용된 Percoll 처리 후 20%와 40%층의 경계면에서 회수된 세포수 x Percoll 처리 후 20%와 40%층의 경계면에서 회수된 세포군의 gonocyte 함유 퍼센트/100) x 100]
* 모든 처리에서 통계학적으로 유의한 차이가 나타나지 않았음)
도 3은 gelatin 5시간, 12 시간 처리와 laminin과 gelatin(12시간) 병행 처리에 따른 gonocyte의 함유율(순수도)를 나타낸 것이다. (각각의 기본 처리 조건과 결과 예시는 도 1과 동일)
도 4는 도 3에서 각각의 처리에 따른 gonocyte의 회수율을 나타낸 것이다. (결과 예시는 도 2와 동일)
도 5는 본 발명에서 실시되었던 대표적인 기법을 적용한 후 회수된 세포군의 사진을 나타낸 것이다.
(단, * Unselected: 최초 정소로부터 회수된 단일세포군(화살표는 gonocyte를 나타냄, bar: 100 um); * Percoll: Percoll 2중층을 이용한 원심분리후 20%와 40%층의 경계면에서 회수된 세포군(화살표는 gonocyte를 나타냄, bar: 100 um); * Laminin+Geletin: laminin과 gelatin(12시간 처리)의 병행처리(bar: 50 um))
도 6은 Percoll 2중층을 이용한 원심분리후 20%와 40%층의 경계면에서 회수된 세포군과 laminin과 gelatin(12시간 처리)의 병행처리 후 회수된 세포군을 대상으로 실시된 유전자 발현양상을 나타낸 것이다.
(단, * RTase: 분석 대상 유전자; * M: Marker (DNA ladder); * Percoll: Percoll 2중층을 이용한 원심분리후 20%와 40%층의 경계면에서 회수된 세포군; * Laminin+Geletin: laminin과 gelatin(12시간 처리)의 병행처리 후 회수된 세포군; * bp: PCR 산물의 크기)
<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for separating male germ-line stem cells from testes in mammal <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Oct 3/4 <400> 1 aacgatcaag cagtgactat tcg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Oct 3/4 <400> 2 gagtacaggg tggtgaagtg agg 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for nanog <400> 3 aatcttcacc aatgcctgag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for nanog <400> 4 ggctgtcctg aataagcaga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for vasa <400> 5 ttgcaggacg agatttgatg 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for vasa <400> 6 ccaattctcg agttggtgt 19 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for gapdh <400> 7 aagtatgaca actccctcaa gat 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for gapdh <400> 8 tagaagcagg gatgatgttc 20

Claims (12)

  1. (a) 포유동물의 정소를 수득하는 단계;
    (b) 콜라게나제 (collagenase), 하이아루로니다제 (hyaluronidase), 트립신 (trypsin), Dnase I 또는 이의 혼합물을 상기 수득한 정소의 조직에 처리함으로써 정소조직 단일 세포군을 분리하는 단계; 및
    (c) 불연속 농도 구배의 퍼콜 (Percoll) 용액에 상기 (b)단계에서 분리된 세포군을 주입하고 원심분리하여 퍼콜 경계면에서 세포를 회수하는 단계; 및
    (d) 상기 (c)단계에서 회수된 세포를 라미닌 피복 배양접시에서 배양 후 부유세포를 회수하여 젤라틴 피복 배양접시에서 배양하고 부유세포를 회수하는 단계;를 포함하여 이루어지는 고노사이트 (gonocyte)의 수득방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 돼지는 생후 3 내지 60일령의 신생돼지임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 (c)단계의 퍼콜용액은 10% 내지 60% 농도의 퍼콜용액 중에서, 농도차이가 10% 이상이고 각각 농도가 다른 2가지 퍼콜용액의 2중층 퍼콜컬럼임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 2중층 퍼콜컬럼은 40% 퍼콜용액(100ml 당 퍼콜 원액 40ml, 10 x DPBS 10ml, 우태아혈청 1ml, 복합항생제 0.5ml, 초순수 증류수 48.5ml 및 DNAse I 5mg 혼합)과 20%의 퍼콜용액(100ml 당 퍼콜 원액 20ml, 10 x DPBS 10ml, 우태아혈청 1ml, 복합항생제 0.5ml, 초순수 증류수 68.5ml 및 DNAse I 5mg 혼합)의 2중층 퍼콜컬럼임을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 라미닌 피복 배양접시에서 10 내지 30분간 배양하고, 상기 젤라틴 피복 배양접시에서는 10 내지 14시간 배양함을 특징으로 하는 방법.
  11. 다음의 단계를 포함하는 형질전환 포유동물의 생산방법
    (a) 포유동물의 정소를 수득하고, 상기 정소조직에 효소처리하여 단일세포군으로 분리하고, 상기 단일세포군으로부터 농도구배가 다른 퍼콜용액을 이용하여 세포를 회수한 뒤, 라미닌 피복 배양접시에서 배양 후 부유세포를 회수하여 젤라틴 피복 배양접시에서 배양하고 부유세포를 회수함으로써 생식선줄기세포 중 고노사이트 (gonocyte)를 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득된 고노사이트에 외래 유전자를 도입 또는 적중시키는 단계;
    (c) 상기 고노사이트를 수용체 동물의 정소에 이식하는 단계; 및
    (d) 상기 수용체 동물의 자손을 얻어 형질전환 포유동물을 생산하는 단계
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인 것을 특징으로 하는 방법.
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