JP5610424B2 - 分離生殖細胞の移植による生殖細胞系列への分化誘導法における生着能の向上 - Google Patents
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Description
<レイボヴィッツL−15/FBS培養液の調整>
レイボヴィッツ(Leibovitz’s)L−15培地粉末(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)1.374g、HEPES(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)0.598gをDeionized distilled water (Invitrogen Corporation, 15230-162)80mlに溶解した。続いて、10N NaOH及び1N NaOHを用いてpH7.8に調整し、これを89.7mlにメスアップした後に、孔径0.2μmのシリンジ用滅菌フィルター(Dismic-25cs, Advantec, 東京)を用いて濾過滅菌した。更に、2.5mlのサケ血清、10mlのウシ胎児血清(FBS)を加え、最後に50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、50μg/mlアンピシリンの濃度となるように抗生物質を添加した。
水温10℃の流水で屋外飼育されたニジマス雌3年魚、及び屋内飼育された、pvasa pvasa−Gfp遺伝子導入ニジマス雄2年魚より、それぞれ採卵及び採精し、1%NaHCO3浸漬法による媒精を経て、受精卵を作製した。作製した受精卵は屋内飼育し、8〜10ヶ月齢に達した個体を供試魚として実験に用いた。
供試魚(ニジマス)を350ppmの2−フェノキシエタノール(和光純薬工業株式会社)溶液中で麻酔処理を施した後、体表面の水気をふき取り、70%エタノールを入れた容器内で約1分間静置することで無菌化した。続いて、クリーンベンチ内に供試魚を入れ、精巣を外科的に摘出した。このとき、幽門垂および腸管を傷つけないようにすることで、精巣を無菌的に単離した。単離した精巣は、L−15/FBS10%(pH7.8)培養液を200μl入れた48ウェルプレート中で一時保存した。なお、保存用ウェルプレート内の培養液の温度上昇を防ぐために、ウェルプレートはクリーンベンチ内に入れた氷冷剤上で維持した。その後、クリーンベンチ内に実体顕微鏡(SMZ-10: Nikon, Tokyo)を入れ、冷却したPBS(−)を満たした滅菌シャーレ内に単離した精巣を移し、実体顕微鏡下で精巣間膜および精巣間膜に付随する血管を、ピンセットを用いて剥離した。
血管及び結合組織を剥離した精巣5〜20尾分を、1ツ穴血液反応板の上にまとめ、ウェッケルシザース(MB-41,NAPOX, 株式会社夏目製作所)を用いて精巣砕片の状態にした。続いて、0.855 Unitトリプシン/PBS(+)溶液1ml中に精巣片を移し、10℃で約2時間インキュベートした。インキュベート中、精巣砕片の分散を促進するために、30分ごとにピペッティング処理を施した。酵素処理後、細胞懸濁液を15ml tubeに全て移し、スイングローターを用いて10℃、1、000rpmで10分間遠心することで精巣細胞を沈殿させ、ペレットを形成させた。続いて、ペレットを吸わないように注意しながら上清を捨て、L−15/FBS10%(pH7.8)培養液を3ml加えた。なお、酵素溶液を完全に取り除くために、同様の遠心操作によるリンスを2度行った。酵素溶液除去後、L−15/FBS10%(pH7.8)培養液を2ml加え、ピペッティング操作により撹拌した後に、得られた精巣細胞懸濁液を目開き42μmのナイロンメッシュ(NBC Inc, Tokyo)を通すことで、不完全な分散により生じた精巣片を取り除いた。
実験には、ゼラチンで底面をコーティング処理した96ウェルプレート、及び6ウェルプレートを用いた。まず、粉末ゼラチンを0.1%の濃度で蒸留水に溶解した。続いて、クリーンベンチ内で孔径0.2μmのシリンジ用滅菌フィルター(Dismic-25cs, Advantec)を用いて溶液を濾過することで、0.1% ゼラチン溶液を無菌化した。その後、調整した溶液を96ウェルプレート、6ウェルプレートに対し、それぞれ1ウェルあたり100μl、1,000μlずつ加え、30分間以上室温で放置した。最後に溶液を全て取り除き、クリーンベンチ内で完全に乾燥させることでウェルの底面をゼラチンでコーティングした。
精巣の分散(剥離)・採取により得られた精巣細胞懸濁液中の細胞数を、血球算定板を用いて測定した。その後、ゼラチンコーティングした6ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific)の各ウェルに1.5×106細胞/ウェルの細胞密度で播種し、L−15/FBS・サケ血清(pH7.8)培養液を用いて10℃にて培養した。
6ウェルプレートの1ウェルに約1.5×106 細胞播種した精巣細胞を、10℃にて静置培養した。培養下の生殖細胞(精原細胞)の様子は以下のとおりである:
培養し、ウェル底面に接着している生殖細胞を分離、採取した。ウェル底面に接着している生殖細胞を分離、採取するに際し、ウェル底面において、該底面に接着している精巣の体細胞にゆるく接着している精原細胞の解離を促進するために、EDTA溶液で処理を行った。すなわち、該処理は、0.25%EDTA/PBS溶液で処理(5〜10分)を行い、精原細胞の接着を弱め、時々揺らすことにより効果的に遊離させた。遊離後、EDTA溶液を除去し、培養液を加えてピペッティングすることで生殖細胞を選択的に回収することができる。精巣体細胞は、ウェル底面に接着したまま分離することができる。EDTA溶液にて培養下の細胞を処理することにより、90%以上の純度で生殖細胞を回収することができた。
EDTA溶液処理により回収した精原細胞の性状について、以下に示す:図3は、EDTA処理により、短期間培養下から回収する生殖細胞について、EDTA処理前(図3−a)、EDTA処理中(図3−b)、EDTA処理後(図3−c)のウェル底面における顕微鏡の同一視野像を写した写真を示す。EDTA処理前及びEDTA処理中においては、生殖細胞の付着が観察されるが(緑色蛍光像)、EDTA処理後は、生殖細胞の付着を示す緑色蛍光像がほとんどみられない。このことより、0.25%EDTA処理後にピペッティングを行うことにより、培養下の生殖細胞をトリプシンのようなタンパク質分解酵素を使用することなく回収することが可能であることが示される。
実施例1により調製した、ニジマスの未成熟精巣を酵素処理により分散(解離)し、0.25%サケ血清、及び1%ウシ胎児血清等を含むL−15培養液下で5日間培養し、続いて、EDTA溶液による処理により回収したニジマスの生殖細胞を用いて、宿主生殖腺へ導入し、該細胞の宿主生殖腺への生着能について試験した。魚類生殖細胞を用いて、該細胞を宿主生殖腺へ導入し、該細胞の宿主生殖腺における生着能を試験した概念図を、図11及び図12に示す。図11は、魚類精巣をトリプシンのようなタンパク質分解酵素を用いて分散(解離)した状態の生殖細胞を、宿主生殖腺に導入する従来の方法による概念図を、図12は、上記のように魚類精巣をトリプシンのようなタンパク質分解酵素を用いて分散(解離)した後、短期間の培養と、EDTA処理による生殖細胞の回収により、宿主生殖腺への生着能を活性化した本発明の方法による概念図を示す。
実施例1で調製した短期間培養生殖細胞のニジマス初期胚への移植を行った。該生殖細胞のニジマス初期胚への移植は、特許第4300287号公報に開示する「分離始原生殖細胞(生殖細胞)のニジマス初期胚への導入方法」に従った。すなわち、実施例1で調製した、未成熟精巣をトリプシン酵素処理により分散(解離)し、0.25%サケ血清、及び1%ウシ胎児血清等を含むL−15培養液で5日間培養し、続いてEDTA溶液により細胞剥離した約5,000の培養生殖細胞(vasa-Gfp遺伝子導入により、緑色蛍光蛋白質(GFP)で可視化)を孵化稚魚の腹腔内へ移植した。対照として、魚類精巣をトリプシンを用いて分散(解離)した状態の短期間の培養を行わない生殖細胞を用いた。
初期発生段階のニジマス個体の腹腔内腸管膜裏側に移植した生殖細胞は、自発的に未熟生殖腺に向かって移動を開始し、そこで生殖腺内に取り込まれる。移植10日後のニジマス個体の腹腔内腸管膜裏側の生殖腺内の様子を図8に示す。図8−b、8−c、8−dは、本発明の方法によって調製された未成熟精巣をトリプシン酵素処理により分散(解離)後、短期間の培養を行った生殖細胞を移植した場合(培養区)の生殖腺内の様子を、図8−aは、魚類精巣をトリプシンを用いて分散(解離)した状態の短期間の培養を行わない生殖細胞(対照)を移植した場合(培養区)の生殖腺内の様子を示す。写真に示されるように、培養区では、非培養区に比較して多数の生殖細胞が生殖腺内に入っている様子(緑色蛍光発光)が伺える。
実施例1に記載の方法により、クロマグロの精巣をトリプシン処理により解離した後、得られた細胞をコラーゲンコートを施したシャーレ内で短期間培養した。該培養には、l−15培地を基にサケ血清、アデノシ等の添加因子を加えた培養液を用いた。該培養した生殖細胞の回収には0.25%のEDTA溶液で短時間のピペッティング処理を施す方法により、細胞を付着しているシャーレから剥離する方法により回収した。
上記実施例1に記載の方法により、クロマグロの精巣をトリプシン処理により解離した後、得られた細胞をコラーゲンコートを施したシャーレ内で短期間(3日)培養し、EDTA溶液で短時間のピペッティング処理を施す方法により回収した生殖細胞をニベ宿主生殖腺へ移植した。移植後、20日目の段階で、ニベ宿主の生殖腺にクロマグロ由来の精原細胞が生着しているのが確認された(図10−a、10−b)。蛍光を発する細胞は、生殖細胞を示す。ニベの生殖腺内に生着しているクロマグロの生殖細胞が確認される。
Claims (9)
- 魚類由来の分離生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類の腹腔内への移植により宿主魚類個体に移植することからなる分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法において、宿主魚類の腹腔内への移植に用いる魚類由来の分離生殖細胞を、魚類の精巣をタンパク質分解酵素処理により解離した後、解離した細胞を培養容器中において、生殖細胞が培養容器にゆるく接着するまでの短期間培養し、該培養した生殖細胞を分離・採取することによって調製し、該分離・採取した分離生殖細胞を孵化前後の宿主魚類の腹腔内へ移植することにより行なうことを特徴とする生殖細胞の宿主魚類生殖腺への生着能を向上した分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 魚類の精巣をタンパク質分解酵素処理により解離した細胞を、培養容器中において生殖細胞が培養容器にゆるく接着までの短期間培養する期間が、培養開始後、3〜6日の期間であることを特徴とする請求項1記載の宿主魚類生殖腺への生着能を向上した分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 魚類の精巣をタンパク質分解酵素処理により解離した細胞を、培養容器中において精原細胞が培養容器にゆるく接着までの短期間培養する期間が、サケ科魚類では培養開始後、4〜5日の期間であることを特徴とする請求項2記載の宿主魚類生殖腺への生着能を向上した分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 魚類の精巣をタンパク質分解酵素処理により解離した細胞を、培養容器中において生殖細胞が培養容器にゆるく接着までの短期間培養する期間が、マグロ類では培養開始後、3〜6日の期間であることを特徴とする請求項2記載の宿主魚類生殖腺への生着能を向上した分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 魚類の精巣をタンパク質分解酵素処理により解離した細胞の培養容器中における培養を、コラーゲンコート或いはゼラチンコートを施した培養容器内で、レイボヴィッツL−15培地にウシ胎児血清、サケ血清及びアデノシンの1又は2以上を添加した培養液を用いて行なうことを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の宿主魚類生殖腺への生着能を向上した分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 培養した生殖細胞を分離・採取するに際して、生殖細胞と魚類の精巣から分離した精巣体細胞の培養容器への接着力の相違により、生殖細胞を血球系の細胞、精巣体細胞から分離して採取することを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載の宿主魚類生殖腺への生着能を向上した分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 生殖細胞を精巣体細胞から分離して採取するに際し、接着している生殖細胞の細胞剥離を促進するためにEDTA溶液で処理することを特徴とする請求項6記載の宿主魚類生殖腺への生着能を向上した分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 魚類由来の分離生殖細胞が、宿主魚類とは異系統又は異種の魚類由来の生殖細胞であることを特徴とする請求項1〜7のいずれか記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
- 宿主魚類が、サケ科魚類、ニベ、及びサバ科魚類から選択され、異種の魚類がマグロであることを特徴とする請求項8記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
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